專利名稱：精制高純度替曲朵辛的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用高壓液相技術(shù)制取高純度替曲朵辛的方法。
替曲朵辛(也稱為河豚毒素)屬于小分子非蛋白的高活性神經(jīng)毒素，主要存在于河豚魚的卵巢、肝臟和血液中，其它部分含量極微。替曲朵辛也在其它動物甚至海藻中發(fā)現(xiàn)，包括蜥蜴，加州蠑螈，虎蝦魚，藍(lán)環(huán)章魚等。
替曲朵辛的化學(xué)名是八氫-12-(羥甲基)-2-亞氨基-5，97，10α-二甲橋-10αH-[1，3]二橋氧并[6，5-d]嘧啶-4，7，10，11，12-戊醇，分子式為C11H17N3O8，而分子量為319.27。其結(jié)構(gòu)式為 替曲朵辛的結(jié)構(gòu)特征是僅有一個碳環(huán)，一個胍基，六個羥基和-個半醛糖內(nèi)酯基團(tuán)。純的替曲朵辛是無色的結(jié)晶粉末，加熱到220℃時晶體變暗但沒有分解。替曲朵辛溶于酸性水溶液，不溶于水及有機(jī)溶劑在水溶液中的Pka為8.76，屬于堿性動物生物堿。在中性或弱有機(jī)酸性溶液中對熱相當(dāng)穩(wěn)定，在強(qiáng)酸和強(qiáng)堿性水溶液中迅速破壞。
用高壓液相法分離、測定的天然河豚魚中的毒素是含有10余種類似物的混合物，其中主要成分叫替曲朵辛，它的含量在70％-80％之間。另外三種主要類似物為河豚酸、4-表替曲朵辛和脫水4-表替曲朵辛。這三個替曲朵辛衍生物的化學(xué)性質(zhì)有些微小的差別，但生物活性差別較大，例如它們的毒性，替曲朵辛的毒性為4500鼠單位/毫克，4-表替曲朵辛的毒性僅為710鼠單位/毫克，而脫水4-表替曲朵辛的毒性降低到92鼠單位/毫克[1]。
在本專利申請人的另一項發(fā)明“高獲得率提取替曲朵辛的方法”(中華人民共和國國家知識產(chǎn)權(quán)局申請?zhí)?0124516.3，2000年9月18日申請)提供了一種能以高獲得率從河豚魚內(nèi)部組織(例如卵巢)中提取替曲朵辛的方法。以該方法提取的替曲朵辛的純度可達(dá)80％以上，可以應(yīng)用本發(fā)明作進(jìn)一步的精制，從而使純度達(dá)到96％甚至99％以上，從而為基于高純度替曲朵辛的研究及應(yīng)用，特別是醫(yī)藥方面的研究，提供必要的基礎(chǔ)。
因此，本發(fā)明的目的在于提供一種精制替曲朵辛的方法，其特征在于包括以下步驟將替曲朵辛原料溶于稀醋酸；選擇庚烷磺酸鈉溶液為流動相，ODS柱，應(yīng)用高效液相技術(shù)對替曲朵辛溶液進(jìn)行精制；然后將替曲朵辛濃縮、沉淀和結(jié)晶。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，在步驟(a)中稀醋酸的濃度為0.5％-5％。在步驟(b)中，庚烷磺酸鈉溶液的濃度為0.005-0.04mol/L，而且ODS柱的直徑為10mm-19mm。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，替曲朵辛原料在醋酸溶液的濃度為40-160mg/mL。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，替曲朵辛溶液的進(jìn)樣量為50-500μL，最好是100-300μL。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，替曲朵辛溶液的流速為4mL/分鐘-10mL/分鐘。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，在步驟(b)中，可以選擇庚烷磺酸鈉溶液與甲醇的混合體為流動相。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，庚烷磺酸鈉溶液的濃度為0.005-0.04mol/L。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，庚烷磺酸鈉溶液與甲醇的比例為200∶1到100∶1。
以下將參考附圖對本發(fā)明作更為詳細(xì)的描述，在附圖中

圖1是替曲朵辛精制前的處理流程圖。
圖2是替曲朵辛精制的流程圖。
圖3是替曲朵辛粗品990705批HPLC含量測定圖。
圖4是替曲朵辛對照品(第一份樣品)HPLC純度檢查圖。
圖5是替曲朵辛對照品(第一份樣品)HPLC純度檢查圖。
圖6是替曲朵辛對照品(第二份樣品)HPLC純度檢查圖。
圖7是替曲朵辛對照品(第二份樣品)HPLC純度檢查圖。
圖8是替曲朵辛990224批HPLC含量測定圖。
圖9是替曲朵辛990224批HPLC含量測定圖。
圖10是替曲朵辛990224批核磁共振氫普圖。
圖11是替曲朵辛990224批紫外光吸收圖譜。
圖12是替曲朵辛990224批紅外光吸收圖譜。
