專利名稱：同時分離高純度的藻藍蛋白和別藻藍蛋白的方法與應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于保健品、功能食品和生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體的說涉及一種同時分離高純度的藻藍蛋白和別藻藍蛋白的方法與應用。
背景技術(shù)：
進入21世紀，世界范圍內(nèi)形成了開發(fā)海洋湖沼資源的熱潮，海洋藥物的開發(fā)有著巨大的發(fā)展?jié)摿ΑＦ渲?，廣泛、大量存在于藻類藻膽體中的藻膽蛋白，由于其安全無毒、具有多方面的開發(fā)應用價值和較高的生物活性，而引起了不少學者的關(guān)注。藻膽蛋白為一類色素復合蛋白，根據(jù)其吸收光譜性質(zhì)可分為藻藍蛋白(Phycocyanins，PC)、 別藻藍蛋白(Allophycocyanins，APC)、藻紅蛋白(Phycoerythrin, PE)和藻紅藍蛋白 (Phycoerythrocyanin,PEC)。藻膽蛋白不僅可作為天然色素廣泛應用于食品、化妝品、染料等工業(yè)，而且由于其具有強烈熒光所制成的熒光試劑、熒光探針、熒光示蹤物質(zhì)等用于臨床醫(yī)學診斷、免疫化學及生物工程等研究領(lǐng)域中，具有明顯抗氧化、抗炎癥、提高機體免疫力、 促進動物細胞再生、抑致癌細胞的作用等生物活性(Farooq et al, Chem-Biol Interact, 2004，149，1-7 ；Subhashini et al,Biochem Pharmacol, 2004,68 :453_62 ；Chen and Wong, J Agric Food Chem，2008，56，4352-4358)。已有的研究結(jié)果均表明藻膽蛋白具有良好的應用開發(fā)前景。目前，關(guān)于藻膽蛋白的提取工藝研究相對落后，且產(chǎn)物穩(wěn)定性較低，極大的限制了其工業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)展。對于藻膽蛋白的粗提取，細胞破碎方法的選擇是關(guān)鍵步驟。目前國內(nèi)外基本采用采用反復凍融法、超聲波破碎法、勻漿法、物理破碎、酶溶法、化學滲透法和十二烷基苯磺酸鈉裂解法等方法來破碎藻細胞(Santiago-Santos et al, Process Biochem, 2004，39，2047-2052)。其中以反復凍融-超聲破碎聯(lián)用法使用最為廣泛，破碎效果好，可獲得大量的藻膽蛋白粗產(chǎn)品，更適合于規(guī)?；_發(fā)。但要進一步分離純化得到藻藍蛋白和別藻藍蛋白必須通過柱層析等其他方法處理。關(guān)于蛋白沉淀都普遍使用硫酸胺鹽析或冷凍丙酮沉淀。在純化技術(shù)上，目前使用的有離子交換色譜和體積排阻色譜法(Chen and Wong， Phytochemistry，2006，67，2424-2430.)、膨脹床吸附色譜(Niu et al, J Chromatogr B, 2007,850 :267-276.)、疏水性相互作用色譜等。其中，離子交換色譜和體積排阻色譜單獨使用或串聯(lián)使用是常用的也是首選的分離螺旋藻中藻藍蛋白的純化方法，但所需的填料昂貴，且不能一次性分離藻藍蛋白和別藻藍蛋白。近來有研究人員采用雙水相萃取方法多次萃取得到純化的藻藍蛋白(Pail G and Raghavarao, Biochem Eng J，2007，34 :156_164)， 但該技術(shù)目前仍不夠成熟，有待進一步優(yōu)化。專利號為200610171008. X、名稱為“同時制備藻藍蛋白和別藻藍蛋白的方法”的國家發(fā)明專利提供了一種采用羥基磷灰石柱層析法同時制備藻藍蛋白和別藻藍蛋白的方法，但所得產(chǎn)品純度僅為2. 1，無法達到生物醫(yī)藥領(lǐng)域的使用要求。因此，如何快速有效的同時分離高純度藻藍蛋白和別藻藍蛋白成為人們關(guān)注的焦點和努力的方向。