專利名稱：用于檢測核酸的探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測核酸的探針，涉及制備所述探針的方法，涉及 用于進(jìn)行檢測反應(yīng)的方法，和涉及測試試劑盒，其包含用于進(jìn)行基于探 針的檢測反應(yīng)所需要的試劑。
背景技術(shù)：
核酸的檢測具有廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域，例如人類或者獸醫(yī)診斷學(xué)、食品 領(lǐng)域、環(huán)境分析、作物保護(hù)、生物化學(xué)或者藥理學(xué)研究和法醫(yī)學(xué)中。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，核酸或者通過多相測定法或者通過均相測定法進(jìn)行 檢測。多相測定法是需要至少 一個(gè)洗滌步驟以使探針^皮此之間的結(jié)合和 非結(jié)合得到分離的方法。多相測定法如下進(jìn)行，例如，將探針固定在固 體相上，同時(shí)在溶液中對(duì)核酸進(jìn)行檢測。通過多相測定法檢測核酸的實(shí)例是混雜過濾或者DNA微排列(參見，例如，M丄.M. Anderson, Nucleic Add Hybridization, Springer - Verlag， New York, 1998或者D. Bowtell, 丄Sambrook， DNA Microarrays， Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2003)。多相測定的優(yōu)點(diǎn)是其具有同時(shí)檢測多種分析物的固 有能力(多路復(fù)用)，缺點(diǎn)是，例如，需要洗滌步驟。均相測定的特征在 于所有組分在溶液中相互反應(yīng)，其中完全排除了洗滌步驟。在使用比較 簡單的裝置時(shí)，通?？梢赃x擇利用均相測定的方法，但是其多路復(fù)用能 力通常有限。無需洗滌步驟有利于自動(dòng)操作，降低了受污染的風(fēng)險(xiǎn)并且 使得檢測反應(yīng)以劃算的方式進(jìn)行。用于檢測DNA的探針通常由雜化和信號(hào)單元組成。雜化單元將序 列明確連接在DNA靶上，并且由，例如，DNA、 PNA或者其它DNA 類似物組成。信號(hào)單元可以為，例如，放射性標(biāo)記的微米或者納米顆粒、 氧化還原活性分子、發(fā)光或者熒光分子。信號(hào)單元通常共價(jià)連接在雜化 單元上。為了防止信號(hào)單元干擾雜化，所述雜化單元通常連接在探針的 5'或者3'末端的信號(hào)單元上。多相測定期間利用洗滌步驟分離連接在欲 檢測的核酸上的探針和在溶液中處于游離狀態(tài)的探針，均相測定必須保 證信號(hào)單元在探針的雜化狀態(tài)中具有與游離狀態(tài)中不同的性能。探針雜
化后信號(hào)單元的改變可以通過，例如，熒光共振能量傳遞(FRET)或者通 過DNA-插入分子得到實(shí)現(xiàn)。熒光的實(shí)例，根據(jù)FRET原理操作的均相 探針是TaqMan⑧探針(P.M. Holland等人，Proc. Natl. Acad. USA， 1991, 88, 7276- 7280)或者所謂的"分子信標(biāo)"(WO 95/13399 Al; S. Tyagi 和F. Kramer, Nature Biotechnol. 1996, 14, 303 -307)。根據(jù)FRET原 理工作的探針在它們的末端包含焚光基團(tuán)和猝滅劑，由此熒光可以得到 開關(guān)，可以說這取決于雜化狀態(tài)。在分子信標(biāo)的情形中，使用的探針是 末端連接在焚光基團(tuán)和猝滅劑上的DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在沒有雜化至靶體 上的狀態(tài)中，由于接近猝滅劑，因此熒光作用受到了抑制。在連接靶體 的情形中，熒光基團(tuán)和猝滅劑被空間分離，從而產(chǎn)生了與靶體增加量相 關(guān)的強(qiáng)度升高的熒光信號(hào)。在PCR反應(yīng)中，為了定量在各個(gè)周期中產(chǎn)生 的產(chǎn)品的量，可以使用分子信標(biāo)作為探針。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，定量 PCR(qPCR)是研究實(shí)驗(yàn)室和診斷學(xué)中檢測和定量核酸的一種最常規(guī)方 法。分子信標(biāo)的缺點(diǎn)是它們具有限制其敏感性的固有焚光作用，這限制溫度窗口之間的特異性。連接特異性和敏感性是開發(fā)雜化探針中的核心 挑戰(zhàn)，它們特別是對(duì)于檢測單元突變(SNP)是至關(guān)重要的。當(dāng)嵌人染料時(shí)，比如，例如將SybrGreen加入到PCR混合物中時(shí)， 該染料插入到形成的DNA雙鏈中，導(dǎo)致與產(chǎn)品的增加量相關(guān)的熒光增 加。該方法能夠使得探針-游離經(jīng)定量PCR得以進(jìn)行(實(shí)例可以參見A.K. Bhar等人J. Clin. Microbiol. 2001， 39， 2835 -2845)。然而，該方法的 缺點(diǎn)在于必須以高濃度使用的染料具有固有熒光，并且其完全非特異染 色。該方法也僅僅能夠?qū)崿F(xiàn)有限的qPCR多路復(fù)用，例如，通過記錄可 以用于區(qū)分不同產(chǎn)品的熔化曲線進(jìn)行區(qū)分。信號(hào)性質(zhì)由于所述DNA結(jié) 合而變化的DNA-結(jié)合信號(hào)分子同樣可以用于開發(fā)均相探針，其中通過 將信號(hào)分子連接在探針上其特異性得到確保。該原理首先由Barton等人 實(shí)現(xiàn)，他們將釕(II)配合物連接在DNA探針上(US 5,157,032; Y. Jenkins 等人，Biochemistry 1992， 31， 10809 - 10816)。這些探針顯示出雜化熒 光升高。然而，雙鏈非靶體DNA的加入同樣促進(jìn)了熒光。此外，陽離 子釕配合物有利于非特異性雜化，并且其顯著抑制探針的特異性。EP0 710 668 Bl描述了使用末端連接在不對(duì)稱花青染料上的DNA探針進(jìn)行 的核酸檢測。這些探針的雜環(huán)使得熒光少量升高，大約升高數(shù)量級(jí)