圖13是替曲朵辛990224批質(zhì)譜圖。
圖14是替曲朵辛990315批HPLC含量測定圖。
圖15是替曲朵辛990315批HPLC含量測定圖。
圖16是替曲朵辛990315批核磁共振氫譜圖。
圖17是替曲朵辛990315批紫外光吸收圖譜。
圖18是替曲朵辛990315批紅外圖譜。
圖19是替曲朵辛990315批質(zhì)譜圖。
圖20是替曲朵辛990319批HPLC含量測定圖。
圖21是替曲朵辛9903195批HPLC含量測定圖。
圖22是替曲朵辛990319批核磁共振氫譜圖。
圖23是替曲朵辛990319批紫外光吸收圖譜。
圖24是替曲朵辛990319批紅外光吸收圖譜。
圖25是替曲朵辛990319批質(zhì)譜圖。
精制方法依據(jù)替曲朵辛的精制涉及兩個問題，一個問題是除去河豚毒素中不屬于替曲朵辛及其類似物的雜質(zhì)，例如殘存的氨基酸、多肽和蛋白質(zhì)，這些物質(zhì)和替曲朵辛及其類似物的性質(zhì)差別較大，可以很容易使用加入有機(jī)溶劑的方法或使用醋酸溶解-氨水沉淀的方法除去。
另一個問題，是除去和替曲朵辛共存的類似物，根據(jù)文獻(xiàn)的報導(dǎo)和我們的經(jīng)驗比較簡單的方法是使用HPLC技術(shù)。使用反相高效液相色譜的離子對技術(shù)報導(dǎo)最多[3]，使用幾種柱可以將替曲朵辛和4-表河豚毒素和脫水4-表河豚毒素分開。然后收集流出的替曲朵辛溶液，再加以處理可以獲得較純的河豚毒素。盡管我們從HPLC儀收集的溶液替曲朵辛含量可以達(dá)99.9％，但放置和處理時發(fā)生轉(zhuǎn)變，所得到固體精品替曲朵辛仍含有少量的類似物。一般情況下替曲朵辛含量在96％以上，從HPLC的色譜圖看得很清楚。
精制操作一、替曲朵辛精制前處理只有當(dāng)替曲朵辛粗品中替曲朵辛含量低于80％的時候才需要精制前處理。含量低于80％的粗品必須預(yù)先處理以除去替曲朵辛中非替曲朵辛和它的類似物的雜質(zhì)以及少量替曲朵辛的類似物，以免給色譜柱造成損壞。
前處理應(yīng)首先分析粗品中替曲朵辛的含量。如果其含量低于80％，按能夠溶解粗品中的替曲朵辛的量加入稀醋酸，攪拌，使粗品大部分溶解，過濾出不溶物，向濾液中逐滴加入稀NH3水，直到溶液pH值呈堿性，冷卻，過濾出沉淀，用去離子水洗沉淀三次，將沉淀在真空中干燥，可得比粗品替曲朵辛含量較高的替曲朵辛結(jié)晶?？捎妙愃频姆椒ㄟB續(xù)重復(fù)處理以達(dá)到含量高于80％的要求。精制前處理的流程如圖1所示。二、替曲朵辛精制色譜條件儀器高效液相(HPLC)制備系統(tǒng)柱子ODS柱流動相庚烷磺酸鈉水溶液檢測UV檢測器分離與收集替曲朵辛粗品用稀乙酸溶解。待柱子平衡后，將替曲朵辛溶液用進(jìn)樣閥定量進(jìn)樣，收集替曲朵辛對應(yīng)峰的流出液。收集時可以將替曲朵辛對應(yīng)峰流出液完全收下。若替曲朵辛與雜質(zhì)分離不完全，按照制備色譜樣品峰收集的方法，要將替曲朵辛峰前后與雜質(zhì)峰的交叉部分不收集。
經(jīng)過HPLC制備，收集替曲朵辛對應(yīng)流出峰。替曲朵辛流出液經(jīng)分析型HPLC分析，替曲朵辛的純度可達(dá)99％(替曲朵辛與原粗品中類似物和其他雜質(zhì)的相對含量)。沉淀與結(jié)晶將經(jīng)過HPLC制備儀收集的替曲朵辛流出液直接在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器內(nèi)于溫?zé)嵯聺饪s，冷卻后逐滴加入濃氨水至溶液pH呈堿性，沉淀出大量替曲朵辛，抽濾，用去離子水洗，直到洗至用火焰檢查無鈉離子黃色火焰存在為止?；鹧鏅z查方法是用白金絲沾上洗沉淀后液體在火焰上灼燒到無鈉離子特征的黃色火焰為止，為了正確觀察鈉離子存在的特征火焰，可以和空白對照。然后，將沉淀溶解于稀乙酸，過濾，用稀氨水中和，調(diào)節(jié)溶液pH值呈堿性，使替曲朵辛沉淀，過濾，水洗抽干。再重復(fù)一次乙酸溶解，氨水沉淀的辦法，將水洗抽干后的替曲朵辛結(jié)晶和過濾漏斗放在真空干燥器內(nèi)干燥，待恒重后，收集替曲朵辛精品測定含量。
流速4毫升/分。
進(jìn)樣量毒素粗品(含86.17％的替曲朵辛，批號990705)用5％稀乙酸溶解，加水稀釋濃度到40mg/ml，每次進(jìn)樣200μl。分離與收集柱子平衡后，樣品溶液用進(jìn)樣閥定量進(jìn)樣200微升。收集替曲朵辛對應(yīng)峰的流出液。收集時可以將替曲朵辛對應(yīng)峰流出液完全收下。若替曲朵辛與雜質(zhì)分離不完全，按照制備色譜樣品峰收集的方法，要將替曲朵辛峰前后與雜質(zhì)峰的交叉部分不收集。