目前有研究表明含硒、碲藻藍蛋白在抗氧化、抗腫瘤等生物活性方面的表現(xiàn)優(yōu)于普通藻藍蛋白(Chen and Wong，J Agric Food Chem，2008，56 :4352_4358)，因此，如何分離純化含硒、碲的藻膽蛋白類似物也具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，提供一種同時分離高純度的藻藍蛋白和別藻藍蛋白的方法。本發(fā)明的另一目的在于提供所述同時分離高純度的藻藍蛋白和別藻藍蛋白的方法的應用。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)一種同時分離高純度的藻藍蛋白和別藻藍蛋白的方法，包含以下步驟(1)將螺旋藻干粉溶于磷酸鹽緩沖溶液中，反復凍融，超聲破碎，離心，上清為藻膽蛋白粗提液；(2)使用硫酸銨鹽析法初步純化藻膽蛋白粗提液，具體如下0°C下加入飽和度為 25 35%的硫酸銨溶液鹽析去除雜蛋白，得到的上清液用0°C下飽和度為60 70%的硫酸銨溶液鹽析，得到的沉淀用磷酸鹽緩沖溶液溶解并置于透析袋中，于磷酸鹽緩沖溶液中透析過夜，將透析液離心，取上清，得到初步純化的藻膽蛋白提取液；(3)羥基磷灰石的制備、裝柱及平衡將氯化鈣和磷酸氫二鉀按摩爾比1 1以相同的速度勻速滴入裝有相同濃度的氯化鈣溶液中；滴加完畢后，靜置沉淀，傾去上清液，沉淀用水沖洗；接著用氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)沉淀的PH > 8，放置12 24小時后，用水沖洗沉淀， 棄去細小顆粒，裝柱，然后用磷酸鹽緩沖溶液平衡；本優(yōu)化方法制備的羥基磷灰石顆粒大小適中，可達到較好的分離效果，市面上買的顆粒太小會嚴重影響洗脫速度，甚至導致無法洗脫；(4)將步驟(2)得到的初步純化的藻膽蛋白提取液上樣到步驟(3)制備的平衡后的羥基磷灰石柱子，上樣量為柱床體積的1/3 1/2 ；上樣完畢后用含0. 1 0. 2M氯化鈉、 PH6. 5 7. 2的磷酸鹽緩沖溶液進行梯度洗脫，洗脫梯度分別為0. 005 0. 01M、0. 02 0. 03Μ、0· 04 0. 06Μ 和 0. 1 0. 12Μ ；(5)收集含0. 1 0. 2Μ氯化鈉、ρΗ6· 5 7. 2的0. 02 0. 03Μ磷酸鹽緩沖溶液 (即藻藍蛋白)和含0. 1 0. 2Μ氯化鈉、ρΗ6· 5 7. 2的0· 1 0· 12Μ磷酸鹽緩沖溶液(即別藻藍蛋白)，進行冷凍干燥，保存。步驟(1) (3)中所述的磷酸鹽緩沖溶液為0. 5 10mM、pH 6. 5 7. 2的磷酸鹽緩沖溶液；步驟(1)中所述的凍融的次數(shù)優(yōu)選為5 10次，凍融的操作步驟優(yōu)選為-20 -10°C冷凍結(jié)冰，10 15°C融化完全；步驟(1)中所述的超聲破碎的頻率優(yōu)選為150 250W，時間優(yōu)選為15 60min ；步驟(1)中所述的離心的條件優(yōu)選為10000 13000r/min離心30 60min ；步驟(2)中所述的硫酸銨溶液鹽析的百分比均指硫酸銨溶液在0°C時的飽和度；步驟(2)中所述的透析袋的規(guī)格優(yōu)選為截留量為IOKDa ；步驟(2)中所述的離心的條件優(yōu)選為10000 13000r/min離心30 60min ；離心的目的為除去透析液中的變性蛋白；
5
步驟(3)中所述的裝柱的柱子的規(guī)格優(yōu)選為1. 5cmX20cm的具活塞層析柱；步驟(3)中所述的平衡的次數(shù)優(yōu)選為3 5次；步驟(5)中得到的藻藍蛋白的純化因子(A62Q/A28Q)大于4. 5 ；步驟(5)中得到的別藻藍蛋白的純化因子(A65Q/A28Q)大于3. 0 ；所述的同時分離高純度的藻藍蛋白和別藻藍蛋白的方法可廣泛用于各類含藻藍蛋白和別藻藍蛋白的藍藻、細菌及其市售干粉，分離得到藻藍蛋白和別藻藍蛋白，還可用于分離含硒、碲的藻藍蛋白和含硒、碲的別藻藍蛋白。