專利名稱：一種提高金龜子綠僵菌孢子耐貯性和耐熱性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高真菌孢子儲(chǔ)藏穩(wěn)定性的方法，特別是一種提高金龜子綠僵菌孢子儲(chǔ)藏穩(wěn)定性的方法。
背景技術(shù)：
海藻糖(α-D-葡萄糖苷(1，1)-α-D-葡萄糖苷)是非還原性二糖，廣泛存在于微生物、植物及一些低等動(dòng)物中。在生物體內(nèi)，它不僅作為結(jié)構(gòu)成分和能量物質(zhì)存在，而且在熱擊和脫水等協(xié)迫條件下，對(duì)生物體和生物大分子起著良好的非特異性保護(hù)作用，是一種抗逆境劑。海藻糖酶(EC 3.2.1.28)是海藻糖水解酶，它將海藻糖水解成兩分子葡萄糖。真菌海藻糖酶根據(jù)其最適pH和調(diào)節(jié)特性分為酸性和中性海藻糖酶。在完整細(xì)胞內(nèi)，海藻糖是由中性海藻糖酶分解而非酸性海藻糖酶。
金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)是一種重要的蟲(chóng)生真菌，廣泛運(yùn)用于農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)如多種蝗蟲(chóng)的生物防治，與其它真菌制劑一樣，其孢子制成的產(chǎn)品常常不穩(wěn)定。阻礙綠僵菌等殺蟲(chóng)真菌制劑大規(guī)模應(yīng)用的主要原因之一就是孢子的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性。欲提高金龜子綠僵菌孢子的耐貯性和抗逆境能力，可通過(guò)抑制金龜子綠僵菌孢子體內(nèi)中性海藻糖酶基因的表達(dá)，提高海藻糖含量來(lái)增強(qiáng)孢子儲(chǔ)藏能力和抗逆能力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種提高金龜子綠僵菌孢子耐貯性和耐熱性的方法，以便于金龜子綠僵菌孢子的儲(chǔ)藏。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的一種提高金龜子綠僵菌孢子耐貯性和耐熱性的方法，其特征在于首先構(gòu)建金龜子綠僵菌中性海藻糖酶核糖核酸干擾載體，然后建立分生孢子轉(zhuǎn)化體系。
它是通過(guò)核糖核酸干擾技術(shù)構(gòu)建中性海藻糖酶核糖核酸干擾載體，利用基因槍轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化金龜子綠僵菌孢子，并篩選出穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子加以利用。
提高金龜子綠僵菌孢子耐貯性和耐熱性的具體方法是采用金龜子綠僵菌中性海藻糖酶基因中部一段編碼序列構(gòu)建發(fā)卡—環(huán)狀的核糖核酸(RNA)干擾載體，可有效起著降低中性海藻糖酶基因信使RNA(mRNA)含量的作用；利用基因槍法轉(zhuǎn)化金龜子綠僵菌分生孢子的體系，該體系可有效地將質(zhì)粒pBTM-RNAi整合到金龜子綠僵菌基因組中，經(jīng)過(guò)抗性篩選和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法篩選穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子。
上述所得轉(zhuǎn)化子利用DNA印跡鑒定，RNA印跡檢測(cè)轉(zhuǎn)化子中性海藻糖酶基因的表達(dá)量，比較轉(zhuǎn)化子和出發(fā)菌株孢子內(nèi)海藻糖含量、耐貯性、耐熱性，可以得知轉(zhuǎn)化子與出發(fā)菌株孢子的海藻糖含量、耐貯性和耐熱性都有很大的差異。這樣的金龜子綠僵菌孢子的耐貯性、耐熱性都得到了很大的提高。


