專利名稱：假互補(bǔ)肽核酸探針生物芯片及其基于spr原理的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物芯片領(lǐng)域，特別是一種以假互補(bǔ)肽核酸為探針的生物芯片及其基于表面等離子體共振原理的檢測方法。
背景技術(shù)：
隨著分子生物學(xué)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，芯片技術(shù)必將成為未來臨床疾病診斷中不可缺少的一個新內(nèi)容。芯片技術(shù)是伴隨人類基因組計劃而產(chǎn)生的，是近年來分子生物學(xué)及醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)的重要進(jìn)展，其突出特點在于高速度、高通量、高并行性及多樣化、微型化、自動化等，已經(jīng)成為當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)技術(shù)研究的熱點，在基因診斷、藥物開發(fā)和毒性分析、病原檢測等多個領(lǐng)域顯示出巨大的發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用價值。
目前，盡管芯片技術(shù)已經(jīng)取得了長足的發(fā)展，得到世人的矚目，但是在樣品的制備、探針合成與固定、分子的標(biāo)記、數(shù)據(jù)的讀取與分析等幾個方面仍然存在著許多的問題，而且價格昂貴，從而嚴(yán)重地制約了芯片技術(shù)的廣泛應(yīng)用和進(jìn)一步發(fā)展。尤其是在基因芯片的檢測中，由于標(biāo)記技術(shù)和雜交信號放大技術(shù)的限制，為提高檢測靈敏度和特異性，通常的做法是在標(biāo)記和分析前對樣品進(jìn)行適當(dāng)程序的擴(kuò)增，最常用的是PCR技術(shù)。而PCR擴(kuò)增既需要設(shè)計引物，又要PCR儀，需要對各檢測對象的靶序列建立不同的擴(kuò)增體系、擴(kuò)增方法和擴(kuò)增條件，大大增加了工作量和工作難度。
肽核酸(Peptide Nucleic Acid，PNA)是借助計算機(jī)輔助設(shè)計的一種DNA模擬物，與DNA一樣也是由ATCG四種堿基的單體聚合而成，只是兩者的骨架結(jié)構(gòu)不同DNA是由磷酸二酯鍵連接而成的磷酸戊糖骨架；而PNA是由酰胺鍵連接的重復(fù)的N-2-氨乙基苷氨酸單位構(gòu)成的。PNA不易被蛋白酶、核酸酶等降解，也不與血清中蛋白結(jié)合，但可以通過ATCG四種堿基的互補(bǔ)配對原則和DNA雜交結(jié)合。由于PNA的假肽骨架是電中性的，PNA與DNA或RNA間的雜交不存在靜電斥力，因而具有更強(qiáng)的親和性，其結(jié)合的穩(wěn)定性和特異性都大大提高。將PNA引入檢測芯片領(lǐng)域做為檢測探針大大提高了生物芯片基因檢測的靈敏度和特異性，成為當(dāng)前檢測芯片探針設(shè)計合成的熱點。肽核酸(PNA)雖然對單鏈DNA、RNA表現(xiàn)了良好的雜交特性，但是與雙鏈DNA雜交時只能是多聚嘌呤或者多聚嘧啶PNA，具有過于嚴(yán)格的序列限制性，大大限制了PNA探針對于雙鏈DNA的檢測能力，尤其對于完全基因組、粗制樣本或未純化樣本的操作仍然不能滿足分子生物學(xué)的需求。因此，對于PNA探針用于DNA檢測，樣本的處理必然包括了DNA的提取、純化、變性等過程。