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果(1)本發(fā)明采用反復凍融——超聲破碎聯(lián)用法、硫酸銨分級沉降和羥基磷灰石柱層析法配合使用，同時獲得純化因子達到4. 5的藻藍蛋白和3的別藻藍蛋白及其含硒、碲類似物，并對其純化規(guī)模進行放大，一次層析可獲得克級的高純度蛋白，大大降低純化成本。 按照目前的技術(shù)計算，每毫克成本低于10元人民幣，遠低于SIGMA公司的價格(100美元/ 毫克)，未來隨著技術(shù)的優(yōu)化，此價格仍可大大降低，這為其進一步的工業(yè)化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。 同時，此方法可廣泛用于各類含藻藍蛋白和別藻藍蛋白的藍藻、細菌及其市售干粉，且對于含硒、碲的藻藍蛋白和別藻藍蛋白的分離同樣適用，是一次性快速分離高純度藻藍蛋白、別藻藍蛋白及其含硒、碲類似物的通用方法。因此，該研究項目的產(chǎn)業(yè)化前景非常廣闊，經(jīng)濟社會效益顯著。(2)本發(fā)明所述的方法具有成本低廉、工藝簡單、條件溫和、環(huán)境友好，便于進行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點。(3)本發(fā)明提供制備藻膽蛋白粗提液的通用方法，簡便高效，對自配養(yǎng)的各種藍藻、鮮活細菌，及其市售干粉均適用，降低對原料的要求，便于方法的推廣。


圖1是實施例1中的羥基磷灰石柱層析分離藻膽蛋白的洗脫曲線圖。圖2是實施例1得到的藻藍蛋白(PC)與別藻藍蛋白(APC)的紫外可見光譜圖。圖3是實施例2中的羥基磷灰石柱層析分離含硒藻膽蛋白的洗脫曲線圖。圖4是實施例2中的羥基磷灰石柱層析分離含碲藻膽蛋白的洗脫曲線圖。圖5是藻藍蛋白及其含硒、碲類似物的SDS-PAGE電泳分離圖，其中泳道M為Marker ；泳道1為實施例1制備的藻藍蛋白；泳道2為實施例2制備的含硒的藻藍蛋白；泳道3為實施例2制備的含碲的藻藍蛋白。圖6是別藻藍蛋白及其含硒、碲類似物的SDS-PAGE電泳分離圖，其中泳道M為Marker ；泳道1為實施例1制備的別藻藍蛋白；泳道2為實施例2制備的含硒的別藻藍蛋白；泳道3為實施例2制備的含碲的別藻藍蛋白。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。實施例1藻藍蛋白及別藻藍蛋白的分離純化(1)羥基磷灰石的制備
將0. 4M氯化鈣和0. 4M磷酸氫二鉀500mL均分別以5ml/min的速度滴加到裝有 200ml濃度為0. 4M的氯化鈣溶液的燒杯中，不斷攪拌。完畢后，靜置沉淀，傾去上清液，用足夠的自來水沖洗。一邊向沉淀中加入2M的氫氧化鉀，一邊攪拌，確保沉淀pH > 8，放置12h 后，用大量自來水沖洗，棄去細小顆粒，裝入規(guī)格為1.5cmX20cm的具活塞層析柱中。然后用0. OOlM磷酸鹽緩沖溶液(pH = 6. 8)平衡3-5次即可，其中羥基磷灰石沉淀和ImM磷酸鹽緩沖溶液(PH = 6.8)體積比約為1 1。(2)羥基磷灰石柱層析法分離藻藍蛋白和別藻藍蛋白①藻膽蛋白粗提液的制備取商業(yè)來源的螺旋藻粉或自培養(yǎng)螺旋藻。自培養(yǎng)螺旋藻的培養(yǎng)方法如下在三角燒瓶中加入Zarrouk培養(yǎng)液，接種螺旋藻并調(diào)節(jié)藻的初始A56tl = 0. 20 (于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度(30士2)°C，pH 8 9，光照強度為72ymol ·πΓ2 · s—1 ；培養(yǎng)至Ild采收，用400目的紗絹過濾)于ImM、pH = 6. 8的磷酸鹽緩沖液溶液中，控制其比值為Ig藻10ml溶液，混勻后反復凍融(_20°C冷凍結(jié)冰后置于10°C的水中完全解凍)5次， 超聲破碎15 60min，功率200W。10000r/min,高速離心60min，上清液為藻膽蛋白粗提液。