專利名稱：一種大量提取藻藍(lán)蛋白的簡(jiǎn)便方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物提取藻藍(lán)蛋白的方法，更具體地，本發(fā)明涉及一種用微生物的培養(yǎng)液從藍(lán)藻、藍(lán)綠藻中提取藻藍(lán)蛋白的方法。
背景技術(shù)：
藻藍(lán)蛋白具有很高的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值1。首先藻藍(lán)蛋白是紅藻和藍(lán)藻特有的光合色素，色澤明亮鮮艷，是食品、高級(jí)眼影、唇膏的首選純天然色素，可作為純天然的色素，用于食品、化妝品和染料等工業(yè)2。再則可加工成保健食品和藥品3。研究表明，藻藍(lán)蛋白能顯著減輕并逐漸消除輻射、化療對(duì)造血功能的損傷4，還能提高淋巴細(xì)胞活性，積極清除細(xì)胞中氧自由基5，促進(jìn)傷口愈合，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明能有效抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)6，而且還可作為熒光試劑。高純度的藻藍(lán)蛋白帶有很強(qiáng)的熒光，制成的純天然熒光試劑，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)和生物工程等領(lǐng)域7。
藻藍(lán)蛋白的提取分為蛋白溶出和蛋白提純兩個(gè)過(guò)程。藍(lán)藻、藍(lán)綠藻藻細(xì)胞外層具鞘，胞壁為革蘭氏陰性菌典型構(gòu)造，由四層組成，每層厚約10nm，要提取出藍(lán)藻、藍(lán)綠藻中的藻藍(lán)蛋白，首先要破碎藻細(xì)胞的鞘和細(xì)胞壁、細(xì)胞膜，使之以水溶狀態(tài)存在于提取液中，再采用適宜的方法將其進(jìn)一步純化，而且還要求全過(guò)程都能保持藻藍(lán)蛋白的活性。目前提取方法大致可以總結(jié)為機(jī)械搗碎、反復(fù)凍融、化學(xué)處理、超聲破碎的蛋白質(zhì)析出方法，然后進(jìn)一步采取硫酸銨沉淀、等電點(diǎn)沉淀、柱層析和凝膠層析法等進(jìn)行純化處理。往往上述方法都是聯(lián)合運(yùn)用，以求達(dá)到最好效果。
我國(guó)目前經(jīng)濟(jì)微藻，主要是藍(lán)藻和藍(lán)綠藻年生產(chǎn)能力超過(guò)1000噸，但大多是微藻初級(jí)產(chǎn)品。現(xiàn)在市場(chǎng)上已經(jīng)有的10多種微藻藻片和膠囊，根據(jù)不同的功能通過(guò)衛(wèi)生部批準(zhǔn)為保健品，但還沒(méi)有以微藻深加工產(chǎn)品藻藍(lán)蛋白為主的功能性保健品，藥品的研究開(kāi)發(fā)幾乎還是空白。這主要是由于藍(lán)藻和藍(lán)綠藻中藻藍(lán)蛋白的提取還處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，沒(méi)有適合于工業(yè)化生產(chǎn)的好的工藝方法，使藻藍(lán)蛋白的商品價(jià)格昂貴而在應(yīng)用上受到限制8。
目前最常運(yùn)用的藍(lán)藻、藍(lán)綠藻細(xì)胞破碎提取方法如下91011取新鮮螺旋藻或者藻粉，用0.01 M K-磷酸鹽緩沖液，pH 6.7，0.15 M NaCl的提取緩沖液漂洗干凈后，重新懸浮于此緩沖液中，在-15℃狀態(tài)下凍結(jié)，然后解凍并升溫到30℃，保持一小時(shí)，并持續(xù)攪拌，之后置于4℃，過(guò)夜，次日18000×g超速離心30分鐘，取上清，加入水相萃取液，混合后攪拌再次置于4℃過(guò)夜，次日再于8000×g高速離心30分鐘后棄沉淀，取上清，加入水萃取液，重復(fù)上述離心步驟5次，獲得的最后上浮物飽和于40％硫酸銨溶液中，再次離心，沉淀溶解于提取緩沖液中。此時(shí)即獲得了食品純和藥品純的藻藍(lán)蛋白。如要獲得高純度的藻藍(lán)蛋白，還需要凝膠層析、柱層析等純化步驟，得到試劑純?cè)逅{(lán)蛋白A620/A280＞4.0。