假互補(bǔ)肽核酸(Pseudocomplementary PNAs，即pcPNAs)是肽核酸的一種堿基修飾衍生物，是近年來在研究肽核酸的DNA雙鏈侵襲雜交特性中發(fā)展而來的。即以雙鏈DNA(dsDNA)兩條鏈上的某段序列同時作為靶片段，分別設(shè)計針對該序列的兩條PNA雜交片段。而PNA片段中的腺嘌呤(A)全部用二氨基嘌呤(D)取代，胸腺嘧啶(T)全部用巰基尿嘧啶(sU)取代。這樣一來，當(dāng)兩條含有D、sU的pcPNAs與相應(yīng)的dsDNA發(fā)生反應(yīng)的時候，pcPNAs可同時與dsDNA兩條鏈中相應(yīng)的靶序列結(jié)合，形成穩(wěn)定的PNA-dsDNA-PNA復(fù)合物。但pcPNAs本身兩條鏈間由于D和sU立體結(jié)構(gòu)的位阻作用卻無法結(jié)合，這就保證了pcPNAs在識別靶序列的同時不會自己互補(bǔ)結(jié)合。pcPNAs-雙鏈DNA的特殊識別方式顯著的擴(kuò)展了DNA的可能靶序列組成。實際上除了GC含量過高(A+T≤40％)的位點，dsDNA上任何混合堿基位點都可以做為pcPNA的靶序列。目前還未有以pcPNAs作為探針用于基因或蛋白檢測方面的報道。
雖然目前還未有以pcPNAs作為探針用于基因或蛋白檢測方面的報道，但我們分析后認(rèn)為，與傳統(tǒng)的PNA相比，pcPNAs做為核酸雜交探針在理論上可能更具有優(yōu)勢。因為傳統(tǒng)PNA雖可以與單鏈或dsDNA雜交結(jié)合，但是當(dāng)與dsDNA以鏈侵襲模式結(jié)合時由于PNA雙鏈間的強(qiáng)結(jié)合力，只能是多聚同源嘧啶PNA(三鏈侵襲，Triplex invasion)或多聚同源嘌呤PNA(雙鏈侵襲，Duplex Invasion)，這顯然降低了PNA作為探針的普遍性和選擇性。而pcPNAs則可以設(shè)計成任何與靶序列互補(bǔ)的堿基序列，無需非得是多聚同源嘌呤或多聚同源嘧啶；且pcPNAs可同時與dsDNA兩條鏈中相應(yīng)的靶序列結(jié)合，形成穩(wěn)定的PNA-dsDNA-PNA復(fù)合物。可以與pcPNAs雜交結(jié)合的dsDNA甚至可以是螺旋緊密的超螺旋質(zhì)粒DNA，因此可以大大增加對DNA的檢測能力，尤其適用于完全基因組、粗制樣本或未純化樣本操作的應(yīng)用研究，降低標(biāo)本處理的復(fù)雜性，簡化前期標(biāo)本的準(zhǔn)備時間和操作過程，從而為臨床快速基因檢測，特別是野戰(zhàn)條件下的快速基因檢測提供了可能。相比PNA探針，pcPNAs探針應(yīng)用于基因檢測減少了標(biāo)本的純化、變性過程，雜交中省略了變性處理時間，簡化了雜交溫度條件的控制。
基于上述理論，發(fā)明人開創(chuàng)性地以pcPNAs為探針，對pcPNAs與DNA、蛋白質(zhì)的結(jié)合活性，及對其做為芯片檢測的探針特性和雜交特性等系統(tǒng)地進(jìn)行了研究，并與現(xiàn)行的芯片檢測探針進(jìn)行了比較。并在此基礎(chǔ)上，首次將pcPNAs芯片引入表面等離子體共振傳感器，對其做為檢測探針的芯片的特異性、敏感性，及實際檢測應(yīng)用的方法和特性等進(jìn)行了詳細(xì)研究。
表面等離子體共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)傳感器是近年迅速發(fā)展起來的新型光學(xué)傳感器裝置，其突出特點是可以實時的(real time)、在線的(on line)檢測生物分子之間的相互作用，而且不需要標(biāo)記及純化，是當(dāng)前國際傳感器領(lǐng)域的研究熱點之一。其基本原理是當(dāng)入射光以一定的角度經(jīng)一組光學(xué)器件——通常為一高折射率的棱鏡上順序放置一層低折射率的耦合層(多為金屬薄膜)耦合激發(fā)后，在金屬膜界面上發(fā)生表面等離子體共振，即入射光與界表面的自由電子會發(fā)生相互作用，其中部分入射光波被電荷密度波吸收，則入射光線不能發(fā)生全反射，從而導(dǎo)致反射光的強(qiáng)度大大減弱，反射角也發(fā)生明顯的偏差，而且這種反射光的強(qiáng)度和角度的變化與界面上吸附的生物物質(zhì)分子的數(shù)量的多少成一定的比例關(guān)系。