圖1金龜子綠僵菌中性海藻糖酶核糖核酸(RNA)干擾載體結(jié)構(gòu)示意圖；圖2金龜子綠僵菌中性海藻糖酶核糖核酸(RNA)干擾轉(zhuǎn)化子的Southern雜交驗(yàn)證；圖3金龜子綠僵菌中性海藻糖酶核糖核酸(RNA)干擾轉(zhuǎn)化子的Northern雜交分析；圖4金龜子綠僵菌中性海藻糖酶核糖核酸(RNA)干擾轉(zhuǎn)化子Ma688和金龜子綠僵菌菌株CQMa102不同成熟度分生孢子內(nèi)海藻糖含量比較；圖5金龜子綠僵菌中性海藻糖酶核糖核酸(RNA)干擾轉(zhuǎn)化子Ma688和金龜子綠僵菌菌株CQMa102分生孢子耐貯性比較；圖6金龜子綠僵菌中性海藻糖酶核糖核酸(RNA)干擾轉(zhuǎn)化子Ma688和金龜子綠僵菌菌株CQMa102分生孢子耐熱性比較。
在圖2中1、RNA干擾載體；2、金龜子綠僵菌CQMa102基因組DNA；3-5、3個(gè)RNA干擾轉(zhuǎn)化子基因組DNA。
在圖3中1、金龜子綠僵菌CQMa102；2、RNA干擾轉(zhuǎn)化子Ma217；3、RNA干擾轉(zhuǎn)化子Ma688；4、RNA干擾轉(zhuǎn)化子Ma573。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一種提高金龜子綠僵菌孢子耐貯性和耐熱性的方法1、構(gòu)建金龜子綠僵菌中性海藻糖酶核糖核酸(以下簡(jiǎn)稱為RNA)干擾載體參見(jiàn)圖1，根據(jù)金龜子綠僵菌菌株CQMa102中性海藻糖酶基因反轉(zhuǎn)錄DNA(cDNA)序列(GenBank登錄號(hào)AY557612)設(shè)計(jì)引物，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增出一段正向編碼序列(366→1508(從起始密碼子ATG中A開(kāi)始記數(shù))和一段反向互補(bǔ)編碼序列(891→366)，將這兩段序列相連接，并在5’端加一來(lái)自于構(gòu)巢曲霉3-磷酸甘油醛脫氫酶(gpdA)基因的啟動(dòng)子，在3’端加一來(lái)自于構(gòu)巢曲霉色氨酸(trpC)基因的終止子，然后將此片段通過(guò)限制性內(nèi)切酶Spe I和Not I雙酶切、連接到質(zhì)粒pBTM上，形成RNA干擾載體pBTM-RNAi，將此載體轉(zhuǎn)入金龜子綠僵菌菌株CQMa102，整合到基因組DNA后，可以轉(zhuǎn)錄出中性海藻糖酶基因366→891正向編碼序列和891→366反向互補(bǔ)編碼序列，這兩段序列可以互補(bǔ)連接形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，中間891→1508(圖1中的spacer)可形成一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，這種發(fā)卡—環(huán)結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，經(jīng)過(guò)核酸內(nèi)切酶III加工成21-25個(gè)堿基的小干擾RNA，此小干擾RNA就可進(jìn)一步引起中性海藻糖酶基因的沉默。
2、建立分生孢子轉(zhuǎn)化體系將金龜子綠僵菌CQMa102成熟分生孢子107個(gè)/ml涂布于1/4 SDA(strengthSabouraud’s dextrose agar)培養(yǎng)基上，26℃-28℃，培養(yǎng)10天，收集分生孢子，無(wú)菌水懸浮，4000r/m離心5min沉淀孢子，無(wú)菌水重懸再洗2次，最后無(wú)菌水重懸使其孢子濃度達(dá)109個(gè)/ml，取50μl分生孢子懸液(約5×107個(gè)孢子)于滅菌60mm平皿中央，使其直徑達(dá)1cm，然后放于70％乙醇滅菌的基因槍室內(nèi)用于轉(zhuǎn)化。