(Faktor)為4，這不能使核酸得到靈敏檢測。US 6,329,144 Bl描述了末端 連接在不對(duì)稱花青染料上的PNA探針。通過雜化至核酸上，該所謂的 LightUp"笨針的熒光顯示出了明顯升高。這些探針符合敏感性標(biāo)準(zhǔn)，并 且在qPCR的上下文中同樣得到了證實(shí)(N. Svanvik等人，Anal. Biochemistry 2000， 287， 179- 182)。然而，關(guān)于其特異性，LightUp -探針僅限于區(qū)分PNA序列自身的能力，這是因?yàn)樵趩蝹€(gè)堿基突變檢 測中，匹配和不匹配堿基對(duì)之間焚光強(qiáng)度僅僅存在有限的差異(一種實(shí)例 是難于區(qū)分G:C和G:T堿基對(duì))。Privat等人描述了其中中心核苷酸間磷酸酯基經(jīng)連接物連接在噻唑 橙上的DNA探針(E. Privat等人，Photochem. Photobiol， 2002， 75, 201 -210)。當(dāng)雜化互補(bǔ)靶體時(shí)，這些探針僅僅顯示出熒光的少量升高，升 高數(shù)量級(jí)為5。基于所得小的檢測靈敏度，所述探針并不適用于實(shí)際應(yīng) 用于核酸診斷學(xué)中。了描述(A. Okamoto等人，J. Am. Chem. Soc. 2003, 125， 9296 - 9297)。 結(jié)合入探針中的熒光核苷是甲氧基苯并去氮雜腺嘌呤(^A)和甲氧基苯 并去氮雜次黃嘌呤核苷(1^1)，其中在存在C的情形中，^A在相反鏈中 產(chǎn)生明顯熒光，在存在T的情形中，^I在相反鏈中產(chǎn)生明顯熒光。這 些探針原則上適用于在均相測定中區(qū)分單個(gè)堿基突變，但是其缺點(diǎn)是熒 光核苷的熒光受側(cè)面G:C堿基對(duì)的抑制(熒光猝滅)。該性能會(huì)顯著限制 這些探針的普遍適用性。WO 2004058793 Al公開了類似原理核堿基 尿嘧咬和胞嘧啶經(jīng)炔丙基連接物連接在芘羧酰胺上，并且將由此獲得的 熒光堿基(^U和^C)合并入DNA探針中。雖然匹配的堿基對(duì)^U:A和 ^C:G比較弱配對(duì)的組合顯示了明顯更高的熒光，但是和^C探針的 雜化僅僅導(dǎo)致焚光少量升高(2 ~ 8倍)。該方法的另 一缺點(diǎn)是僅僅可以提 供一種熒光染料，因此多路復(fù)用測定不能實(shí)現(xiàn)。K6hler和Seitz證實(shí)，焚光染料噢唑橙可以作為一種通用堿基替代 品通過氨基乙基甘氨酸骨架(Riickgrat)連接在PNA探針上，由此使得 PNA4笨針具有改良的特異性(0. K6hler， O. Seitz, Chem. Commun. 2003, 23,2938- 2939)。當(dāng)通過這些探針對(duì)單個(gè)堿基突變進(jìn)行檢測時(shí)，通用堿 基漆唑橙在相鄰?fù)蛔兊奈恢帽灰搿Ｖ挥挟?dāng)其處于理想堿基對(duì)附近時(shí)， 環(huán)境感光的染料才產(chǎn)生最大熒光信號(hào)。利用該探針進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明，完
結(jié)構(gòu)更強(qiáng)的熒光，即使當(dāng)雜化作用在低于復(fù)式結(jié)構(gòu)熔點(diǎn)之下的溫度下進(jìn) 行時(shí)同樣如此。該觀察表明，噢唑橙能夠使探針產(chǎn)生超過互補(bǔ)堿基對(duì)特異性的特異性。雖然這些基于具有氨基乙基甘氨酸骨架的PNA序列的探針的特異性相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)有所改進(jìn)，不過由此荻得的熒光放大數(shù)量 級(jí)(Faktor)與其它均相探針相當(dāng)。改良特異性和敏感性是開發(fā)雜化探針中的核心問題，其特別是對(duì)于 檢測單個(gè)堿基突變(SNP)是至關(guān)重要的。此外，探針應(yīng)當(dāng)可以在盡可能 寬的溫度范圍內(nèi)使用和能夠進(jìn)行多路復(fù)用測定。發(fā)明內(nèi)容由此，本發(fā)明的目的是提供用于檢測核酸的以高特異性和選擇性并 且在盡可能大的溫度范圍內(nèi)雜化的探針，其可以用于均相測定中并且可 以進(jìn)行多重復(fù)用檢測。令人驚訝地，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)了解決上述目的的探針。由此，本發(fā)明的主題涉及用于檢測核酸的探針，其由肽核酸鏈、核 酸鏈或者DNA類似物鏈組成，在所述鏈中，內(nèi)部位置上的核堿基被熒 光堿基替代物替換。驚人地，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，通過無錯(cuò)配雜化在目標(biāo)序列上， 連接在鳥氨酸上的噻唑橙比根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)連接在氨基乙基甘氨酸骨架 上的噻唑橙顯示出了顯著更高的熒光放大作用。另一驚人發(fā)現(xiàn)是，L-鳥氨酸和D-鳥氨酸偶聯(lián)物的雜化特異性與可獲得的的熒光放大作用的 比例不同L-鳥氨酸偶聯(lián)物顯示出比D-烏氨酸偶聯(lián)物更高的焚光放 大作用，然而D-鳥氨酸偶聯(lián)物顯示出所述焚光放大作用的更高特異 性。由此，本發(fā)明的主題涉及可以通過固相合成獲得的以下通式的PNA 探針<formula>formula see original document page 10</formula>
其中PNA1為任意序列和長度的肽核酸鏈，優(yōu)選2-100個(gè)堿基的序列， 特別優(yōu)選2- IO個(gè)堿基。PNA2為任意序列和長度的肽核酸鏈，優(yōu)選2- 100個(gè)堿基的序列， 特別優(yōu)選2- IO個(gè)堿基。A和A'彼此獨(dú)立地為亞甲基基團(tuán)或者CHR或者CR2類型的取代碳 部分，其中R為氫或者有機(jī)殘基，優(yōu)選取代或者未被取代的支鏈或者直 鏈Cl - C10烷基， 一其中所述取代基可以優(yōu)選選自取代或者未被取代的 氨基，第五或者第六主族元素，優(yōu)選O或者S，一取代或者未被取代的 苯基，在各種情形中特別優(yōu)選未被取代和直鏈的實(shí)施方案，并且非常特 別優(yōu)選氫或者甲基，A優(yōu)選為亞甲基基團(tuán)。B和B'彼此獨(dú)立地為亞甲基基團(tuán)或者CHR或者CR2類型的取代碳 部分，其中R為氫或者有機(jī)殘基，優(yōu)選取代或者未被取代的支鏈或者直 鏈C1 -CIO烷基，一其中所述取代基可以優(yōu)選選自取代或者未被取代的 氨基，第五或者第六主族元素，優(yōu)選O或者S,—取代或者未被取代的 苯基，在各種情形中特別優(yōu)選未被取代和直鏈的實(shí)施方案，并且非常特 別優(yōu)選氫或者甲基，B優(yōu)選為亞甲基基團(tuán)。m為1 - 5的自然數(shù)，優(yōu)選為1，n為l-5的自然數(shù)，優(yōu)選為1,o為1 - 5的自然數(shù)，優(yōu)選為1，X為亞曱基基團(tuán)或者CHR或者CR2類型的取代碳部分，其中R為 氫或者有機(jī)殘基，優(yōu)選取代或者未被取代的支鏈或者直鏈C1-C10烷 基， 一其中所述取代基可以優(yōu)選選自取代或者未被取代的氨基，第五或 者第六主族元素，優(yōu)選O或者S， 一或者取代或者未被取代的苯基，或者X為NH或者NR類型的取代或者未被取代的氨基，其中R為氫或 者有機(jī)殘基，優(yōu)選取代或者未被取代的支鏈或者直鏈C1-CIO烷基，一 其中所述取代基可以優(yōu)選選自第五或者第六主族元素，優(yōu)選O或者S，—取代或者未被取代的苯基，或者X為周期表第五或者第六主族的原子，優(yōu)選為氧或者硫，X特別優(yōu)選為NH基團(tuán)。p為0 - 10的自然數(shù)，優(yōu)選1 - 6的數(shù)，S為焚光通用堿基替代物，其特征在于，其具有熒光性并且能夠插