作為探針固定的硫醇化合物表面單分子層自組裝(Self-assembledMonolayer，SAM)技術(shù)自20世紀(jì)80年代初報道以來，由于其滿足了作為模型界面的幾個主要要求，包括和基底的牢固結(jié)合，可控制的分子取向有序排列，可控制的外表面性質(zhì)及可控制的厚度等方面，因此很快地得到了各方的關(guān)注?？偟膩碚f，SAM是基于巰基化合物與基底材料(如金、銀、鉑等)的強(qiáng)烈化學(xué)結(jié)合而形成的。如在金膜表面，巰基被氧化而生成硫金化合鍵。其化學(xué)反應(yīng)式如下。Au-S之間的化學(xué)鍵合力很強(qiáng)，其鍵能高達(dá)184k J/mol，很少有其他基團(tuán)可以與其競爭，這就保證了結(jié)合的選擇性。同時，SAM的排列緊密有序，對酸、堿、離子滲透等有較強(qiáng)的抵抗力。應(yīng)用此方法固定探針可以使探針結(jié)合牢固，且排列有序、分布均勻。我們基于巰基與金屬表面的這種強(qiáng)烈化學(xué)結(jié)合的特性，在本發(fā)明中將巰基修飾的pcPNAs探針與表面等離子體共振設(shè)備的金屬薄膜結(jié)合，制成pcPNAs探針陣列的芯片，完成對各種靶基因、蛋白的檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種以假互補(bǔ)肽核酸為探針的檢測生物芯片；本發(fā)明的目的之二是提供一種基于表面等離子體共振原理所述以假互補(bǔ)肽核酸為探針的檢測生物芯片進(jìn)行檢測的方法。通過本發(fā)明，可以繞過對樣品進(jìn)行擴(kuò)增，簡化樣本處理步驟，提高檢測的靈敏度和特異性；且以光學(xué)信號作為檢測信號，即穩(wěn)定，又易于檢測，使結(jié)果檢測、分析的設(shè)備和技術(shù)大為簡化。從而可以利用生物芯片技術(shù)的高通量、高敏感、高特異的特性，克服目前檢測芯片存在的主要缺點。
為實現(xiàn)本發(fā)明上述目的之一所采用的技術(shù)方案是這樣的，即一種以假互補(bǔ)肽核酸為探針的檢測生物芯片，其特征是在所述芯片固相載體上連接假互補(bǔ)肽核酸檢測探針。
上述假互補(bǔ)肽核酸探針與附著在芯片固相載體上具有表面等離子體共振響應(yīng)特性的厚度為10nm～150nm的納米金屬膜連接。
本發(fā)明的目的之二所采用的技術(shù)方案是一種基于表面等離子體共振原理所述以假互補(bǔ)肽核酸為探針的檢測生物芯片進(jìn)行檢測的方法，其特征在于方法包括以下步驟(一)、在芯片固相載體表面鋪制具有表面等離子體共振感應(yīng)性的納米金屬膜(厚度為10nm～150nm)；在納米金屬膜表面連接pcPNAs探針制備芯片；(二)、處理標(biāo)本，并與生物芯片上的探針進(jìn)行雜交反應(yīng)；(三)、利用表面等離子體共振設(shè)備對各探針雜交區(qū)進(jìn)行偏振光檢測，利用表面等離子體共振原理分析陣列探針雜交反應(yīng)，獲取結(jié)果。
上述步驟(一)中的在芯片固相載體表面鋪制具有表面等離子體共振感應(yīng)性的納米金膜方法的步驟包括
(1)、按檸檬酸三鈉還原法(Frens法)制備納米金溶液；(2)、以N-β-(氨乙基)-γ氨丙基三價氧基硅烷(APTMS)為核心鋪制性質(zhì)均一的表面等離子體共振納米金屬膜；(3)、所鋪納米金屬膜氮氣干燥后密封備用。
上述步驟(一)中在納米金膜表面連接pcPNAs探針陣列方法的步驟包括(1)、清潔處理制備好的鈉米金膜；(2)、以表面自組裝單分子層技術(shù)連接pcPNAs探針陣列，生成探針的自組裝陣列；(3)、清洗芯片，去除未組裝的探針，干燥后封閉備用。