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述研究背景，本發(fā)明人經(jīng)過(guò)對(duì)藻藍(lán)蛋白提取方法的深入研究，非常意外地發(fā)現(xiàn)某些種類的微生物的培養(yǎng)液可以使新鮮的藍(lán)藻、藍(lán)綠藻或其制成的藻粉自然破壁，將藻藍(lán)蛋白釋放到培養(yǎng)液中，進(jìn)一步用常規(guī)方法純化可以獲得高純度的藻藍(lán)蛋白。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種大量提取藻藍(lán)蛋白的方法，其特征在于將固氮菌中克氏桿菌屬和腸細(xì)菌屬固氮菌的培養(yǎng)液與螺旋藻或藻粉混合。在該過(guò)程中，螺旋藻或藻粉被快速降解，藻藍(lán)蛋白被釋放到培養(yǎng)液中，用常規(guī)方法進(jìn)一步純化可以獲得高純度的藻藍(lán)蛋白。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述固氮菌是肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，日勾維腸桿菌(Enterobacter gergoviae)，或產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)，特別優(yōu)選肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)IMCAS 1.1734(＝CGCMCC 1.1734)，日勾維腸桿菌CGMCCNo.0510，和產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)(IBCAS-ZY)，其中日勾維腸桿菌(Enterobacter gergoviae)是日勾維腸桿菌57-7(CGMCC No.0510，其已在中國(guó)專利號(hào)ZL00133626.6(第一發(fā)明人李永興)中公布授權(quán)，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心)，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)來(lái)自于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)(IBCAS-ZY)由中科院植物所保存。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，將上述釋放到培養(yǎng)液中的藻藍(lán)蛋白進(jìn)一步用硫酸銨、凝膠層析、羥基磷灰石層析或Sephadex G-100柱層析純化。
因此，本發(fā)明提供了一種生物提取藻藍(lán)蛋白的方法。與傳統(tǒng)的藻藍(lán)蛋白提取方法相比，本發(fā)明的方法具有成本低廉、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，并且提取的蛋白純度高，而且不破壞蛋白的生物活性，是一種非常適合大規(guī)模生產(chǎn)藻藍(lán)蛋白的方法。本發(fā)明避開(kāi)了傳統(tǒng)的物理化學(xué)法和溶菌酶法的苛刻條件和繁重操作，利用生物方法自然破壁一步即可提取較純的藻藍(lán)蛋白，大大簡(jiǎn)化了提取步驟，使藻藍(lán)蛋白工業(yè)化生產(chǎn)成為可能。


下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，但不應(yīng)理解為是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限定。