入DNA中，優(yōu)選為花青染料，進(jìn)一步優(yōu)選為浹化二氨乙苯啡夂 (Ethidium),進(jìn)一步優(yōu)選為取代蒽，此外優(yōu)選為吖啶染料，此外優(yōu)選染 料為選自Molecular Probes公司出售的染料，POPRCM, BO M, YOPRO-i,TOPK(M, JOPROl, POFRCM, P0-PR0-3, L(WPR(M, BOER03, YOPRCM, T0 PR0-3, T0.PRO5(和由這些化合物衍生得到的具有改性連接物結(jié)構(gòu)的焚光基團(tuán))，特別優(yōu) 選噢唑橙，M為CH或者CR類型的取代的碳部分(其中R為氫，其中R為氬 或者有機(jī)殘基，優(yōu)選取代或者未被取代的支鏈或者直鏈C1 -CIO烷基， 一其中所述取代基可以優(yōu)選選自取代或者未被取代的氨基，第五或者第 六主族元素，優(yōu)選O或者S，一取代或者未被取代的苯基，或者M(jìn)為NH或者NR類型的取代或者未被取代的氨基，其中R為氫或 者有機(jī)殘基，優(yōu)選取代或者未被取代的支鏈或者直鏈C1-C10烷基，一 其中所述取代基可以優(yōu)選選自第五或者第六主族基團(tuán)，優(yōu)選O或者S， 一取代或者未被取代的苯基，或者M(jìn)為周期表第五或者第六主族的原子，優(yōu)選為氣或者疏，M特別優(yōu)選為CH基團(tuán)。Y定義如A。q為0-5的自然數(shù)，優(yōu)選為O， r為0-5的自然數(shù)，優(yōu)選為0， s為0-5的自然數(shù)，優(yōu)選為0。作為PNA的替代物，雜化的核酸類型的低聚物還可以為DNA或者 DNA類似物，比如，例如為LNA、嗎啉代-DNA或者Arabino-DNA。據(jù)此，本發(fā)明還涉及可以通過固相合成得到的以下通式(n)的探針其中 5'-NAl是任意序列和長度的核酸或者核酸類似物，其末端為3'-末端磷酸酯基，優(yōu)選長度為3-100個(gè)堿基的核酸序列，特別優(yōu)選長度 為3 - 20個(gè)堿基的核酸序列，非常特別優(yōu)選長度為3-15個(gè)堿基的核酸 序列，NA2-3'是任意序列和長度的核酸或者核酸類似物，優(yōu)選長度為3 -100個(gè)堿基的核酸序列，特別優(yōu)選長度為3-20個(gè)堿基的核酸序列， 非常特別優(yōu)選長度為3-15個(gè)堿基的核酸序列，A和A'如上所定義。w和x為0-5的自然數(shù)，X'和Z彼此獨(dú)立地為亞甲基基團(tuán)或者CHR或者CR2類型的取代碳部分，其中R為氫或者有機(jī)殘基，優(yōu)選為取代或者未被取代的支鏈或者 直鏈C1 - C10烷基， 一其中所述取代基可以優(yōu)選選自取代或者未被取代 的氨基，第五或者第六主族元素，優(yōu)選O或者S，一或者取代或者未被取代的苯基，或者X'和Z彼此獨(dú)立地為NH或者NR類型的取代或未被取代的氨基， 其中R為氫或者有機(jī)殘基，優(yōu)選取代或者未被取代的支鏈或者直鏈Cl -CIO烷基， 一其中所述取代基可以優(yōu)選選自第五或者第六主族元素， 優(yōu)選O或者S, —取代或者未被取代的笨基，或者X'和Z彼此獨(dú)立地為周期表第五或者第六主族的原子，優(yōu)選為氧或 者硫，X'和Z彼此獨(dú)立地特別優(yōu)選為亞曱基基團(tuán)。Y'為亞甲基基團(tuán)或者CHR或者CR2類型的取代碳部分，其中R為 氫或者有機(jī)殘基，優(yōu)選為取代或者未被取代的支鏈或者直鏈Cl-C10 烷基，一其中所述取代基可以優(yōu)選選自取代或者未被取代的氨基，第五 或者第六主族元素，優(yōu)選O或者S,—或者取代或者未被取代的苯基， 或者Y'為NH或者NR類型的取代或未被取代的氨基，其中R為氬或者 有機(jī)殘基，優(yōu)選取代或者未被取代的支鏈或者直鏈C1-CIO烷基，一其 中所述取代基可以優(yōu)選選自第五或者第六主族元素，優(yōu)選O或者S， 一 取代或者未被取代的苯基，或者Y'為周期表第五或者第六主族的原子，優(yōu)選為氧或者硫，Y'特別優(yōu)選為NH基團(tuán)。 v為0-10的自然數(shù)，優(yōu)選l-6的數(shù)，特別優(yōu)選l， u為0-10的自然數(shù)，優(yōu)選l-6的數(shù)，特別優(yōu)選l， t為0-10的自然數(shù)，優(yōu)選l-6的數(shù)， S和M如上所定義。優(yōu)選、特別優(yōu)選或者非常特別優(yōu)選的實(shí)施方案為使用如上所述優(yōu) 選、特別優(yōu)選或者非常特別優(yōu)選所述的參數(shù)、化合物、定義和例證說明 的實(shí)施方案。然而，在上述說明中所迷的一般或者優(yōu)選范圍內(nèi)的定義、參數(shù)、化 合物和例證說明還可以合意地彼此結(jié)合使用，即在具體范圍和優(yōu)選范圍 之間任意結(jié)合使用。如根據(jù)式(I)和(II)的探針中所述的本發(fā)明的熒光通用堿基替代物 S的特征在于，它能夠插入DNA中，并且獨(dú)立于核酸靶體中與替代物 相對(duì)的堿基，對(duì)于DNA-探針復(fù)式結(jié)構(gòu)產(chǎn)生相同或者類似的熔化溫 度。在此方面，可以將堿基替代物成為通用堿基替代物。本發(fā)明堿基 替代物的實(shí)例為花青染料，比如，例如為噻唑橙、嗜唑黃(EP 0 714 986 Al)、溴化二氨乙苯啡啶、Dapoxyl 、 2,6 -給體-受體-取代的蒽(H. Ihmels等人,Org. Lett. 2000， 2， 2865 - 2867)、吖"定(參見，例如，K. Fukui等人，Bioconjugate Chem. 1996, 7， 349 - 355)、 Molecular Probes 公司出售的染料(參見Molecular Probes公司的手冊(cè)Handbook of Fluorescent Probes and Research Products), 比:i口 ，侈寸:i口為poprcm,BO"PR04, YO^PROl, TOPRO-l, JO^RCW, POPRCM, POJ RO-3, LOPRO-1, BCKPRO-3, YOTOOJ, TCWPRCW, TOPROS (和由這些熒光基團(tuán)衍生得到的具有改性或者脫失連接物結(jié)構(gòu)的化合物)和BTCS生色團(tuán)(BTCS生色團(tuán)描述在，例如R. B. Thompson等人，J. Biomed. Opt 2000， 5， 1， 17-22中)。可以對(duì)序列 不同的探針進(jìn)行顏色標(biāo)記，可以通過使用熒光激發(fā)和熒光發(fā)射波長不同 的堿基替代物進(jìn)行顏色標(biāo)記，從而使得多種分析物能夠同時(shí)得到檢測(多 路復(fù)用)。