上述步驟(二)中標(biāo)本的處理方法包括(1)、提取細(xì)菌、細(xì)胞及組織的DNA或RNA；由PCR或RT-PCR反應(yīng)生成的核酸物質(zhì)，如DNA、cDNA；(2)、或提取細(xì)菌、細(xì)胞及組織的蛋白質(zhì)，以及分泌液體中的蛋白質(zhì)。
所述步驟(二)中標(biāo)本與基因芯片上的探針進(jìn)行雜交反應(yīng)的步驟包括(1)、在所述的假互補(bǔ)肽核酸為探針的檢測生物芯片上加樣；(2)、將處理好的標(biāo)本注入微流動反應(yīng)池中進(jìn)行雜交反應(yīng)；標(biāo)本與檢測探針雜交反應(yīng)，條件為a)對于DNA芯片，緩沖液為20mM磷酸鈉緩沖液(PH7.0)，反應(yīng)容積為10μl～50μl，循環(huán)反應(yīng)的流速5～20μl/min，反應(yīng)溫度0～99℃，反應(yīng)時間5分鐘～50小時；b)對于蛋白質(zhì)芯片，緩沖液為蛋白芯片雜交緩沖液，該緩沖液由20mMHEPES，1mM DTT，0.1mM EDTA，50mM KCl，5％甘油，200μg/ml牛血清白蛋白組成，反應(yīng)容積為10μl～50μl，循環(huán)反應(yīng)的流速5～20μl/min，反應(yīng)溫度0～99℃，反應(yīng)時間5分鐘～50小時；(3)、清洗去除未雜交結(jié)合的標(biāo)本。
所述步驟(三)中的表面等離子體共振檢測包括(1)、對芯片雜交反應(yīng)區(qū)進(jìn)行表面等離子體共振掃描，即利用表面等離子體共振設(shè)備對所述檢測生物芯片上各探針雜交區(qū)進(jìn)行偏振光檢測；(2)、對掃描結(jié)果分析，獲得芯片檢測結(jié)果。
本技術(shù)發(fā)明的優(yōu)點與效果如下(1)本發(fā)明采用pcPNAs做為雜交探針，較之普通DNA探針具有更高的靈敏度和特異性；(2)本發(fā)明采用pcPNAs做為雜交探針，較之DNA探針或PNA探針，不但避免了PCR反應(yīng)，而且降低了樣品的處理要求，簡化了操作步驟，縮短了檢測時間；(3)本發(fā)明采用pcPNAs做為雜交探針，并應(yīng)用表面等離子體共振原理進(jìn)行信號檢測，不需要昂貴的檢測儀器，降低了芯片的使用成本及實驗條件。
本發(fā)明所使用的術(shù)語“生物芯片”是由生物大分子或組織附著于玻璃、陶瓷、金屬片或尼龍膜、硝酸纖維素膜等芯片固相載體上構(gòu)建而成的陣列。生物芯片的實例包括基因(核酸)芯片、細(xì)胞芯片、蛋白質(zhì)芯片、抗體芯片或組織芯片等。
本發(fā)明所述的核酸包括DNA、RNA、cDNA或肽核酸、假互補(bǔ)肽核酸。
本發(fā)明所使用的術(shù)語“假互補(bǔ)肽核酸”是肽核酸的一種堿基修飾衍生物，即以dsDNA兩條鏈上的某段序列同時作為靶片段，分別設(shè)計兩條PNA探針。探針中的腺嘌呤(A)全部用二氨基嘌呤(D)取代，胸腺嘧啶(T)全部用巰基尿嘧啶(sU)取代。
本發(fā)明所述的蛋白包括各種抗體、抗原、核酸功能相關(guān)酶等。
本發(fā)明所使用的術(shù)語“納米金屬膜”是指由直徑在10nm-150nm之間的納米金屬顆粒形成的厚度為10nm-150nm金屬膜層，可以是金膜、銀膜、鉑膜等。本發(fā)明使用的優(yōu)選的納米金屬膜層為厚度為50nm的納米金膜。
總之，該技術(shù)的研制成功將真正實現(xiàn)芯片技術(shù)的高通量、特異、敏感、快速的特點。既可對病原微生物進(jìn)行快速而準(zhǔn)確的檢測和鑒定，也可以進(jìn)行某一或多個特定基因、或與其相關(guān)的表達(dá)產(chǎn)物的研究，還可以進(jìn)行基因和蛋白質(zhì)與疾病關(guān)系的研究、疾病相關(guān)基因的驗證以及新藥物的開發(fā)與篩選，疾病的分子診斷，治療過程的追蹤和預(yù)后等方面，為臨床疾病的預(yù)防和治療提供重要的指導(dǎo)作用；同時該技術(shù)也可以應(yīng)用到在野戰(zhàn)條件下由基層檢驗人員實施戰(zhàn)場病原體分布的調(diào)查、戰(zhàn)傷感染的早期診斷、生物戰(zhàn)劑的早期發(fā)現(xiàn)等方面，將會產(chǎn)生較好的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。