經(jīng)過HPLC制備，收集替曲朵辛對應(yīng)流出峰。替曲朵辛流出液經(jīng)分析型HPLC分析，替曲朵辛的純度可達(dá)99％(替曲朵辛與原粗品中類似物和其他雜質(zhì)的相對含量)。沉淀與結(jié)晶將經(jīng)過HPLC制備儀收集的替曲朵辛流出液直接在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器內(nèi)于溫?zé)嵯聺饪s至10毫升，冷卻后逐滴加入濃氨水至溶液pH呈堿性，沉淀出大量替曲朵辛，抽濾，用去離子水洗，直到洗至用火焰檢查無鈉離子黃色火焰存在為止。將沉淀溶解于稀乙酸，過濾，用稀氨水中和，調(diào)節(jié)溶液pH值呈堿性，使替曲朵辛沉淀，過濾，水洗抽干。再重復(fù)一次乙酸溶解，氨水沉淀的辦法，將水洗抽干后的替曲朵辛結(jié)晶和過濾漏斗放在真空干燥器內(nèi)干燥，待恒重后，收集替曲朵辛精品送質(zhì)檢部門測定含量。三次樣品測定結(jié)果如下表1 替曲朵辛精品(HPLC精制法)收率和質(zhì)量情況
a)圖譜見圖8-13。b)圖譜見圖14-19。c)圖譜見圖20-25。
*樣品是相對含量為86.17％的替曲朵辛結(jié)晶，批號990705，見圖3。
**絕對含量化學(xué)原料的規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)庚烷磺酸鈉 純度＞98.0％ 日本東京化成工業(yè)株式會社氨水 分析純試劑GB 631-89 廣西師范學(xué)院化學(xué)試劑廠冰乙酸 分析純試劑GB 670-90 廣西南寧化學(xué)試劑廠去離子水 自訂標(biāo)準(zhǔn) 南寧楓葉藥業(yè)有限公司生產(chǎn)參考文獻(xiàn)[1].Munetomo Nakamura and Takeshi Yasumoto，Toxicon，23，271-276(1985)。.T.Goto，Y.Kishi，S.Tahahashi and Y.Hirata Tetrahedron，21，2059-2088(1965)。.趙惠蘭、辛修明、單國強(qiáng)、王文秀，中國衛(wèi)生檢驗雜志，49，263-265(1994)。
權(quán)利要求
1.精制替曲朵辛的方法，其特征在于a.將替曲朵辛原料溶于稀醋酸，b.選擇庚烷磺酸鈉溶液為流動相，ODS柱，應(yīng)用高效液相技術(shù)對替曲朵辛溶液進(jìn)行精制，c.將替曲朵辛濃縮、沉淀和結(jié)晶。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，在步驟(a)中，稀醋酸的濃度為0.5％-5％。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，在步驟(b)中，庚烷磺酸鈉溶液的濃度為0.005-0.04mol/L。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，在步驟(b)中，ODS柱的直徑為10mm-19mm。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中，替曲朵辛原料在醋酸溶液的濃度為40-160mg/mL。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其中，替曲朵辛溶液的進(jìn)樣量為50-500μL，最好是100-300μL。
7.如權(quán)利要求4所述的方法，其中，替曲朵辛溶液的流速為4mL/分鐘-10mL/分鐘。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，在步驟(b)中，可以選擇庚烷磺酸鈉溶液與甲醇的混合體為流動相。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，庚烷磺酸鈉溶液的濃度為0.005-0.04mol/L。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，庚烷磺酸鈉溶液與甲醇的比例為200∶1到100∶1。
全文摘要
使用高效液相設(shè)備制取高純度替曲朵辛的方法包括三個步驟:第一步:用0.5%－5%的醋酸溶解替曲朵辛粗品,并稀釋濃度到40－160mg/mL。第二步:使用HPLC制備儀分離與收集替曲朵辛對應(yīng)峰的流出液,流動相為庚烷磺酸鈉溶液,或者是庚烷磺酸鈉溶液與甲醇的混合體,每次進(jìn)樣量為50－500mL,流速為4－10mL/分鐘。第三步:將收集到的替曲朵辛流出液濃縮,加濃氨水沉淀,抽濾,用去離子水洗。然后,將沉淀溶解于稀乙酸,過濾,用稀氨水沉淀,過濾,水洗抽干,再重復(fù)一次。最后將替曲朵辛結(jié)晶,干燥。
文檔編號C07D491/22GK1354176SQ0013267
公開日2002年6月19日 申請日期2000年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月22日
發(fā)明者周茂青, 沈希光 申請人:南寧楓葉藥業(yè)有限公司