產(chǎn)生較遠(yuǎn)距離的骨架上，而不是模擬DNA中相鄰核堿基之間距離的骨 架上。模擬DNA標(biāo)準(zhǔn)幾何結(jié)構(gòu)的骨架的實(shí)例是PNA中的氨基乙基甘氨 酸骨架。焚光堿基替代物和側(cè)面核堿基之間的距離偏離DNA骨架的標(biāo) 準(zhǔn)幾何結(jié)構(gòu)越遠(yuǎn)，堿基堆積相互作用可以升高單鏈中熒光堿基替代物的發(fā)射作用的效果越差。從而，單鏈探針的焚光較低。然而，選擇的距離 不能過大，否則在雜化之后形成的雙鏈中堿基堆積將會(huì)被阻止。具有氨基乙基甘氨酸骨架的PNA探針內(nèi)熒光堿基替代物與側(cè)面核堿基之間的 適宜距離可以通過，例如，在攜帶堿基替代物的骨架位置上引入3-10 個(gè)亞甲基基團(tuán)得到產(chǎn)生。除了碳部分之外，帶有堿基替代物的骨架結(jié)構(gòu) 還可以包括雜原子，比如，例如為氧、氮、疏、磷或者硅。在焚光堿基 替代物位置上的本發(fā)明骨架的實(shí)例為具有氨基乙基甘氨酸骨架的PNA 探針內(nèi)的鳥氨酸。如果多個(gè)通式結(jié)構(gòu)(I)或者(II)的單元彼此共價(jià)連接在一起，那么可以 荻得具有多重標(biāo)記的探針。當(dāng)使用本發(fā)明探針時(shí)，上述方法可以提高檢 測靈敏度。與每個(gè)探針最多兩個(gè)標(biāo)記物的末端熒光標(biāo)記相比較，熒光堿 基替代物的加入可以進(jìn)行多重標(biāo)記。本發(fā)明探針適用于進(jìn)行雜化測定，特別是均相雜化測定。所述探針 可以用于均相雜化測定中，例如，為了測定存在于含水樣品中的靶體核 酸的類型和量。為此目的，將探針加入到溶解的目標(biāo)核酸中并且將其培 養(yǎng)幾秒鐘至高達(dá)幾小時(shí)的時(shí)間。隨后，與對(duì)照(沒有目標(biāo)核酸的相同溶液) 比較，對(duì)溶液的焚光進(jìn)行測量。比較萸光值與標(biāo)準(zhǔn)曲線，在標(biāo)準(zhǔn)曲線中， 探針熒光與使用的目標(biāo)的量之間的關(guān)系已經(jīng)被確定，能夠?qū)τM(jìn)行檢測 的核酸進(jìn)行定量分析。如果核酸的定量檢測以特別高的靈敏度進(jìn)行，那 么可以以特別有利的方式將單一或者多個(gè)標(biāo)記探針與PCR工藝合并起 來。在定量PCR期間，對(duì)由于靶體放大作用引起的熒光升高進(jìn)行確定。 將需要超過熒光預(yù)定閾值的PCR循環(huán)數(shù)目定義為所謂的Ct-值(循環(huán)閥 值)。經(jīng)校正曲線，可以將Ct-值對(duì)應(yīng)于使用的目標(biāo)濃度，由此表示所 述目標(biāo)濃度的量度。在此必須對(duì)探針進(jìn)行選擇，從而使得其與位于引物 序列之間的目標(biāo)序列段互補(bǔ)，從而盡可能少的表現(xiàn)出與其它基因組序列 的交叉雜化作用。所述探針適用于檢測單堿基突變(SNP)，其中所述檢測可以通過， 例如雜化或者PCR作用進(jìn)行。還可以使用探針分析甲基化類型。如果用 亞硫酸氬鈉對(duì)進(jìn)行研究的DNA進(jìn)行處理，那么所有非甲基化胞嗜啶將 轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，然而曱基化的胞嘧啶在反應(yīng)中不會(huì)發(fā)生變化。然后，可 以通過比如，例如PCR、定量PCR或者雜化作用對(duì)所得的部分改性的 目標(biāo)進(jìn)行分析。利用PCR或定量PCR的所述方法分別描述在，例如J. G.Herman等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996， 93， 9821 -9826等或在 T. - S. Wong等人，European Journal of Cancer 2003， 39, 1881 - 1887中。 為了分析用亞硫酸氫鈉處理的DNA,可以在測定中，優(yōu)選在PCR或者 定量PCR中使用探針。所述探針通過化學(xué)合成進(jìn)行制備，優(yōu)選通過固相合成進(jìn)行制備，特 別優(yōu)選通過自動(dòng)固相合成進(jìn)行制備。制備核酸、核酸類似物和肽核酸的 方法是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所熟知的，描述在，例如L.M. Smith, Anal. Chem. 1988， 60， 381 - 390和B. E. Hyrup和P. E: Nielsen, Bioorg. Med. Chem. 1996， 4， 5 - 23中。所述探針可以通過固相合成共價(jià)連接在熒光 堿基替代物上，或者所述堿基替代物已經(jīng)在匯集合成期間被包含在內(nèi)。 可以對(duì)烏氨酸進(jìn)行保護(hù)，例如，通過芴基甲氧基羰基(Fmoc基團(tuán))對(duì)N-末端進(jìn)行保護(hù)，同時(shí)堿基替代物共價(jià)連接在鳥氨酸的伯氨基上。例如， 噻唑橙可以經(jīng)羧基連接在鳥氨酸的伯氨基上。所述結(jié)構(gòu)單元適用于在通 過Fmoc方法自動(dòng)固相合成探針中使用。相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)已知用于檢測核酸的探針，本發(fā)明的探針具有以下 優(yōu)點(diǎn)a) 探針與欲進(jìn)行檢測的核酸之間具有高識(shí)別特異性，特別在檢測單 堿基突變(SNP)或者甲基化胞嘧啶時(shí)，這是有利的。b) 由于骨架擴(kuò)展，在單鏈中具有低熒光，和由此通過形成探針-分 析物-配合物，產(chǎn)生升高的熒光。c) 通過選擇骨架，可能可以形成具有特別高熒光放大作用(-檢測靈 敏度)或者特異性的探針。d) 通過引入多種堿基替代物，所述探針可以被多重標(biāo)記。e) 通過使用在不同波長下具有熒光最大值的堿基替代物，可以用于 多重測定中。f) 在非嚴(yán)格雜化條件下，雜化和單堿基-特異區(qū)分可以在寬溫度范 圍內(nèi)進(jìn)行。這顯著有利于探針設(shè)計(jì)和測定最優(yōu)化。g) 所述探針通過常規(guī)固相合成進(jìn)行制備。下面，本發(fā)明將根據(jù)實(shí)施方案和附圖進(jìn)行更詳細(xì)地說明。


其中 圖1表明了在加入DNA耙體5' - CGGCTAZTACGGC - 3'之后和之前， 取決于與噻唑橙(TO)結(jié)合的骨架R的作用和取決于與在復(fù)式結(jié)構(gòu)中的 堿基替代物相對(duì)的核苷酸的作用，PNA探針Ac - GCCGTA - R(TO)-TAGCCG的熒光強(qiáng)度之間的比例，其中在堿基替代物中Z = 1 =胸苷 (T)， 2-鳥嘌呤核苷(G)， 3 =腺苷(八)和4-胞嘧啶核苷(C)。其中5 = 11 = 氨基乙基甘氨酸(Aeg), 6 = R = L -鳥氨酸(L - Orn)和7 = R = D -鳥氨酸 (D - Orn)。圖2表明了在加入DNA-耙體5'-CGGCTYTTACGGC-3'之后和之 前，取決于與噻唑橙(TO)結(jié)合的骨架R的作用和取決于存在于目標(biāo)中的 單堿基突變的作用，PNA探針Ac - GCCGTA - R(TO) - TAGCCG的熒 光強(qiáng)度之間的比例，其中Y = 8 -腺嘌呤(A)， 9 -鳥嘌呤核苷(G)， 10 = 胞嘧啶核苷(C)和11 -胸苷(T)。其中5-R-氨基乙基甘氨酸(Aeg), 6 = R =L -鳥氨酸(L - Orn)和7 = R = D -鳥氨酸(D - Orn)。