下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明。
圖1.為本發(fā)明設(shè)計pcPNAs探針基本結(jié)構(gòu)模式圖；圖2.為本發(fā)明表面等離子體共振傳感器基本結(jié)構(gòu)模式圖；圖3.為本發(fā)明表面等離子體共振芯片系統(tǒng)模式圖。
參見圖1，本發(fā)明設(shè)計的pcPNAs探針結(jié)構(gòu)模式，其核心是假肽骨架，其堿基主要包括D、SU、G、C。圖中a表示D與sU之間的空間位阻作用顯著影響了PNA互補(bǔ)單體間的結(jié)合；但是可以和普通DNA副本結(jié)合形成穩(wěn)定的配對；b表示DNA與PNA基本骨架的組成不同，DNA是核酸糖-磷酸主鏈，而PNA是假肽主鏈。
參見圖2，本發(fā)明檢測方法中采用的表面等離子體共振傳感器裝置的構(gòu)成包括A三棱鏡；B芯片；C入射偏振光；D反射光；E光信號采集器；F信號放大器；G數(shù)字信號轉(zhuǎn)換器；H計算機(jī)。
參見圖3，本發(fā)明表面等離子體共振芯片包括芯片固相載體4、納米金屬膜5、探針6；圖中7為做雜交檢測時的反應(yīng)池，8為表面等離子體共振傳感器裝置的光信號采集器，1為激光束，2偏振片，3為棱鏡。
具體實施例方式
實施例1 在玻璃載玻片上鋪制50nm厚度的具有表面等離子體共振感應(yīng)性的納米金膜方法，步驟如下(1)、按檸檬酸三鈉還原法(Frens法)制備金溶膠取0.01％氯金酸水溶液100ml加熱煮沸，攪動下準(zhǔn)確加入1％檸檬酸三鈉水溶液0.75ml，金黃色的氯金酸水溶液在2分鐘內(nèi)變?yōu)樽霞t色，繼續(xù)煮沸15分鐘，冷卻后以蒸餾水恢復(fù)到原體積。
(2)、金膜鋪制A、玻片酸洗清潔干凈后，放入N-β-(氨乙基)-γ氨丙基三價氧基硅烷(APTMS)/甲苯溶液中回流12小時后洗凈，取出，氮氣吹干，置于清潔干燥處備用；B、處理好的玻片置納米金溶液中浸泡12小時后，浸入0.01mol/L，的PDDA水溶液中10-20min，取出用超純水清洗。烘干后移入羥胺/氯金酸溶液中，浸泡0.5小時，玻片表面既形成光亮的金膜層。
實施例2 應(yīng)用表面自組裝單分子層技術(shù)在金膜表面點制pcPNAs探針陣列方法，步驟如下(1)、制備好的鈉米金金膜在piranha液(30％H2O2∶濃H2SO4＝1∶3)中浸泡清洗，然后用雙蒸水反復(fù)清洗，氮氣吹干；
(2)、滴加500nM濃度的SH-pcPNAs/PBS緩沖液與納米金膜上自組裝反應(yīng)，100％濕度反應(yīng)24小時，生成探針的自組裝陣列；(3)、分別吸干緩沖液，6-巰基己醇封閉，雙蒸水清洗，氮氣吹干。
實施例3 通過試劑Chelex-100一步法快速處理標(biāo)本，提取細(xì)菌DNA，步驟如下(1)、用無菌接種環(huán)收集純培養(yǎng)菌落一環(huán)，置于1.5ml滅菌Eppendorf管中；(2)、加入5％Chelex懸濁液50μl，混勻，加入20mg/ml蛋白酶K，56℃水浴消化2h以上，再經(jīng)沸水浴7.5min，隨后立即置入冰浴3min，12000r/min離心5min，取上清液作DNA樣本。