②硫酸銨分級沉降0°C下，向藻膽蛋白粗提液中加入硫酸銨固體配成飽和度為 30%的硫酸銨溶液，鹽析60min后10000r/min，30min高速離心，保留上清液，棄去沉淀。上清液用飽和度為65%硫酸銨溶液鹽析、離心后，棄去上清液，向沉淀中加入少量ImM、pH = 6. 8的磷酸鹽緩沖液溶解并置于接流量為IOKDa的透析袋中，于lmM、pH = 6. 8的磷酸鹽緩沖溶液中透析過夜后，10000r/min，60min高速離心除去變性蛋白，得到初步純化后的藻膽蛋白溶液。③裝柱及平衡將羥基磷灰石混合液搖勻，玻棒引流于層析柱中，敲擊層析柱以確保填裝均勻緊實。將上述初步純化后的藻膽蛋白溶液上柱，上樣量為柱床體積的1/3，待其被羥基磷灰石完全吸附后，開始洗脫，選用含0. 2M氯化鈉的不同濃度的磷酸鹽緩沖溶液 (pH = 6. 8)作為洗脫液，控制梯度洗脫的濃度分別為0. 005,0. 020,0. 050,0. 100M，流速為 0. Sml/min，依次洗脫出雜蛋白、藻藍蛋白、混與別藻藍蛋白中的藻藍蛋白和別藻藍蛋白。羥基磷灰石柱層析分離藻膽蛋白的洗脫曲線如圖1所示，其中組分1為雜蛋白，組分2為藻藍蛋白，組分3為藻藍蛋白與別藻藍蛋白混合物，組分4為別藻藍蛋白。④收集及保存分別收集藻藍蛋白和別藻藍蛋白，并冷凍干燥得干粉保存于-20 0C ο⑤光譜表征分別對藻藍蛋白和別藻藍蛋白進行光譜掃描(如圖2所示)，測定其純度分別為 A620A280 > 4.5, A650A280 > 3. O0實施例2含硒藻藍蛋白及含硒別藻藍蛋白的分離純化羥基磷灰石的制備步驟與上同。通過如下步驟分離制備含硒藻藍蛋白和含硒別藻藍蛋白(1)藻膽蛋白粗提液的制備取商業(yè)來源或者自培養(yǎng)的富硒培養(yǎng)螺旋藻。自培養(yǎng)富硒螺旋藻培養(yǎng)方法如下在三角燒瓶中加入Zarrouk培養(yǎng)液，接種螺旋藻并調(diào)節(jié)藻的初始A56tl = 0.20(于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度(30士 1) V，pH 8 9，光照強度為 72 μ mol ·πΓ2 .S—1 ；分別在7 9d添加亞硒酸鈉，以硒濃度計量依次為100、150、200mg · Λ 從第7天開始每隔24小時添加累計加硒量為450mg -L"1 ；培養(yǎng)至Ild采收，用400目的紗絹過濾)于lmM、pH = 6. 8的磷酸鹽緩沖液溶液中，控制其比值為Ig藻10ml溶液，混勻后反
7復凍融(_20°C冷凍結(jié)冰后置于10°C完全解凍)5次，超聲破碎lOmin，功率200W。IOOOOr/ min,60min高速離心，上清液為含硒藻膽蛋白粗提液。(2)硫酸銨分級沉降0°C下，向藻膽蛋白粗提液中加入硫酸銨固體配成飽和度為 30%硫酸銨溶液，鹽析60min后10000r/min，30min高速離心，保留上清液，棄去沉淀。上清液用飽和度為65%硫酸銨溶液鹽析、離心后，棄去上清液，向沉淀中加入少量lmM、pH = 6. 8 的磷酸鹽緩沖液溶解并置于接流量為IOKDa的透析袋中，于lmM、pH = 6. 8的磷酸鹽緩沖溶液中透析過夜后，10000r/min，60min高速離心除去變性蛋白，得到初步純化后的藻膽蛋白溶液。(3)裝柱及平衡將羥基磷灰石混合液搖勻，玻棒引流于層析柱中，敲擊層析柱以確保填裝均勻緊實。將上述初步純化后的含硒藻膽蛋白溶液上柱，上樣量為柱床體積的 1/3，待其被羥基磷灰石完全吸附后，開始洗脫，選用含0. 2M氯化鈉的不同濃度的磷酸鹽緩沖溶液(pH = 6. 8)作為洗脫液，控制梯度洗脫的濃度分別為0. 005,0. 020,0. 050,0. 100M, 流速為0.8ml/min，依次洗脫出雜蛋白(如圖3組分1所示)、含硒藻藍蛋白(如圖3組分2 所示)、含硒藻藍蛋白與別藻藍蛋白混合物(如圖3組分3所示)、含硒別藻藍蛋白(如圖 3組分4所示)。(4)收集及保存分別收集含硒藻藍蛋白和含硒別藻藍蛋白，并冷凍干燥得干粉保存于_20°C。(5)光譜表征及硒含量測定分別對含硒藻藍蛋白和含硒別藻藍蛋白進行光譜掃描，測定其純度分別為A62tlA28tl > 4. 