圖1.按照本發(fā)明方法利用日勾維腸桿菌培養(yǎng)液從螺旋藻中直接提取的提取液的吸收光譜，620nm處的吸收峰是藻藍(lán)蛋白的吸收峰；圖2.按照本發(fā)明方法利用日勾維腸桿菌培養(yǎng)液從螺旋藻中直接提取的提取液的熒光光譜(室溫)，最大發(fā)射峰位于650nm(580nm激發(fā))；圖3.利用日勾維腸桿菌培養(yǎng)液最終純化的藻藍(lán)蛋白的吸收光譜，620nm處的吸收峰是藻藍(lán)蛋白的吸收峰；圖4.利用日勾維腸桿菌培養(yǎng)液最終純化的藻藍(lán)蛋白的熒光光譜(室溫)，最大發(fā)射峰位于650nm(580nm激發(fā))；圖5.利用日勾維腸桿菌培養(yǎng)液最終純化的藻藍(lán)蛋白的SDS-PAGE電泳圖(M，分子量標(biāo)準(zhǔn)；cpc藻藍(lán)蛋白)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 利用細(xì)菌培養(yǎng)液提取鮮藻的藻藍(lán)蛋白A)螺旋藻培養(yǎng)將螺旋藻接種于Zarrouk培養(yǎng)基12中，該培養(yǎng)基包括(g/l)NaHCO316.8，NaNO32.5，K2HPO40.5，K2SO41.0，NaCl 1.0，MgSO4·7H2O 0.2，CaCl20.04，F(xiàn)eSO47H2O 0.01，EDTA 0.08以及微量元素。130rpm/min振蕩培養(yǎng)，30℃恒溫，100μmol/m2/s連續(xù)光照，培養(yǎng)到藻液的OD值A(chǔ)560達(dá)到1.2左右，用0.45μm孔徑大小的濾網(wǎng)過(guò)濾獲得新鮮藻泥，無(wú)需清洗而用于以下步驟。
B)魚(yú)腥藻、集胞藻培養(yǎng)將魚(yú)腥藻sp.595、集胞藍(lán)藻PCC6803(藻種引自于中科院水生生物所)分別接種于BG-11培養(yǎng)基，成分見(jiàn)文獻(xiàn)13中，(g/l)NaNO3，1.5；K2HPO4·3H2O，0.04；MgSO4·7H2O，0.075；CaCl2·2H2O，0.036；檸檬酸0.006；檸檬酸鐵0.006；Na2EDTA 0.001；Na2CO3，0.02；1ml微量元素(g/l)，包括H3BO3，2.86；MnCl2·4H2O，1.81；ZnSO4·7H2O，0.222；Na2MoO4·2H2O，0.39；CuSO4·5H2O，0.079；Co(NO3)2·6H2O，0.0494，調(diào)節(jié)pH＝7.4。130rpm/min振蕩培養(yǎng)，30℃恒溫，100μmol/m2/s連續(xù)光照培養(yǎng)，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，用濾網(wǎng)過(guò)濾獲得新鮮藻泥，無(wú)需清洗。
C)微生物的培養(yǎng)將肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)IMCAS 1.1734(＝CGCMCC1.1734)，日勾維腸桿菌CGMCC No.0510，和產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)(IBCAS-ZY)分別接種于自配簡(jiǎn)化培養(yǎng)基中，該簡(jiǎn)化培養(yǎng)基包括(g/l)蔗糖10，K2HPO410，KH2PO43，MgSO40.3，NH4Cl 0.4，CaCl20.02以及常規(guī)微量元素，調(diào)節(jié)PH值到8.0，130rpm/min振蕩培養(yǎng)，30℃恒溫，培養(yǎng)15小時(shí)至OD600nm值為2.000左右，自然沉淀后，傾倒出上清培養(yǎng)液。
D)藻藍(lán)蛋白吸收光譜的測(cè)定方法吸收光譜使用SHIMSDZU UV-2550紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)于室溫下測(cè)定，掃描速率為300nm/min，狹縫寬度為2nm，采用光徑為1cm的樣品池。620nm處的強(qiáng)吸收峰為藻藍(lán)蛋白的特征峰。
E)藻藍(lán)蛋白熒光光譜的測(cè)定方法室溫穩(wěn)態(tài)熒光光譜用HITACHI F-4500熒光分光光度計(jì)測(cè)量，激發(fā)、發(fā)射光狹峰為5nm，掃描速率是120nm/min，時(shí)間常數(shù)為2s，光電倍增管增益為NORMAL。位于650nm(580nm激發(fā))處的最大熒光發(fā)射峰是藻藍(lán)蛋白的特征峰。