實施例4 細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，粗提細(xì)胞核蛋白質(zhì)，步驟是(1)、將組織剪成小塊，按每20mg組織加入200～300μl均漿液加入均漿液，4℃低溫均漿；(2)、靜置10min后加入90μl 10％NP-40，劇烈震蕩30s，4℃800g離心15min，棄去上清；(3)、沉淀再溶于裂解液5ml中，4℃震搖孵育30min，4℃13000g離心15min，取上清為胞核蛋白提取液；實施例5 DNA標(biāo)本與基因芯片上的pcPNAs探針進(jìn)行雜交反應(yīng)，步驟是(1)、將制備好的芯片組裝到所制作的表面等離子體共振傳感器棱鏡表面，流動反應(yīng)池中注入20mM磷酸鈉緩沖液(PH7.0)20μl，預(yù)熱(45℃)30分鐘，并讀取此時反射光反射角度初始數(shù)值；(2)、將處理好的標(biāo)本上清液注入20μl流動反應(yīng)池中，45℃循環(huán)流動雜交3小時，并讀取各探針點樣點反射光反射角度數(shù)值；(3)、流動反應(yīng)池中充入20μl 20mM磷酸鈉緩沖液(PH7.0)，37℃清洗芯片1小時，重復(fù)3次。
實施例6 蛋白質(zhì)標(biāo)本與蛋白芯片上的pcPNAs探針進(jìn)行雜交反應(yīng)，步驟是(1)、將制備好的芯片組裝到所制作的表面等離子體共振傳感器棱鏡表面，流動反應(yīng)池中注入10mM TE緩沖液20μl，預(yù)熱(37℃)30分鐘，讀取此時反射光反射角度初始數(shù)值；(2)、將處理好的蛋白質(zhì)標(biāo)本上清液注入20μl流動反應(yīng)池中，37℃雜交2小時，并讀取各探針點樣點反射光反射角度數(shù)值；(3)、流動反應(yīng)池中充入20μl 10mM TE緩沖液，37℃清洗芯片1小時，重復(fù)3次。
實施例7 利用pcPNAs探針實施DNA芯片檢測 步驟為淋球菌由大坪醫(yī)院檢驗科細(xì)菌室提供，鑒定標(biāo)準(zhǔn)按《全國臨床檢驗操作規(guī)程》。
Chelex-100購自BioRad公司。制備5％Chelex緩沖液，含1％NP-40，1％Tween-20，0.03％SDS。
淋球菌pcPNAs探針HS-(CH2)6-5’-sU CGCsUsU CsU CGGsU CGCsU-3’；5’-DGCGDCCGDGDDGCGD-(CH2)6-SH-3’，美國Applied Biosystems公司合成；TCEP HCLTis(2-carboxyethyl)-Phosphine Hydrochloride，美國Pierce，0.287mg TCEP溶于1000ul水中制備1mmol/L TCEP；(1)、用無菌接種環(huán)收集純培養(yǎng)淋球菌菌落一環(huán)，置于1.5ml滅菌Eppendorf管中；(2)、加入5％Chelex懸濁液50μl，混勻，加入蛋白酶K(20mg/ml)2μl，56℃水浴消化6h，再經(jīng)沸水浴7.5min，隨后立即置入冰浴3min，12000r/min離心5min，取上清液作DNA樣本。
(3)、制備好的鈉米金金膜在piranha(30％H2O2∶濃H2SO4＝1∶3)液中浸泡清洗，然后用雙蒸水反復(fù)清洗，氮氣吹干。
(4)、25μM的SH-pcPNAs中加等體積1mmol/L TCEP，37℃還原30分鐘，加入PBS緩沖液(1.44g NaH2PO4、8g NaCL、0.2g KCL、0.24g KH2PO4，加入800mL去離子水溶解后，用HCL調(diào)pH為6.5，定溶至1L，高壓滅菌)，SH-pcPNAs終濃度500nM；(5)、滴加500nM濃度的SH-pcPNAs/PBS緩沖液與納米金膜上自組裝反應(yīng)，100％濕度反應(yīng)24小時，生成探針的自組裝陣列。