按照Biolistic PDS-1000/He Particle Delivery System(Bio-Rad)系統(tǒng)提供的方法進(jìn)行金粉的處理和質(zhì)粒pBTM-RNAi的包埋，并利用該系統(tǒng)，以1350psi氣壓，27.5英寸汞(Hg)真空度進(jìn)行微粒子轟擊。轟擊后取出樣品，在超凈臺(tái)上取出孢子液，用5ml1/4SDA液培重懸，26℃-28℃，50r/m，預(yù)培18h，離心收集孢子，無(wú)菌水沖洗，重懸于5ml 1/4SDA液培，取100μl涂布于含5μg/ml苯萊特的1/4SDA平板上，26℃-28℃，培養(yǎng)7天。
7天后挑取正常生長(zhǎng)并產(chǎn)孢的菌落，接種于不含抗生素的1/4SDA培養(yǎng)基上，26℃-28℃培養(yǎng)7天，再?gòu)脑撈桨逯刑羧尉浣臃N于不含抗生素的1/4SDA培養(yǎng)基上，如此重復(fù)接種5次后，從中挑取單菌落接種于含5μg/ml苯萊特的1/4SDA培養(yǎng)基上，如果該單菌落仍然能夠正常生長(zhǎng)，可以認(rèn)為是較穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子。
為了驗(yàn)證本發(fā)明提供的方法可以提高金龜子綠僵菌孢子耐貯性和耐熱性，發(fā)明人作了如下實(shí)驗(yàn)1、利用DNA印跡鑒定轉(zhuǎn)化子，RNA印跡檢測(cè)轉(zhuǎn)化子中性海藻糖酶基因的表達(dá)量培養(yǎng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子的菌絲并提取DNA，進(jìn)一步做PCR篩選，然后利用DNA印跡鑒定轉(zhuǎn)化子，DNA印跡雜交結(jié)果如圖2所示，采用的探針為RNA干擾載體的部分gpdA啟動(dòng)子序列，從圖2中可以看出只有RNA干擾載體轉(zhuǎn)入金龜子綠僵菌CQMa102基因組中才能顯示出與RNA干擾載體相同大小的雜交帶，出發(fā)菌株無(wú)與此探針同源的序列，則無(wú)雜交帶可見(jiàn)。
利用RNA印跡分析RNA干擾轉(zhuǎn)化子中性海藻糖酶基因的表達(dá)量，Northern雜交結(jié)果如圖3所示。3個(gè)RNA干擾轉(zhuǎn)化子中性海藻糖酶基因的表達(dá)量與出發(fā)菌株相比，都有所下降，其中RNA干擾轉(zhuǎn)化菌株Ma688的表達(dá)量最低，經(jīng)定量軟件分析約為出發(fā)菌株的42％。
2、分生孢子內(nèi)海藻糖含量檢測(cè)RNA干擾轉(zhuǎn)化菌株Ma688和出發(fā)菌株CQMa102成熟孢子劃線接種1/4SDA培養(yǎng)基，26℃-28℃條件下培養(yǎng)，分別收集培養(yǎng)4天、6天、8天和10天的分生孢子，用0.05％吐溫80窩旋懸浮分生孢子，靜置2min，小心吸取上清孢子懸液，棄下層菌絲殘片。重復(fù)此操作幾次可得到較純的分生孢子懸液。然后利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)分生孢子懸液的孢子濃度，計(jì)算孢子數(shù)量。無(wú)菌水沖洗2次，0.5ml無(wú)菌水重懸孢子，100℃煮沸20min，冰上冷卻5min，加入適量0.5mm直徑的玻璃珠窩旋20min，15000r/m離心10min，取上清，記錄液體總體積，取上清50μl加入50μl檸檬酸鈉緩沖液中(pH5.6)，然后加入10μl酸性海藻糖酶，混勻，30℃保溫過(guò)夜，同時(shí)做一用滅菌水代替酸性海藻糖酶的對(duì)照，分別做3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)液于100℃煮沸10min終止反應(yīng)，冰上冷卻5min，10000r/m離心10min，取40μl上清液加入160μl葡萄糖測(cè)定試劑(北京中生北控生物科技股份有限公司)，37℃反應(yīng)15min，使用Model 550酶標(biāo)儀，于505nm處測(cè)定溶液的0D值。