5,A650A280 > 3. O。通過電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜(ICP-AES)法測得兩種藻膽蛋白的硒含量分別為496. 5和589. 5 μ g/g protein。實施例3含碲的藻藍蛋白及別藻藍蛋白的分離純化羥基磷灰石的制備步驟與上同。通過如下步驟分離制備含碲藻藍蛋白和別藻藍蛋白(1)藻膽蛋白粗提液的制備取商業(yè)來源的螺旋藻粉或自培養(yǎng)螺旋藻。富碲螺旋藻的培養(yǎng)方法如下在三角燒瓶中加入Zarrouk培養(yǎng)液，接種S. platensis并調(diào)節(jié)藻的初始A56tl = 0. 20(于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度(30士2) °C，pH = 8 9，光照強度為 72 μ mol ·πΓ2 .S—1 ；分別在7 9d添加亞碲酸鈉，以碲濃度計量依次為200、250、250mg · Λ 從第7天開始每隔24小時添加，累計加碲量為TOOmg*!/1 ；培養(yǎng)至Ild采收，用400目的紗絹過濾。)于ImM pH = 6. 8的磷酸鹽緩沖液溶液中，控制其比值為Ig藻10ml溶液，混勻后反復凍融(_20°C冷凍結(jié)冰后置于10°C完全解凍)5次，超聲破碎15 60min，功率200W。 10000r/min,60min高速離心，上清液為含碲藻膽蛋白粗提液。(2)硫酸銨分級沉降0°C下，向藻膽蛋白粗提液中加入硫酸銨固體配成飽和度為 30%硫酸銨溶液，鹽析60min后10000r/min，30min高速離心，保留上清液，棄去沉淀。上清液用飽和度為65%硫酸銨溶液鹽析、離心后，棄去上清液，向沉淀中加入少量ImM pH = 6. 8 的磷酸鹽緩沖液溶解并置于接流量為IOKDa的透析袋中，于ImM pH = 6. 8的磷酸鹽緩沖溶液中透析過夜后，10000r/min，60min高速離心除去變性蛋白，得到初步純化后的藻膽蛋白溶液。(3)裝柱及平衡將羥基磷灰石混合液搖勻，玻棒引流于層析柱中，敲擊層析柱以確保填裝均勻緊實。將上述初步純化后的含碲藻膽蛋白溶液上柱，上樣量為柱床體積的1/3，待其被羥基磷灰石完全吸附后，開始洗脫，選用含0. 2M氯化鈉的不同濃度的磷酸鹽緩沖溶液(pH = 6. 8)作為洗脫液，控制梯度洗脫的濃度分別為0. 005,0. 020,0. 050,0. 100M, 流速為0.8ml/min，依次洗脫出雜蛋白(如圖4組分1所示)、含碲藻藍蛋白(如圖4組分2 所示)、含碲藻藍蛋白與別藻藍蛋白混合物(如圖4組分3所示)、含碲別藻藍蛋白(如圖 4組分4所示)。(4)收集及保存分別收集含碲藻藍蛋白和含碲別藻藍蛋白，并冷凍干燥得干粉保存于_20°C。(5)光譜表征及碲含量測定分別對含碲藻藍蛋白和含碲別藻藍蛋白進行光譜掃描，測定其純度分別為A62tlA28tl > 4. 5,A650A280 > 3. 0。通過電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜(ICP-AES)法測得兩種藻膽蛋白的碲含量分別為611. 1和625. 3μ g/g protein。 實施例4聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳及MALDI-T0F/MS鑒定分離純化的蛋白的純度用SDS-PAGE進行確認，并同時對相應的亞基進行分離。實驗采用Laemmli法的垂直不連續(xù)電泳系統(tǒng)，分離膠聚丙烯酰胺質(zhì)量分數(shù)為15%。加樣量為 40yg蛋白每孔，樣品與等體積的SDS-樣品緩沖液(各成分質(zhì)量分數(shù)為2%的SDS，10%甘油，5%巰基乙醇、0. 002%溴酚藍和60mM pH6. 8的Tris-HCl)混合，并在95°C煮5min，在室溫下進行電泳，完成后用考馬斯亮藍染液進行染色。結(jié)果如圖5和圖6所示。