每一步提取純化步驟之后，均取其澄清藻藍(lán)蛋白液測(cè)定其室溫?zé)晒?、吸收光譜。
F)藻藍(lán)蛋白的純度檢測(cè)方法使用SUNSUNG UV8500 II紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定不同波長(zhǎng)處的紫外和可見(jiàn)光吸收值，即分別在280nm、615nm、620nm、652nm處的吸光值，A620/A280的比值代表藻藍(lán)蛋白的純度食品級(jí)A620/A280＞0.7，藥品級(jí)A620/A280＞2.0，試劑級(jí)A620/A280＞4.0。A為吸收值。藻藍(lán)蛋白的濃度用如下公式計(jì)算14PC(mg/ml)＝(A615-0.474(A652))/5.34G)藻藍(lán)蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)方法取50μl提純后的藻藍(lán)蛋白，加入等體積的增溶液(含5％SDS、2％巰基乙醇和10％甘油的50mM Tris溶液，pH＝6.8)，混勻后靜置30分鐘，沸水煮5分鐘，10000g離心5分鐘，取上清上樣。電泳使用硼酸緩沖體系，濃縮膠、分離膠濃度分別為6％(pH＝6.1)和13.5％(pH＝9.18)。電泳儀為DYCZ-24D型電泳儀(北京市六一儀器廠)。標(biāo)準(zhǔn)蛋白為SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白(購(gòu)自上海西巴斯生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司)。
H)利用細(xì)菌培養(yǎng)液提取鮮藻的藻藍(lán)蛋白以下以日勾維腸桿菌CGMCC No.0510為例舉例說(shuō)明本發(fā)明的藻藍(lán)蛋白提取方法。
將上述各種菌的上清液分別沖洗藻泥至容器中，并加至菌液和藻泥大約為2∶1的體積比，密封(只為防止水分蒸發(fā)，不必很?chē)?yán)格)，靜置，最好避光，24小時(shí)后，藻藍(lán)蛋白析出，細(xì)胞壁、細(xì)胞膜等非水溶性蛋白沉淀于容器底部，上部即為清亮鮮艷的藍(lán)色藻藍(lán)蛋白粗提物，此時(shí)如表1所示，純度(A620/280)達(dá)到0.9。吸收光譜和熒光發(fā)射光譜分別如圖1和圖2所示，分別顯示620nm處的藻藍(lán)蛋白特征吸收峰和650nm(580nm激發(fā))處的藻藍(lán)蛋白最大熒光發(fā)射峰。附圖所示為用日勾維腸桿菌菌液提取螺旋藻鮮藻泥的藻藍(lán)蛋白的吸收光譜和熒光發(fā)射光譜，用上述提到的菌作用于藻后，只是在蛋白析出時(shí)間和蛋白析出率上稍有差異，但每一步驟所得樣品的光譜特性均是與藻藍(lán)蛋白相同的。所得粗提物用HITACHI 20PR-520離心機(jī)5000g離心后，取上清，此時(shí)藻藍(lán)蛋白的純度(A620/280)可達(dá)到1.3-1.5，遠(yuǎn)高于食品級(jí)純度。
之后用60％飽和度的硫酸銨沉淀，余后流程與目前通行方法無(wú)太大差別，參照胡一兵15等的方法流程將上清液通過(guò)羥基磷灰石層析和Sephadex G-100柱層析，最后可得到純度4.8-5.2的試劑純?cè)逅{(lán)蛋白，其吸收光譜和熒光發(fā)射光譜分別如圖3和圖4所示。與圖1和圖2相同，分別顯示620nm處的藻藍(lán)蛋白特征吸收峰和650nm(580nm激發(fā))處的藻藍(lán)蛋白最大熒光發(fā)射峰，但是峰形更明顯，表明純度更高。
為了檢測(cè)最終純化的藻藍(lán)蛋白的純度，如上使用SDS-PAGE方法檢測(cè)所得藻藍(lán)蛋白已經(jīng)達(dá)到電泳純。結(jié)果如圖5所示，在SDS-PAGE電泳圖譜中與標(biāo)準(zhǔn)蛋白相比，顯示了藻藍(lán)蛋白的亞單位結(jié)構(gòu)，兩條帶分別是藻藍(lán)蛋白的α亞基和β亞基，與藻藍(lán)蛋白結(jié)構(gòu)相符合。以上利用光譜特性和電泳結(jié)果證明用本發(fā)明方法提取的上清的藍(lán)色液體含有高純度的藻藍(lán)蛋白。