(6)、將制備好的芯片組裝到所制作的表面等離子體共振傳感器棱鏡表面，流動反應(yīng)池中注入20mM磷酸鈉緩沖液(PH7.0)20μl(10μl/min)，預(yù)熱(45℃)30分鐘，并讀取此時反射光反射角度初始數(shù)值；(7)、將處理好的標(biāo)本上清液注入20μl流動反應(yīng)池中(5μl/min)，45℃循環(huán)雜交3小時，并同時在表面等離子體共振傳感器裝置上讀取各探針點樣點反射光反射角度數(shù)值；(8)、流動反應(yīng)池中充入20μl 20mM磷酸鈉緩沖液(PH7.0)(10μl/min)，37℃清洗芯片1小時，重復(fù)3次。
實施例8 利用pcPNAs探針實施蛋白芯片檢測，步驟為根據(jù)NF-κB的核酸結(jié)合位點(GGGACTTTCC)設(shè)計pcPNAs探針，HS-(CH2)6-5’-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3’；
蛋白芯片雜交緩沖液20mM HEPES，1mM DTT，0.1mM EDTA，50mM KCl，5％甘油，200μg/ml牛血清白蛋白；(1)、將肝組織剪成小塊，加入均漿液A(mmol/LHepes10、Na3VO4 1、MgCl21.5、KCl 10、NaF 50、EDTA 0.1、EGTA 0.1、phenylmethylsulfonyl fluoride0.5、dithiothreitol 1和0.02％protease inhibitors cocktail，pH7.9)10ml，4℃低溫均漿；(2)、靜置10min后加入90μl 10％NP-40，劇烈震蕩30s，4℃800g離心15min，棄去上清；(3)、沉淀再溶于裂解液B(mmol/LHepes 20、NaCl 420、MgCl21.5、EDTA 1、EGTA 1、dithiothreitol 1、phenylmethylsulfonyl fluoride 0.5、glycerol20％和0.02％protease inhibitors cocktail，pH 7.9)5ml中，4℃震搖孵育30min，4℃13000g離心15min，取上清為胞核蛋白提取液；(4)、制備好的鈉米金金膜在piranha(30％H2O2∶濃H2SO4＝1∶3)液中浸泡清洗，然后用雙蒸水反復(fù)清洗，氮氣吹干。
(5)、25μM的SH-pcPNAs中加等體積1mmol/L TCEP，37℃還原30分鐘，加入PBS緩沖液(1.44g NaH2PO4、8g NaCL、0.2g KCL、0.24g KH2PO4，加入800mL去離子水溶解后，用HCL調(diào)pH為6.5，定溶至1L，高壓滅菌)，SH-pcPNAs終濃度500nM；(6)、滴加500nM濃度的SH-pcPNAs/PBS緩沖液與納米金膜上自組裝反應(yīng)，100％濕度反應(yīng)24小時，生成探針的自組裝陣列。
(7)、將制備好的芯片組裝到所制作的表面等離子體共振傳感器棱鏡表面，流動反應(yīng)池中注入蛋白芯片雜交緩沖液20μl(10μl/min)，0℃靜置30分鐘，并讀取此時反射光反射角度初始數(shù)值；
(8)、將處理好的標(biāo)本上清液20μl注入20μl流動反應(yīng)池中(5μl/min)，25℃循環(huán)雜交3小時，并讀取各探針點樣點反射光反射角度數(shù)值；(9)、流動反應(yīng)池中充入20μl蛋白芯片雜交緩沖液(10μl/min)，0℃清洗芯片1小時，重復(fù)3次。
實施例9 雜交檢測和結(jié)果分析實驗檢測采用折射光角度調(diào)制方式，角度調(diào)制范圍從40度到70度角；角分辨率精度高于0.001度；檢測最小濃度小于1×10-11M。根據(jù)設(shè)計芯片探針的檢測靶DNA/蛋白質(zhì)，利用標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度分別測量相應(yīng)角度響應(yīng)改變值繪制靶DNA/蛋白質(zhì)濃度/角度反應(yīng)曲線。實驗結(jié)束后根據(jù)實驗結(jié)果角度變化值與曲線相應(yīng)位置對比檢測靶DNA/蛋白質(zhì)的存在與否以及濃度。