將分離出的蛋白條帶從膠中挑出，切成碎片后進行膠內(nèi)胰酶酶解過夜(參考文獻進行:Chen Tianfeng, Wong Yum-Shing, Zheng, W. (2006)Purification and characterization of selenium-containing phycocyanin from selenium-enriched Spirulina platensis. Phytochemistry. 67,2424-2430)。酶解后的多肽用體積分數(shù)為 5% 的三氟乙酸_乙腈溶液超聲輔助提取10分鐘，提取液在SpeedVac儀器上蒸干。所得多肽樣品用體積分數(shù)為0. 的三氟乙酸-乙腈溶液溶解，并用Zip Tip U-C18柱(Millipore) 進行除鹽富集，再用含0. 1 %三氟乙酸的50%乙腈溶液洗脫，所得溶液點樣并進行基質(zhì)輔助激光解吸-串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜(MALDI-T0F-T0F)分析，使用儀器為ABI Applied Biosystems 4700 Proteomics Analyzer。MALDI-T0F-T0F 是一種新興、有效的蛋白質(zhì)的鑒定技術(shù)，是目前蛋白質(zhì)組研究中較為常用、準確的分析方法。該技術(shù)可以提供肽質(zhì)量指紋譜 (Peptide mass fingerprinting, PMF)及肽譜序列信息。通過比較蛋白酶解后得到的肽片斷質(zhì)量圖譜對蛋白質(zhì)進行鑒定，以Protein Score > 60作為數(shù)據(jù)可信的鑒定標準。對本發(fā)明實施例制備得到的藻藍蛋白、別藻藍蛋白及其含硒、碲類似物的檢測結(jié)果如表1所示， 分別對比 PC、Se-PC, Te-PC 和 APC、Se-APC, Te-APC 三組蛋白的 α、β 亞基的 Accession No.和分子量，發(fā)現(xiàn)均無差異。這是由于NCBI等蛋白數(shù)據(jù)庫均不存在任何關(guān)于含硒、碲蛋白的序列，因此含硒、碲蛋白被識別成了普通蛋白而具有相同的Accession No.和分子量。 但含硒、碲組和普通組的identified peptide No.和Protein Score均存在差異，說明含硒、碲組和普通組蛋白在結(jié)構(gòu)上存在差異，結(jié)合ICP-AES的結(jié)果可以證明硒、碲以成功結(jié)合到蛋白中。表1、MALDI-T0F/MS鑒定藻藍蛋白(PC)與別藻藍蛋白(APC)及其含硒、碲類似物
權(quán)利要求
1.一種同時分離高純度的藻藍蛋白和別藻藍蛋白的方法，其特征在于包含以下步驟(1)將螺旋藻干粉溶于磷酸鹽緩沖溶液中，反復凍融，超聲破碎，離心，上清為藻膽蛋白粗提液；(2)使用硫酸銨鹽析法初步純化藻膽蛋白粗提液，具體如下0°C下加入飽和度為25 35%的硫酸銨溶液鹽析去除雜蛋白，得到的上清液用0°C下飽和度為60 70%的硫酸銨溶液鹽析，得到的沉淀用磷酸鹽緩沖溶液溶解并置于透析袋中，于磷酸鹽緩沖溶液中透析過夜，將透析液離心，取上清，得到初步純化的藻膽蛋白提取液；(3)羥基磷灰石的制備、裝柱及平衡將氯化鈣和磷酸氫二鉀按摩爾比1 1以相同的速度勻速滴入裝有相同濃度的氯化鈣溶液中；滴加完畢后，靜置沉淀，傾去上清液，沉淀用水沖洗；接著用氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)沉淀的PH > 8，放置12 24小時后，用水沖洗沉淀，棄去細小顆粒，裝柱，然后用磷酸鹽緩沖溶液平衡；(4)將步驟(2)得到的初步純化的藻膽蛋白提取液上樣到步驟(3)制備的平衡后的羥基磷灰石柱子，上樣量為柱床體積的1/3 1/2 ；上樣完畢后用含0. 1 0. 2M氯化鈉、 PH6. 5 7. 2的磷酸鹽緩沖溶液進行梯度洗脫，洗脫梯度分別為0. 005 0. 01M、0. 02 0. 03Μ、0· 04 0. 06Μ 和 0. 1 0. 12Μ ；(5)收集含0.1 0. 