實(shí)施例2 利用細(xì)菌培養(yǎng)液提取螺旋藻藻粉中的藻藍(lán)蛋白以與實(shí)施例1中相同的方法進(jìn)行藻藍(lán)蛋白的提取。不同之處在于，用藻粉代替鮮藻。具體步驟如下稱取云南產(chǎn)香峰牌(北京陽(yáng)光雨虹峰產(chǎn)品技術(shù)開(kāi)發(fā)公司)100％藻粉500g置于容器中，加入實(shí)施例1中培養(yǎng)的各種菌液5000ml混合，靜置于室溫25℃左右，半小時(shí)后，藻藍(lán)蛋白析出，上清液清亮湛藍(lán)，傾倒出上清。余下步驟與實(shí)施例1相同，得出類似的結(jié)果。需要說(shuō)明的是，利用藻粉獲得的藻藍(lán)蛋白粗提液的純度沒(méi)有利用鮮藻泥的高，但藻藍(lán)蛋白析出時(shí)間藻粉成倍加快，分析可能是藻粉在制備過(guò)程中由于處理流程使得螺旋藻的胞壁組構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致藻藍(lán)蛋白更易析出。但由于藻粉制備過(guò)程中，藻藍(lán)蛋白因?yàn)楦邷馗稍锏仍?，?dǎo)致藻藍(lán)蛋白部分變性，因此藻藍(lán)蛋白的純度和濃度都受影響。因此，用鮮藻提取藻藍(lán)蛋白是最佳選擇。
實(shí)施例3 藻藍(lán)蛋白的不同粗提取方法的對(duì)比為了比較本發(fā)明的方法和常規(guī)的藻藍(lán)蛋白的提取法，在對(duì)照條件下按照文獻(xiàn)中記載的各種藻藍(lán)蛋白提取方法對(duì)鮮藻泥和/或藻粉進(jìn)行提取，結(jié)果如表1所示。
表1 用不同方法粗提鮮藻泥(螺旋藻)中藻藍(lán)蛋白的對(duì)照?qǐng)D提取方法 藻藍(lán)蛋白濃度 藻藍(lán)蛋白純度 規(guī)模和設(shè)備(μg/ml) (A620/A280)4℃超聲破碎 300±120.30 設(shè)備要求嚴(yán)格，每次量小溫度難控制室溫25℃壓 369±150.40 特殊設(shè)備，處軋破碎 理量小，耗力室溫0℃0.5cm 800±100.80 設(shè)備溫控難，玻璃珠機(jī)械破 時(shí)間長(zhǎng)，耗能碎-20℃冰凍30℃950±120.66 耗時(shí)耗能融化2mg溶菌酶/g 280±100.37 耗時(shí)，成本高，濕重 得率低本發(fā)明的方法 1205±10 0.90 無(wú)溫度和設(shè)備(鮮藻泥加入限制，省力省菌液) 能，規(guī)模不受限制本專利發(fā)明方600±15 0.56同上法(藻粉加入菌液)從表1中可以看出，與各種傳統(tǒng)藻藍(lán)蛋白提取方法相比，本發(fā)明的微生物培養(yǎng)液提取方法提取的藻藍(lán)蛋白不僅產(chǎn)率高，而且提取的藻藍(lán)蛋白的純度也優(yōu)于其他各種方法。本發(fā)明的方法不僅具有成本低廉、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，并且提取的蛋白純度高，而且不破壞蛋白的生物活性，是一種非常適合于規(guī)?；a(chǎn)藻藍(lán)蛋白的方法。由于本發(fā)明避開(kāi)了傳統(tǒng)的物理化學(xué)法和溶菌酶法的苛刻條件和繁重操作，利用生物方法自然破壁一步即可提取較純的藻藍(lán)蛋白，大大簡(jiǎn)化了提取步驟，因而使藻藍(lán)蛋白工業(yè)化生產(chǎn)成為可能。
實(shí)施例4 不同固氮菌提取藻藍(lán)蛋白的對(duì)比為了比較本發(fā)明中不同固氮菌提取藻藍(lán)蛋白的優(yōu)劣，在對(duì)照條件下按照實(shí)施例1中的方法對(duì)螺旋藻藻粉云南產(chǎn)香峰牌(北京陽(yáng)光雨虹峰產(chǎn)品技術(shù)開(kāi)發(fā)公司)100％藻粉500g進(jìn)行提取，菌液均培養(yǎng)15小時(shí)，OD600為2，結(jié)果如表2所示。