具體實(shí)施方式
合成探針的實(shí)施例PNA單體購自于PerSeptive Biosystems />司，并且在合成之前在中 等真空中進(jìn)行干燥。固相NovaSyn TGR、 PyBOP和D -鳥氨酸鹽酸鹽 購自于Novabiochem,和L-鳥氨酸鹽酸鹽購自于Avocado Research Chemicals。 DNA低聚核苷酸得自于MWG - Biotech公司。所有其它化 學(xué)品老卩^尋自于Acros、 Aldrich、 Avocado 、 Fluka和Riedel de Haen公司。 在使用之前，任選蒸餾或通過標(biāo)準(zhǔn)方法干燥使用的溶劑。所有水溶液都 使用通過Milli - Q - Pore裝置(Millipore公司)純化的水進(jìn)行制備?？梢岳秒x散或者匯集(線性)策略進(jìn)行探針合成。通過應(yīng)用以下將 進(jìn)行描述的線性合成策略進(jìn)行探針合成，因?yàn)楹笳呖梢酝耆詣?dòng)進(jìn)行。 作為對(duì)本發(fā)明實(shí)施方案的實(shí)例，對(duì)Fmoc-保護(hù)的噻唑橙烏氨酸1和2 進(jìn)行合成。 <formula>formula see original document page 18</formula>實(shí)施例1:N5 -[9-(芴基甲氧基羰基)-L-鳥氨酸]-Ncx -[2-(1-羧 曱基-1H-全啉-4-亞基甲基)-3-曱基-笨并噻唑-3-鎮(zhèn)溴化物] 烯丙酯(Fmoc - L - Ora(TO) - 0A11)的制備逸唑橙狻酸根據(jù)Zhou等人(X. - F - Zhou te l.， Journal of Imaging Science and Technology, 1995， 39, 244 - 252)的方案進(jìn)行制備。將漆唑 橙羧酸(100 mg， 0,23 mmol)的無7Jc DMF(2.3 ml)溶液與PyBOP(145 mg， 0.279mmol)、吡咬鎮(zhèn)對(duì)甲苯橫酸鹽(58 mg， 0.232 mmol)和N -曱基嗎淋 (23 mg， 0.23 mmol)混合。在氬氣氣氛下對(duì)上述懸浮液進(jìn)行攪拌，直至 獲得澄清溶液A為止。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法用Fmoc對(duì)L-鳥氨酸的N-末端 進(jìn)4亍保護(hù)并且用烯丙基對(duì)C -末端進(jìn)4亍保護(hù)(=Fmoc - L - Orn - OAU)。 將澄清溶液A加入到Fmoc - L - Orn - OAll(lOO mg， 0.23 mmol)和N -甲基嗎啉(23 mg, 0.23 mmol)的DMF(2.3 ml)溶液中。在氬氣氣氛下將上 述反應(yīng)混合物攪拌12小時(shí)。在真空下將溶劑除去，將所得殘余物吸收 在甲醇(2ml)中。攪拌l小時(shí)之后，將固體濾出，然后用曱醇(5ml)洗滌。 通過柱色譜(氯仿:甲醇97:3, 1%甲酸)對(duì)所得粗產(chǎn)品進(jìn)行純化。得到118 mg為橙色固體形式的Fmoc-L-Orn(TO)-OAll，對(duì)應(yīng)的收率為63%。Rf(氯仿:甲醇80:20, 1%曱酸)=0.56。實(shí)施例2:N5 -[9-(芴基甲氧基羰基)-1-鳥氨酸]-Noc -[2-(1-羧 甲基-1H -喹啉-4 -亞基甲基)-3 -甲基-苯并噻唑-3 -鎮(zhèn)溴化
物]OH(Fmoc - L - Orn(TO) - OH)l的制備將Fmoc - L - Om(TO) — OA11(81 mg, 0.1 mmol)的THF(5 ml)溶液與 N-甲基苯胺(11.3 mg, 0.1 mmol)混合，并且將所得溶液脫氣幾次。在 加入[Pd(PPh3)4](12mg， 0.01mmol)之后，將所得混合物在排除光線情況 下攪拌14小時(shí)。將溶劑在真空下除去。將所得殘余物溶于曱醇(4ml)中 并且將所得沉淀濾出。通過柱色鐠(氯仿:甲醇97:3， 1%甲酸)對(duì)所得粗產(chǎn) 品進(jìn)行純化。得到53 mg為橙色固體形式的產(chǎn)品Fmoc-L-Orn(TO)-OH(l)，相應(yīng)的收率為68%。Rf(氯仿:曱醇80:20， 1%曱酸)=0.22。實(shí)施例3:N5 -[9-(芴基曱氧基羰基)-D-鳥氨酸]-Not - [2 - (1 -羧 甲基-1H -喹啉-4 -亞基甲基)-3 -曱基-苯并噻唑-3 -鎮(zhèn)溴化物] 烯丙酯(Fmoc - D - Orn(TO) - 0A11)的制備噢唑橙羧酸根據(jù)Zhou等人(X. - F - Zhou te l., Journal of Imaging Science and Technology, 1995， 39， 244 - 252)的方案進(jìn)行制備。將蓬峻 橙羧酸(100 mg， 0.23 mmol)的無水DMF(2.3 ml)溶液與PyBOP(145 mg, 0.279 mmol)、吡!t鎮(zhèn)對(duì)甲苯磺酸鹽(58 mg， 0.232 mmol)和N -曱基嗎啉 (23 mg, 0.23 mmol)混合。在氬氣氣氛下對(duì)上述懸浮液進(jìn)行攪拌，直至 獲得澄清溶液A為止。沖艮據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法用Fmoc對(duì)D-鳥氨酸的N-末端 進(jìn)行保護(hù)并且用烯丙基對(duì)C-末端進(jìn)行保護(hù)(- Fmoc-D-Orn-OAll)。 將澄清溶液A力口入到Fmoc - D - Orn — OAll(lOO mg, 0,23 mmol)和N -甲基嗎啉(23 mg， 0.23 mmol)的DMF(2.3 ml)溶液中。在氬氣氣氛下將上 述反應(yīng)混合物攪拌12小時(shí)。在真空下將溶劑除去，將所得殘余物吸收 在甲醇(2ml)中。攪拌1小時(shí)之后，將固體濾出，然后用甲醇(5ml)洗滌。 通過柱色語(氯仿:曱醇97:3， 1%曱酸)對(duì)所得粗產(chǎn)品進(jìn)行純化。得到103 mg為橙色固體形式的Fmoc-D-Orn(TO)-OAll，對(duì)應(yīng)的收率為55%。Rf(氯仿曱醇80:20， 1%曱酸)=0.56。實(shí)施例4:N5 -[9-(芴基甲氧基羰基)-D-烏氨酸]-Na -[2-(1 -羧 曱基-1H-壹啉-4-亞基曱基)-3-曱基-苯并噻唑-3 -鋃淡化 物]OH(Fmoc - D - Orn(TO) - OH)2的制備將Fmoc - D - Om(TO) - OA11(81 mg， 0.1 mmol)的THF(5 ml)溶液與N-甲基苯胺(11.3 mg， 0.1 mmol)混合，并且將所得溶液脫氣幾次。