權(quán)利要求
1.一種以假互補(bǔ)肽核酸為探針的檢測生物芯片，其特征是在所述芯片固相載體上連接假互補(bǔ)肽核酸檢測探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測生物芯片，其特征是所述假互補(bǔ)肽核酸探針與附著在芯片固相載體上具有表面等離子體共振響應(yīng)特性的厚度為10nm～150nm的納米金屬膜連接。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測生物芯片，其特征是所述附著在芯片固相載體上具有表面等離子體共振響應(yīng)特性的納米金屬膜可以是金膜、銀膜或鉑膜。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測生物芯片，其特征是所述假互補(bǔ)肽核酸檢測探針采用探針的固化-自組裝單分子層技術(shù)連接在納米金屬膜上。
5.一種基于表面等離子體共振原理對權(quán)利要求2所述檢測生物芯片進(jìn)行檢測的方法，其特征是方法包括以下步驟(1)、在如權(quán)利要求2所述的假互補(bǔ)肽核酸為探針的檢測生物芯片上加樣；(2)、標(biāo)本與檢測探針雜交反應(yīng)，條件為a)對于DNA芯片，緩沖液為20mM磷酸鈉緩沖液(PH7.0)，反應(yīng)容積為10μl～50μl，循環(huán)反應(yīng)的流速5～20μl/min，反應(yīng)溫度0～99℃，反應(yīng)時間5分鐘～50小時；b)對于蛋白質(zhì)芯片，緩沖液為蛋白質(zhì)芯片雜交緩沖液，該緩沖液由20mM HEPES，1mM DTT，0.1mM EDTA，50mM KCl，5％甘油，200μg/ml牛血清白蛋白組成，反應(yīng)容積為10μl～50μl，循環(huán)反應(yīng)的流速5～20μl/min，反應(yīng)溫度0～99℃，反應(yīng)時間5分鐘～50小時；(3)、清洗去除未雜交結(jié)合的標(biāo)本；(4)、利用表面等離子體共振設(shè)備對所述檢測生物芯片上各探針雜交區(qū)進(jìn)行偏振光檢測，利用表面等離子體共振原理分析假互補(bǔ)肽核酸探針雜交反應(yīng)，獲取結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種假互補(bǔ)肽核酸探針的生物芯片，即所述芯片的固相載體上連接有假互補(bǔ)肽核酸檢測探針。本發(fā)明還涉及所述芯片基于表面等離子體共振SPR原理的檢測方法，方法包括標(biāo)本與檢測探針雜交；清洗去除未雜交結(jié)合的標(biāo)本；利用表面等離子體共振設(shè)備對所述檢測生物芯片上各探針雜交區(qū)進(jìn)行偏振光檢測；利用表面等離子體共振原理分析假互補(bǔ)肽核酸探針雜交反應(yīng)，獲取結(jié)果。本發(fā)明采用pcPNAs做雜交探針，較之普通DNA探針具有更高的靈敏度和特異性；不但避免了PCR反應(yīng)，而且降低了樣品的處理要求，簡化了操作步驟，縮短了檢測時間；應(yīng)用表面等離子體共振原理進(jìn)行信號檢測，不需要昂貴的檢測儀器，降低了芯片的使用成本及實驗條件。
文檔編號C12Q1/68GK1769491SQ20051005733
公開日2006年5月10日 申請日期2005年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月21日
發(fā)明者顧大勇, 周元國, 石磊, 魯衛(wèi)平, 朱敏, 王 華, 禹華偉, 梁冰, 張雅鷗 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院, 中國人民解放軍濟(jì)南軍區(qū)第四○一醫(yī)院