表2 不同細(xì)菌提取藻粉中藻藍(lán)蛋白的對(duì)比圖日勾維腸桿菌 肺炎克雷伯氏菌 產(chǎn)酸克雷伯氏菌破碎時(shí)間(分) 30±8 30±540±5粗提液藻藍(lán)蛋白 0.50±0.20 0.60±0.15 0.55±0.15純度(A620/A280)粗提液藻藍(lán)蛋白 1300±10 1350±10 1300±15濃度(μg/ml)從表2可以看出，分別使用日勾維腸桿菌CGMCC No.0510，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)IMCAS 1.1734(＝CGCMCC 1.1734)，和產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)(IBCAS-ZY)進(jìn)行實(shí)施例1中的實(shí)驗(yàn)可以容易地得出類似的結(jié)果，都可以在很短時(shí)間破碎藻細(xì)胞，釋放出藻藍(lán)蛋白。藻藍(lán)蛋白純度和總藻藍(lán)蛋白濃度都很理想。三種菌株都是不錯(cuò)的選擇。其中肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)IMCAS1.1734(＝CGCMCC 1.1734)略有優(yōu)勢(shì)，說(shuō)明這些菌屬都適用于本發(fā)明。
實(shí)施例5 按照本發(fā)明的方法提取各種藍(lán)藻、藍(lán)綠藻中的藻藍(lán)蛋白為了比較本發(fā)明中固氮菌液是否能很好適用于其他藍(lán)藻、藍(lán)綠藻的藻藍(lán)蛋白提取，在對(duì)照條件下按照實(shí)施例1中的方法，樣品為螺旋藻、魚(yú)腥藻、集胞藻的鮮藻泥，濕重為200g，菌液用肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)IMCAS 1.1734(＝CGCMCC 1.1734)，培養(yǎng)15小時(shí)，OD600為2，結(jié)果如表3所示。
表3 按照本發(fā)明的方法提取各種藍(lán)藻、藍(lán)綠藻中的藻藍(lán)蛋白螺旋藻魚(yú)腥藻集胞藻蛋白析出后顯微未見(jiàn)藻絲，未見(jiàn)未見(jiàn)藻絲和任何未見(jiàn)任何完整細(xì)鏡下觀察 任何完整細(xì)胞，完整細(xì)胞，細(xì)胞胞，破碎效果很破碎效果很好 破碎效果很好 好藻藍(lán)蛋白析出時(shí)121518間(小時(shí))粗提液藻藍(lán)蛋白0.90 0.70 0.68純度(A620/A280)鹽析、層析后藻5.12 4.83 4.15藍(lán)蛋白純度(A620/A280)粗提液藻藍(lán)蛋白1350 650 620濃度(μg/ml)從表3可以看出，螺旋藻、魚(yú)腥藻、集胞藻中的藻藍(lán)蛋白均可以用本發(fā)明的方法簡(jiǎn)單提取出來(lái)，由于螺旋藻中藻膽蛋白含量高達(dá)鮮重的15-20％，且不含藻紅蛋白，因此純度和總蛋白提取都處于明顯優(yōu)勢(shì)。目前國(guó)內(nèi)最多養(yǎng)殖的也是螺旋藻，因此原材料供應(yīng)充足，很適宜于提取藻藍(lán)蛋白。本發(fā)明同樣適用于其他藍(lán)藻，其中集胞藻6803是藍(lán)藻的模式植物，也能在菌液中很快破壁，析出蛋白。但也可以看出，由于魚(yú)腥藻、集胞藻的本身蛋白含量不高，所以藻藍(lán)蛋白提取量不夠高，并非因?yàn)槠票诓煌耆?，而是由于其品系的緣故。所用顯微鏡是CARL ZEISS JENA，400×。
實(shí)施例6 不同藻和不同菌的反應(yīng)結(jié)果對(duì)照為了充分了解不同材料之間相互反應(yīng)是否有特異性差別，設(shè)計(jì)了如下試驗(yàn)，將不同藻和不同菌分別作用。在對(duì)照條件下按照實(shí)施例1中的方法，樣品為螺旋藻、魚(yú)腥藻、集胞藻的鮮藻泥，濕重為100g，菌液用以上的肺炎克雷伯氏菌、日勾維腸桿菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌，培養(yǎng)15小時(shí)，OD600為2，結(jié)果如表4所示。