在 加入[Pd(PPh3)4](12mg， 0.01mmol)之后，將所得混合物在排除光線情況 下攪拌14小時(shí)。將溶劑在真空下除去。將所得殘余物溶于甲醇(4ml)中 并且將所得沉淀濾出。通過柱色語(氯仿:甲醇97:3， 1%曱酸)對(duì)所得粗產(chǎn) 品進(jìn)行純化。得到52 mg為橙色固體形式的產(chǎn)品Fmoc-D-Orn(TO)-OH(l)，相應(yīng)的收率為65%。Rf(氯仿:曱醇80:20， 1%甲酸)=0,22。實(shí)施例5:探針的固相合成 NovaSyn TGR固相的負(fù)栽對(duì)固相(500mg， 0.29mmol/g)進(jìn)行洗滌(3 x二氯甲烷，3x二甲基甲 酰胺，3x二氣曱烷，3x二曱基甲酰胺)。在二甲基曱酰胺(10ml)中，將 固相放置溶脹30分鐘。為了進(jìn)行預(yù)活化，將(苯并三唑-1 -基氧基)三 吡咯烷子基磷鎮(zhèn)六氟磷酸鹽(PyBOP吸301.2mg， 0.58mmol)和N-甲基嗎 淋(87.7 mg， 0.87 mmol)力。入到Fmoc -保護(hù)的甘氨酸(172.3 mg， 0.58 mmol)的二甲基甲酰胺(5.8ml)溶液中。培養(yǎng)3分鐘之后，將獲得的溶液 與固相混合。再另外培養(yǎng)4小時(shí)之后，對(duì)所得固相進(jìn)行洗滌C3x二甲基 甲酰胺，3x二氯甲烷，3x二甲基甲酰胺)，并且用乙酸酐的吡啶溶液 (1:4, 5 ml)對(duì)未反應(yīng)的基團(tuán)進(jìn)行阻斷。在5分鐘之后，重復(fù)上述阻斷步 驟。對(duì)所得固相進(jìn)行洗滌(3x二甲基曱酰胺，3x二氣甲烷，3x二甲基 甲酰胺和5x二氯甲烷)，并且最后在真空中對(duì)其進(jìn)行干燥。利用自動(dòng)合成器進(jìn)行的合成根據(jù)以下一般的加工方案，在自動(dòng)合成器(得自于Intavis AG公司的 Intavis ResPep)上對(duì)4笨4十進(jìn)4亍合成在二曱基曱酰胺(2 ml)中，將負(fù)栽的固相進(jìn)行放置溶脹。30分鐘之 后，將溶脹的固相轉(zhuǎn)入合成器中。用二甲基曱酰胺(180 nl)洗滌2次。Fmoc除去:將固相與二曱基曱酰胺/哌啶(4:l， 100 yl)混合。在2 分鐘之后，重復(fù)上述方法，并且最后用DMF(lxl80 jul， 3x100 m 1 和1x180 jul)洗滌所得固相。偶聯(lián):將所得固相懸浮在4當(dāng)量欲進(jìn)行偶聯(lián)的Fmoc-保護(hù)的結(jié)構(gòu) 單元和8當(dāng)量N-曱基嗎啉的二曱基曱酰胺的溶液(結(jié)構(gòu)單元在NMP中
的濃度0.3M，通過與3.6當(dāng)量lH-苯并三唑錫-l-[二(二曱基氨基) 亞甲基]-5 -氯-六氟磷酸鹽(HCTU)培養(yǎng)預(yù)活化8分鐘)中。30分鐘之 后，對(duì)所得固相進(jìn)行洗滌(2x 180 Ml二甲基甲酰胺)。封端:通過用乙酸肝/2，6-二曱基吡啶/吡咬(5:6:89, 100 pl)處理3 分鐘，進(jìn)行封端。隨后，對(duì)所得固相進(jìn)行洗滌(2x 180 jul二甲基曱酰胺， 1 x 100 Ml二曱基甲酰胺)。根據(jù)以上詳述的方案使化合物1和2進(jìn)行偶聯(lián)，同時(shí)為了改良溶解 性，加入PPTS(2mg， 8 Mmol)。所述偶聯(lián)進(jìn)行兩次。從固相中除去:使胱氨酸甲酯鹽酸鹽(5mg， 29卩mol)的三氟乙酸/ 間甲酚/水(37:2:l， lml)溶液穿過預(yù)干燥的固相40分鐘。所得固相用三 氟乙酸(500 Ml)進(jìn)行洗滌。在真空中對(duì)合并的濾液進(jìn)行濃縮。純化:將冷乙醚加入到濃縮的除去溶液中。對(duì)沉淀進(jìn)行離心并且將 上清液除去。將所得殘余物吸收在水中，并且利用用水平衡的 SepPak⑧C18柱對(duì)其進(jìn)行預(yù)純化。通過HPLC和MALDI - TOF質(zhì)語，對(duì) 梯度洗脫之后獲得的有色洗脫物(l x 20:80乙腈:H20: 0.1%三氟乙酸；1 x 40:60乙腈:1120 : 1%三氟乙酸；1 x 80:20乙腈:1120:0.1%三氟乙酸；1 x 80:20乙腈:H20 : 0.1%三氟乙酸；各2ml)進(jìn)行分析，并且通過半制備 HPLC對(duì)其進(jìn)行純化。使用探針的實(shí)施例以下兩個(gè)實(shí)施例舉例說明，例如，其中探針可以用于均相DNA檢 測的方式和表明與現(xiàn)有技術(shù)的對(duì)比。實(shí)施例6:與噻唑橙-氨基乙基甘氨酸探針相比，用噻唑橙-L-鳥氨酸 -和噢唑橙-D -鳥氨酸-探針進(jìn)行的均相DNA檢測在25'C下，使用Perkin-Elmer公司的光語儀LS 50B記錄焚光光 譜。該測定在pH7的磷酸鹽緩沖液(100mMNaCl， 10 mM Na2HP04， 0.1 mMEDTA)中進(jìn)行。在所有情形中，使用1 nmol DNA把體和I nmol 在1 ml緩沖溶液中的具體PNA探針進(jìn)行雜化。使用的PNA探針具有一 般序列Ac - gccgta - O - tagccg - Gly - NH2，其中O為已經(jīng)連接在氨基 乙基甘氨酸-、D -鳥氨酸-或者L-鳥氨酸-骨架上的噻唑橙染料。 DNA耙體具有一般序列5'-CGGCTAXTACGGC，其中X為雙重結(jié)構(gòu)中 與堿基替代物相對(duì)的核堿基，即C、 T、 A或者G。圖l表明了在加入 DNA靶體之前和之后，取決于與噻唑橙連接的骨架結(jié)構(gòu)的作用和取決于 與堿基替代物相對(duì)的堿基的作用，測定的探針熒光強(qiáng)度之間的比例。結(jié) 果表明，例如，在所有情形中，L-鳥氨酸骨架都產(chǎn)生比氨基乙基甘氨 酸骨架更高的熒光信號(hào)。在所有四種情形中，D-鳥氨酸骨架都產(chǎn)生比 L-鳥氨酸骨架微弱的熒光信號(hào)。同氨基乙基甘氨酸骨架相比，在三種 情形中D-鳥氨酸骨架產(chǎn)生比氨基乙基甘氨酸骨架更強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，在 一種情形中強(qiáng)度相等。該實(shí)施例還表明，通過適當(dāng)選擇探針序列可以最 大化通過雜化作用引起的熒光增強(qiáng)。實(shí)施例7:同噻唑橙-氨基乙基甘氨酸探針相比，用噻唑橙-L-鳥氨酸 -和漆唑橙-D -鳥氨酸-探針進(jìn)行的單堿基突變檢測在25。C下，使用Perkin-Elmer公司的光語儀LS 50B記錄焚光光 譜。該測定在pH7的磷酸鹽緩沖液(100mMNaCl， 10 mM Na2HP04， 0.1 mM EDTA)中進(jìn)行。在所有情形中，使用1 nmol DNA耙體和1 nmol 在1 ml緩沖溶液中的具體PNA探針進(jìn)行雜化。