RNA干擾轉(zhuǎn)化菌株Ma688和出發(fā)菌株CQMa102分生孢子海藻糖含量如圖4所示。這兩種菌株分生孢子在生長(zhǎng)4天時(shí)，海藻糖含量就有顯著性差異，Ma688的海藻糖增加28％；在生長(zhǎng)6天、8天和10天時(shí)，Ma688的海藻糖含量迅速增加，與出發(fā)菌株的差異達(dá)到極顯著。
3、孢子耐貯性檢測(cè)RNA干擾轉(zhuǎn)化菌株Ma688和出發(fā)菌株CQMa102成熟孢子劃線接種1/4SDA培養(yǎng)基，26℃-28℃條件下培養(yǎng)10天，收集分生孢子，用PBS/0.1％吐溫80(150mM NaCl，10mM磷酸鈉緩沖液pH7.2，0.1％吐溫80)懸浮，使其濃度達(dá)到109個(gè)孢子/ml，然后于20℃儲(chǔ)藏，取儲(chǔ)藏0天、10天、20天、30天、35天的適量孢子懸液用PBS/0.1％吐溫80稀釋到107，然后取2μl涂布于置于1/4SDA平板上直徑約0.5mm的玻璃紙上，27℃培養(yǎng)20h，取出玻璃紙用棉蘭乳酚油(20ml苯酚，20ml乳酸，40ml甘油，0.05-0.1％棉蘭，定容到100ml)染色，顯微鏡觀察計(jì)數(shù)萌發(fā)孢子。
RNA干擾轉(zhuǎn)化菌株Ma688和出發(fā)菌株CQMa102分生孢子的耐貯性如圖5所示。Ma688孢子在各個(gè)儲(chǔ)藏時(shí)間點(diǎn)的萌發(fā)率都比出發(fā)菌株高，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，與出發(fā)菌株的差異越大。
4、孢子耐熱性檢測(cè)
RNA干擾轉(zhuǎn)化菌株Ma688和出發(fā)菌株CQMa102成熟孢子劃線接種1/4SDA培養(yǎng)基，26℃-28℃條件下培養(yǎng)10天，收集分生孢子，用PBS/0.1％吐溫80懸浮分生孢子，并梯度稀釋到104，取50μl孢子懸液分裝于0.2ml擴(kuò)增管，分別經(jīng)45℃熱處理0h、2h、4h、6h、8h，然后從中取20μl(約200個(gè)分生孢子)涂布到加入0.1％ Triton X-100的1/4SDA平板上(0.1％Triton X-100可限制菌落的擴(kuò)散生長(zhǎng)，便于計(jì)數(shù))，26℃-28℃培養(yǎng)4天，觀察計(jì)數(shù)生長(zhǎng)菌落數(shù)。
RNA干擾轉(zhuǎn)化菌株Ma688和出發(fā)菌株CQMa102分生孢子的耐熱性如圖6所示，Ma688孢子在各個(gè)熱處理時(shí)間點(diǎn)的存活率與出發(fā)菌株比較都達(dá)到極顯著差異。
可見(jiàn)，RNA干擾轉(zhuǎn)化子與出發(fā)菌株孢子的海藻糖含量、耐貯性和耐熱性都有很大的差異，這樣的金龜子綠僵菌孢子的耐貯性、耐熱性都得到了很大的提高。
權(quán)利要求
1.一種提高金龜子綠僵菌孢子耐貯性和耐熱性的方法，其特征在于首先構(gòu)建金龜子綠僵菌中性海藻糖酶核糖核酸干擾載體，然后建立分生孢子轉(zhuǎn)化體系。
2.如權(quán)利要求1所述的提高金龜子綠僵菌孢子耐貯性和耐熱性的方法，其特征在于它是通過(guò)核糖核酸干擾技術(shù)構(gòu)建金龜子綠僵菌中性海藻糖酶核糖核酸干擾載體，利用基因槍轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化金龜子綠僵菌分生孢子，并篩選出穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子。
3.如權(quán)利要求2所述的提高金龜子綠僵菌孢子耐貯性和耐熱性的方法，其特征在于采用金龜子綠僵菌中性海藻糖酶基因中部一段編碼序列構(gòu)建發(fā)卡-環(huán)狀的核糖核酸干擾載體；利用基因槍法轉(zhuǎn)化金龜子綠僵菌分生孢子的體系；經(jīng)過(guò)抗性篩選和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法篩選穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子。