2Μ氯化鈉、ρΗ6· 5 7. 2的0. 02 0. 03Μ磷酸鹽緩沖溶液和含 0. 1 0. 2Μ氯化鈉、ρΗ6. 5 7. 2的0. 1 0. 12Μ磷酸鹽緩沖溶液，前者為藻藍蛋白，后者為別藻藍蛋白；分別進行冷凍干燥，保存；步驟(1) (3)中所述的磷酸鹽緩沖溶液為0. 5 10mM、pH 6. 5 7. 2的磷酸鹽緩沖溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時分離高純度的藻藍蛋白和別藻藍蛋白的方法，其特征在于步驟(1)中所述的凍融的次數(shù)為5 10次，凍融的操作步驟為-20 -10°C冷凍結(jié)冰， 10 15°C融化完全。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時分離高純度的藻藍蛋白和別藻藍蛋白的方法，其特征在于步驟(1)中所述的超聲破碎的條件為150 250W、15 60min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時分離高純度的藻藍蛋白和別藻藍蛋白的方法，其特征在于步驟(1)和步驟(2)中所述的離心的條件為10000 13000r/min離心30 60min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時分離高純度的藻藍蛋白和別藻藍蛋白的方法，其特征在于步驟(2)中所述的透析袋的規(guī)格為截留量lOKDa。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時分離高純度的藻藍蛋白和別藻藍蛋白的方法，其特征在于步驟(3)中所述的裝柱的柱子的規(guī)格為1. 5cmX20cm的具活塞層析柱。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時分離高純度的藻藍蛋白和別藻藍蛋白的方法，其特征在于步驟⑶中所述的平衡的次數(shù)為3 5次。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時分離高純度的藻藍蛋白和別藻藍蛋白的方法，其特征在于步驟(5)中得到的藻藍蛋白的純化因子大于4. 5 ；步驟(5)中得到的別藻藍蛋白的純化因子大于3.0。
9.權(quán)利要求1 8任一項所述的同時分離高純度的藻藍蛋白和別藻藍蛋白的方法的應用，其特征在于所述的方法用于對各類含藻藍蛋白和別藻藍蛋白的藍藻、細菌及其市售干粉分離得到藻藍蛋白和別藻藍蛋白。
10.根據(jù)權(quán)利要求9同時分離高純度的藻藍蛋白和別藻藍蛋白的方法的應用，其特征在于所述的藻藍蛋白為含硒和/或碲的藻藍蛋白； 所述的別藻藍蛋白為含硒和/或碲的別藻藍蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開一種同時分離高純度的藻藍蛋白和別藻藍蛋白的方法與應用。本發(fā)明將螺旋藻干粉反復凍融，超聲破碎，離心，上清為藻膽蛋白粗提液；接著加入硫酸銨，飽和度為25～35％時取上清；再加入硫酸銨，飽和度為60～70％時取沉淀，透析沉淀，得到初步純化的藻膽蛋白提取液，將其上樣到羥基磷灰石柱子；收集含0.1～0.2M氯化鈉的pH6.5～7.2、0.02～0.03M磷酸鹽緩沖溶液和含0.1～0.2M氯化鈉的pH6.5～7.2、0.1～0.12M磷酸鹽緩沖溶液，前者為藻藍蛋白，后者為別藻藍蛋白。該制備方法能同時獲得純化因子達到4.5的藻藍蛋白和3的別藻藍蛋白及其含硒、碲類似物，并對其純化規(guī)模進行放大，一次層析可獲得克級的高純度蛋白，大大降低純化成本，能用于生產(chǎn)藻藍蛋白和別藻藍蛋白。
文檔編號C07K1/16GK102329381SQ20111026891
公開日2012年1月25日 申請日期2011年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月13日
發(fā)明者楊芳, 蔣潔, 鄭文杰, 陳填烽, 黃家興 申請人:暨南大學