使用的PNA探針具有一 般序列Ac-gccgta-O-tagccg-Gly-NH2，其中O為已經(jīng)連接在氨基 乙基甘氨酸-、D-鳥氨酸-或者L-烏氨酸-骨架上的噻唑橙染料。 DNA輩巴體具有一般序列5' - CGGCTXTTACGGC，其中X為DNA耙體 中的單堿基突變，即C、 T、 A或者G。 X = A為完全配對(duì)的雙重結(jié)構(gòu)。 圖2表明了在加入DNA靶體之后和之前，取決于與噻唑橙連接的骨架 結(jié)構(gòu)的作用和取決于存在于靶體中的單堿基突變的作用，測定的探針熒 光強(qiáng)度之間的比例。結(jié)果表明，與氨基乙基甘氨酸探針相比，鳥氨酸探 針在識(shí)別單堿基突變中通常具有更高的特異性。D-鳥氨酸探針通常顯 示出較L-鳥氨酸探針微弱的熒光信號(hào)。在L-鳥氨酸的情形中，完全 配對(duì)的雙重結(jié)構(gòu)與含有錯(cuò)配的多種復(fù)本之間的信號(hào)比為6-12，對(duì)于D -鳥氨酸，觀察的比例為8-12。該實(shí)施例表明，D-烏氨酸探針通常 具有更高的特異性。實(shí)施例8:用蓬唑橙-氨基乙基甘氨酸-、逸唑橙-L -鳥氨酸-和逸唑 橙-D-鳥氨酸-探針進(jìn)行的各種雙重結(jié)構(gòu)的熔化溫度的測定利用得自于Varian公司的UV - VIS光譜儀(Cary 100)，在水中對(duì)探
針-DNA-配合物的熔化曲線進(jìn)行記錄。該測定利用0.3'C/分鐘的梯度 進(jìn)行，其中在85'C - 15'C測定兩次和15'C-85'(3下進(jìn)行兩次測定。熔 化曲線的拐點(diǎn)確定為具體雙重結(jié)構(gòu)的熔化溫度。使用兩種具有序列5'-AGTGAAATGTTATACGAAACT - 3'(匹配把體)和5' - GAAATGCTA TACGAA - 3'(錯(cuò)配靶體)的DNA靶體。使用的探針是一般序列為N-ttcgtat - 0 - acatttc - Lys - C的化合物，其中0為連接在氨基乙基甘氨 酸-、D-鳥氨酸-或者L-鳥氨酸-骨架上的噱唑橙。對(duì)多種雙重結(jié) 構(gòu)，測定了以下熔化溫度氨基乙基甘氨酸L-鳥氨酸D-鳥氨酸Tm(匹配)59'C59 。C55。CTm(錯(cuò)配)37 。C38。C35 。CATm22'C20 。C21°C該實(shí)施例表明，在鳥氨酸探針的情形中，雙重結(jié)構(gòu)沒有通過改性(擴(kuò) 展)骨架結(jié)構(gòu)而被顯著去穩(wěn)定。此外，匹配和不匹配雙重結(jié)構(gòu)的熔化溫度 的差異在試驗(yàn)誤差范圍內(nèi)。該試驗(yàn)表明，由于鳥氨酸骨架而導(dǎo)致的匹配 和不匹配雙重結(jié)構(gòu)之間的增強(qiáng)差異可以歸于堿基替代物環(huán)境的改變，而 不是熔點(diǎn)的改變。這使得對(duì)于單堿基差異的探針的應(yīng)用性在寬的溫度范 圍內(nèi)是可能的。
權(quán)利要求
1.一種以下通式的PNA探針其中PNA1為任何序列和長度的肽核酸鏈，優(yōu)選2-100個(gè)堿基的序列，特別優(yōu)選2-10個(gè)堿基的序列，PNA2為任何序列和長度的肽核酸鏈，優(yōu)選2-100個(gè)堿基的序列，特別優(yōu)選2-10個(gè)堿基的序列，A為亞甲基基團(tuán)或者CHR或者CR2類型的取代碳部分(其中R為氫或者有機(jī)殘基，優(yōu)選為取代或者未被取代的甲基、此外優(yōu)選取代或未被取代的烷基，此外優(yōu)選取代或未被取代的苯基)，優(yōu)選為亞甲基基團(tuán)，B為亞甲基基團(tuán)或者CHR或者CR2類型的取代碳部分(其中R為氫或者有機(jī)殘基，優(yōu)選為取代或者未被取代的甲基、此外優(yōu)選取代或未取代的烷基，此外優(yōu)選取代或未取代的苯基)，取代或者未被取代的氨基，或周期表第五或者第六主族原子，優(yōu)選O或者S，特別優(yōu)選為亞甲基基團(tuán)，C為亞甲基基團(tuán)或者CHR或者CR2類型的取代碳部分(其中R為氫或者有機(jī)殘基，優(yōu)選為取代或者未被取代的甲基、此外優(yōu)選取代或未被取代的烷基，此外優(yōu)選取代或未被取代的苯基)，取代或者未被取代的氨基，或周期表第五或者第六主族原子，優(yōu)選O或者S，特別優(yōu)選為亞甲基基團(tuán)，m為1-5的自然數(shù)，優(yōu)選1，n為1-5的自然數(shù)，優(yōu)選1，o為1-5的自然數(shù)，優(yōu)選1，X為亞甲基基團(tuán)或者CHR或者CR2類型的取代碳部分(其中R為氫或者有機(jī)殘基，優(yōu)選為取代或者未被取代的甲基、此外優(yōu)選取代或未被取代的烷基，此外優(yōu)選取代或未取代的苯基)，NH或NR類型的取代或者未被取代的氨基(其中R為氫或有機(jī)殘基，優(yōu)選取代或未被取代的甲基、此外優(yōu)選取代或未被取代的烷基、此外優(yōu)選取代或未被取代的苯基)、或周期表第五或者第六主族的原子，優(yōu)選O或者S，特別優(yōu)選NH基團(tuán)，p為0-10的自然數(shù)，優(yōu)選1-6的數(shù)，R為熒光性通用堿基替代物，其特征在于，其具有熒光性并且能夠插入DNA內(nèi)，優(yōu)選花青染料，此外優(yōu)選溴化二氨乙苯啡啶，此外優(yōu)選為取代蒽，此外優(yōu)選吖啶染料，此外優(yōu)選所述染料選自MolecularProbes公司出售的染料PO-PRO-1，BO-PRO-1，YO-PRO-1，TO-PRO-1，JO-PRO-1，PO-PRO-1，PO-PRO-3，LO-PRO-1，BO-PRO-3，YO-PRO-3，TO-PRO-3，TO-PRO-5(和由這些化合物衍生得到的具有改性連接物結(jié)構(gòu)的熒光基團(tuán))，特別優(yōu)選噻唑橙，M為CH或者CR類型的取代碳部分(其中R為氫或者有機(jī)殘基，優(yōu)選取代或者未被取代的甲基、此外優(yōu)選取代或未被取代的烷基，此外優(yōu)選取代或未被取代的苯基)、NH或NR類型的取代氨基(其中R代表氫或有機(jī)殘基，優(yōu)選取代或未被取代的甲基，此外優(yōu)選取代或未被取代的烷基，此外優(yōu)選取代或未被取代的苯基)、或周期表第五或者第六主族的原子，優(yōu)選O或者S，特別優(yōu)選CH基團(tuán)，A′為亞甲基或CHR或CR2類型的取代的碳部分(其中R代表氫或有機(jī)殘基，優(yōu)選取代或未被取代的甲基、此外優(yōu)選取代或未被取代的烷基，此外優(yōu)選取代或未被取代的苯基)、取代或未被取代的氨基、或周期表第5或6主族的原子，優(yōu)選O或S，特別優(yōu)選亞甲基，B′為亞甲基基團(tuán)或者CHR或者CR2類型的取代碳部分(其中R為氫或者有機(jī)殘基，優(yōu)選為取代或者未被取代的甲基、此外優(yōu)選取代或未被取代的烷基，此外優(yōu)選取代或未被取代的苯基)，取代或者未被取代的氨基，或周期表第五或者第六主族的原子，優(yōu)選O或者S，特別優(yōu)選為亞甲基基團(tuán)，Y′為亞甲基基團(tuán)或者CHR或者CR2類型的取代碳部分(其中R為氫或者有機(jī)殘基，優(yōu)選為取代或者未被取代的甲基、此外優(yōu)選取代或未被取代的烷基，此外優(yōu)選取代或未取代的苯基)，優(yōu)選為亞甲基基團(tuán)，q為0-5的自然數(shù)，優(yōu)選0，r為0-5的自然數(shù)，優(yōu)選0，s為0-5的自然數(shù)，優(yōu)選0。