4.如權(quán)利要求3所述的提高金龜子綠僵菌孢子耐貯性和耐熱性的方法，其特征在于A、構(gòu)建金龜子綠僵菌中性海藻糖酶核糖核酸干擾載體根據(jù)金龜子綠僵菌菌株CQMa102中性海藻糖酶基因反轉(zhuǎn)錄DNA序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增出一段正向編碼序列366→1508，從起始密碼子ATG中A開(kāi)始記數(shù)，和一段反向互補(bǔ)編碼序列891→366，將這兩段序列相連接，并在5’端加一來(lái)自于構(gòu)巢曲霉3-磷酸甘油醛脫氫酶gpdA基因的啟動(dòng)子，在3’端加一來(lái)自于構(gòu)巢曲霉色氨酸t(yī)rpC基因的終止子，然后將此片段通過(guò)限制性內(nèi)切酶Spe I和Not I雙酶切、連接到質(zhì)粒pBTM上，形成核糖核酸干擾載體pBTM-RNAi，將此干擾載體轉(zhuǎn)入金龜子綠僵菌菌株，整合到基因組DNA中，并轉(zhuǎn)錄出中性海藻糖酶基因366→891正向編碼序列和891→366反向互補(bǔ)編碼序列，這兩段序列可以互補(bǔ)連接形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，中間891→1508可形成一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，經(jīng)過(guò)核酸內(nèi)切酶III加工成21-25個(gè)堿基的小核糖核酸。B、建立分生孢子轉(zhuǎn)化體系將金龜子綠僵菌成熟分生孢子107個(gè)/ml，涂布于1/4SDA培養(yǎng)基上，26℃-28℃，培養(yǎng)10天，收集分生孢子，無(wú)菌水懸浮，離心沉淀孢子，無(wú)菌水重懸再洗，使其孢子濃度達(dá)109個(gè)/ml，取分生孢子懸液于滅菌平皿中央，使其直徑達(dá)1cm，然后放于乙醇滅菌的基因槍室內(nèi)用于轉(zhuǎn)化；按照Bio-Rad系統(tǒng)提供的方法進(jìn)行金粉的處理和質(zhì)粒pBTM-RNAi的包埋，并利用該系統(tǒng)，進(jìn)行微粒子轟擊；轟擊后的樣品用1/4SDA液培重懸，預(yù)培、離心收集孢子，無(wú)菌水沖洗，重懸于1/4SDA液培，取100μl涂布于含5μg/ml苯萊特的1/4SDA平板上，26℃-28℃，培養(yǎng)7天，然后挑選正常產(chǎn)孢的單個(gè)菌落，利用不含抗生素的1/4SDA培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)5次繼代培養(yǎng)，最后接種于含5μg/ml苯萊特的1/4SDA培養(yǎng)基上，進(jìn)行抗性菌株的篩選，得到較穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種提高金龜子綠僵菌孢子儲(chǔ)藏穩(wěn)定性的方法。它首先是構(gòu)建金龜子綠僵菌中性海藻糖酶RNA干擾載體，然后再建立分生孢子轉(zhuǎn)化體系。所得轉(zhuǎn)化子利用DNA印跡鑒定，RNA印跡檢測(cè)轉(zhuǎn)化子中性海藻糖酶基因的表達(dá)量，比較轉(zhuǎn)化子和出發(fā)菌株孢子內(nèi)海藻糖含量、耐貯性、耐熱性，可以得知轉(zhuǎn)化子與出發(fā)菌株孢子的海藻糖含量、耐貯性和耐熱性都有很大的差異。通過(guò)這種方法可使金龜子綠僵菌孢子的耐貯性、耐熱性得到很大的提高。
文檔編號(hào)C12N15/87GK1778891SQ200510057330
公開(kāi)日2006年5月31日 申請(qǐng)日期2005年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月18日
發(fā)明者夏玉先, 胡宗利, 王中康, 殷幼平, 彭國(guó)雄 申請(qǐng)人:重慶大學(xué), 重慶重大生物技術(shù)發(fā)展有限公司