表4 不同菌與不同鮮藻泥的作用對(duì)照?qǐng)D螺旋藻魚(yú)腥藻 集胞藻日勾維腸桿菌13小時(shí)破碎，粗17小時(shí)破碎，粗18小時(shí)破碎，提液A620/A280＝ 提液A620/A280＝粗提液0.9，粗提液蛋白 0.7，粗提液蛋白 A620/A280＝0.68，粗濃度(μg/ml)＝濃度(μg/ml)＝700 提液蛋白濃度1300 (μg/ml)＝690肺炎克雷伯氏菌 12小時(shí)破碎，粗15小時(shí)破碎，粗 18小時(shí)破碎，提液A620/A280＝ 提液A620/A280＝粗提液0.9，粗提液藻藍(lán) 0.7，粗提液藻藍(lán) A620/A280＝0.68，粗蛋白濃度 蛋白濃度提液藻藍(lán)蛋白濃(μg/ml)＝1350(μg/ml)＝650 度(μg/ml)＝630產(chǎn)酸克雷伯氏菌 12小時(shí)破碎，粗16小時(shí)破碎，粗 17小時(shí)破碎，提液A620/A280＝ 提液A620/A280＝粗提液0.9，粗提液藻藍(lán) 0.7，粗提液藻藍(lán) A620/A280＝0.68，粗蛋白濃度 蛋白濃度提液藻藍(lán)蛋白濃(μg/ml)＝1300(μg/ml)＝670 度(μg/ml)＝650從表4可以看出，以上各種螺旋藻、魚(yú)腥藻、集胞藻與肺炎克雷伯氏菌、日勾維腸桿菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌兩兩相互交叉，沒(méi)有顯著性差異，作用基本相同，純度、濃度和時(shí)間主要取決于藻本身。
應(yīng)當(dāng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，但改動(dòng)或修改的等價(jià)形式同樣落在本申請(qǐng)權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍內(nèi)。
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權(quán)利要求
1.一種提取藻藍(lán)蛋白的方法，其特征在于將特定固氮菌的培養(yǎng)液與藍(lán)藻、藍(lán)綠藻的藻泥或藻粉混合。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述固氮菌是日勾維腸桿菌(Enterobacter gergoviae)，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，或產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。
3.按照權(quán)利要求1或2的方法，其中所述固氮菌是日勾維腸桿菌(Enterobacter gergoviae)CGMCC No.0510，或肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)IMCAS 1.1734(＝CGCMCC 1.1734)，和產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)(IBCAS-ZY)。
4.按照權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)的方法，其另外包含將藻藍(lán)蛋白粗提物進(jìn)一步用硫酸銨、凝膠層析、羥基磷灰石層析或Sephadex G-200柱層析純化的步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物提取藻藍(lán)蛋白的方法，更具體地，本發(fā)明涉及一種用微生物的培養(yǎng)液從藍(lán)藻、藍(lán)綠藻中提取藻藍(lán)蛋白的方法。與傳統(tǒng)的藻藍(lán)蛋白提取方法相比，本發(fā)明的方法具有成本低廉、操作簡(jiǎn)便，處理量大等優(yōu)點(diǎn)，并且提取的蛋白純度高，而且不破壞蛋白的生物活性，是一種非常適合于規(guī)?；a(chǎn)藻藍(lán)蛋白的方法。
文檔編號(hào)C12P21/00GK1687440SQ200510059188
公開(kāi)日2005年10月26日 申請(qǐng)日期2005年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月24日
發(fā)明者朱毅, 李永興, 王可玢, 白克智, 匡廷云 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院植物研究所