2. —種以下通式的探針 <formula>formula see original document page 4</formula>其中5'-NAl是任意序列和長度的核酸或者核酸類似物，其末端為3'-末端磷酸酯基，優(yōu)選長度為3-100個(gè)堿基的核酸序列，特別優(yōu)選長度 為3 - 20個(gè)堿基的核酸序列，非常特別優(yōu)選長度為3-15個(gè)堿基的核酸 序列，NA2-3'是任意序列和長度的核酸或者核酸類似物，優(yōu)選長度為3 -100個(gè)堿基的核酸序列，特別優(yōu)選長度為3-20個(gè)堿基的核酸序列， 非常特別優(yōu)選長度為3 - 15個(gè)堿基的核酸序列，或者有機(jī)殘基，優(yōu)選為取代或者未被取代的甲基、此外優(yōu)選取代或未被 取代的烷基，此外優(yōu)選取代或未取代的苯基)，優(yōu)選為亞甲基基團(tuán)， m為0-5的自然數(shù)，X為亞曱基基團(tuán)或者CHR或者CR2類型的取代碳部分(其中R為氬 或者有機(jī)殘基，優(yōu)選為取代或者未被取代的甲基、此外優(yōu)選取代或未被 取代的烷基，此外優(yōu)選取代或未被取代的苯基)，NH或NR類型的取代 或者未被取代的氨基(其中R為氫或有機(jī)殘基，優(yōu)選取代或未被取代的 甲基、此外優(yōu)選取代或未被取代的烷基、此外優(yōu)選取代或未被取代的苯 基)、或周期表第五或者第六主族的原子，優(yōu)選O或者S,特別優(yōu)選為亞 甲基基團(tuán)，或者有機(jī)殘基，優(yōu)選為取代或者未被取代的甲基、此外優(yōu)選取代或未被 取代的烷基，此外優(yōu)選取代或未被取代的苯基)，NH或NR類型的取代 或者未被取代的氨基(其中R為氬或有機(jī)殘基，優(yōu)選取代或未被取代的 甲基、此外優(yōu)選取代或未被取代的烷基、此外優(yōu)選取代或未被取代的苯 基)、或周期表第五或者第六主族的原子，優(yōu)選O或者S，特別優(yōu)選NH 基團(tuán)，Z為亞甲基基團(tuán)或者CHR或者CR2類型的取代碳部分(其中R為氬 或者有機(jī)殘基，優(yōu)選為取代或者未被取代的甲基、此外優(yōu)選取代或未被 取代的烷基，此外優(yōu)選取代或未被取代的苯基)，NH或NR類型的取代 或者未被取代的氨基(其中R為氫或有機(jī)殘基，優(yōu)選取代或未被取代的 曱基、此外優(yōu)選取代或未被取代的烷基、此外優(yōu)選取代或未被取代的苯 基)、或周期表第五或者第六主族的原子，優(yōu)選O或者S，特別優(yōu)選為亞 曱基基團(tuán)，p為0-10的自然數(shù)，優(yōu)選l-6的數(shù)，特別優(yōu)選l， q為0-10的自然數(shù)，優(yōu)選l-6的數(shù)，特別優(yōu)選l， r為O-IO的自然數(shù)，優(yōu)選l-6的數(shù)，R為熒光性通用堿基替代物，其特征在于，其具有熒光性并且能 夠插入DNA內(nèi)，優(yōu)選花青染料，此外優(yōu)選溴化二氨乙苯啡啶，此外優(yōu)選為取代蒽，此外優(yōu)選吖啶染料，此外優(yōu)選所述染料選自Molecular Probes 7>司出售的染料po-pro〗，bq proi, yo- rch tcwpro〗，joeroj, kwrrcm，PO-PRO-3' LOPR(M, TOPRCW, TOPR0-S (和由這些合物書亍生4尋到的具有改性連接物結(jié)構(gòu)的熒光基團(tuán))，特別優(yōu)選噻唑橙，M為CH或者CR類型的取代碳部分(其中R為氫或者有機(jī)殘基，優(yōu) 選取代或者未被取代的甲基、此外優(yōu)選取代或未被取代的烷基，此外優(yōu) 選取代或未取代的苯基)、NH或NR類型的取代氨基(其中R代表氫或有 機(jī)殘基，優(yōu)選取代或未被取代的甲基，此外優(yōu)選取代或未被取代的烷 基，此外優(yōu)選取代或未被取代的苯基)、或周期表第五或者第六主族的原 子，優(yōu)選O或者S,特別優(yōu)選CH基團(tuán)，A'為亞曱基或CHR或CR2類型的取代的碳部分(其中R代表氫或有 機(jī)殘基，優(yōu)選取代或未被取代的曱基、此外優(yōu)選取代或未被取代的烷 基，此外優(yōu)選取代或未被取代的苯基)、取代或未被取代的氨基、或周期 表第5或6主族的原子，優(yōu)選S，特別優(yōu)選亞甲基，n為0-5的自然數(shù)。
3. 如權(quán)利要求1和/或2之一所述的探針，其特征在于，通式結(jié)構(gòu)(I) 或者(II)的多個(gè)單元共價(jià)連接，和得到多重標(biāo)記的探針。
4. 一種制備如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的探針的方法，其通過固 相合成，優(yōu)選通過自動(dòng)固相合成。
5. 權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的探針用于進(jìn)行核酸測定的用途，優(yōu)選用于進(jìn)行均相核酸測定。
6. 權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的探針用于進(jìn)行PCR反應(yīng)的用途，優(yōu) 選用于進(jìn)行定量PCR反應(yīng)。
7. 權(quán)利要求l-3任一項(xiàng)所述的探針用于進(jìn)行多重測定的用途，其 特征在于，不同的探針通過不同的熒光堿基替代物進(jìn)行標(biāo)記。
8. 權(quán)利要求1或3所述的探針，其中所述探針包括連接熒光堿基替 代物的L-鳥氨酸，優(yōu)選所述焚光堿基替代物為噻唑橙。
9. 權(quán)利要求1或3所述的探針，其中所述探針包括連接熒光堿基替 代物的D-鳥氨酸，優(yōu)選所述熒光堿基替代物為噻唑橙。
10. —種測試試劑盒，其包括用于進(jìn)行權(quán)利要求5-7任一項(xiàng)所述的 測定所需要的試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于檢測核酸的探針，涉及制備所述探針的方法，涉及進(jìn)行檢測反應(yīng)的方法，和涉及測試試劑盒，其包含用于進(jìn)行基于探針的檢測反應(yīng)所需要的試劑。
文檔編號(hào)G01N33/68GK101128477SQ200580048571
公開日2008年2月20日 申請(qǐng)日期2005年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月23日
發(fā)明者J·伯邁斯特, L·羅格林, O·塞茨, O·科勒 申請(qǐng)人:拜爾技術(shù)服務(wù)有限責(zé)任公司