基于氟代核酸探針的雙通道傳感器檢測(cè)急早幼粒PML/RARα基因序列的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種基于氟代核糖核酸雙探針的雙通道電化學(xué)傳感器檢測(cè)急性早幼 粒細(xì)胞白血病雙鏈PML/RARa融合基因序列的方法，屬于生物傳感技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 急性早幼粒細(xì)胞白血?。ˋPL)是急性髓細(xì)胞白血?。ˋML) FAB分型中的M3亞型，是 嚴(yán)重危害人類健康的惡性血液病之一。它起病急，迅速惡化，表現(xiàn)十分兇險(xiǎn)，出血傾向明顯， 易發(fā)生彌漫性血管內(nèi)凝血，死亡率高，治療比較困難。白血病早期診斷（基因診斷）水平將 直接影響患者的治療效果及生存質(zhì)量，其重要意義不言而喻。
[0003] 目前臨床上常用的檢測(cè)方法主要有流式細(xì)胞技術(shù)、FISH技術(shù)、染色體分析法、 RT-PCR技術(shù)等，但都存在一定的局限性，如價(jià)格昂貴、操作繁瑣、靈敏度不高等。因此，研發(fā) 一種尚敏感性、尚選擇性的APL相關(guān)基因的檢測(cè)技術(shù)具有極其廣闊的臨床應(yīng)用如景。
[0004] APL最為常見(jiàn)的染色體易位為t (15 ; 17) (q22 ;q21)，其易位產(chǎn)物PML/RARa融合 基因發(fā)生于95%的APL中，是惡性克隆的標(biāo)志基因。
[0005] 臨床樣品中，待測(cè)DNA通常以雙鏈大片段形式存在，雙鏈片段中與靶標(biāo)ssDNA互 補(bǔ)的另一條DNA序列容易對(duì)DNA探針?lè)肿拥臋z測(cè)造成干擾。利用單通道電化學(xué)DNA生物 傳感器檢測(cè)基因序列，其單探針捕獲靶標(biāo)dsDNA的過(guò)程存在干擾分子識(shí)別及降低雜交效率 等不足。因此，為解決單通道電化學(xué)DNA生物傳感器的局限性，對(duì)原有單組DNA探針?lè)肿?進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)計(jì)了基于雙組探針檢測(cè)的新型傳感檢測(cè)方法，即將兩組分別與待測(cè)靶標(biāo)dsDNA 兩條序列部分互補(bǔ)的捕獲探針修飾在雙通道電化學(xué)DNA陣列傳感器不同通道的電極表面， 通過(guò)雙通道電化學(xué)陣列傳感器實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)dsDNA兩條序列的同時(shí)檢測(cè)，有利于提高探針與 dsDNA的雜交效率，有助于陣列傳感器日后實(shí)現(xiàn)對(duì)臨床實(shí)際樣品中dsDNA的直接檢測(cè)。
[0006] DNA探針?lè)肿幼鳛槎嗤ǖ离娀瘜W(xué)DNA陣列傳感器設(shè)計(jì)的關(guān)鍵，其與待測(cè)靶標(biāo)DNA 之間的序列選擇性對(duì)DNA陣列傳感器的性能具有很大的影響，而經(jīng)典傳感器中，所設(shè)計(jì) 的ssDNA探針多數(shù)存在穩(wěn)定性差的問(wèn)題。所以，研制高靈敏度和高特異性的DNA探針，并 將其應(yīng)用于與靶標(biāo)DNA序列間雜交信息的檢測(cè)具有重要意義。2' -氟代核糖核酸單體 (2' -fluoro RNA monomers, 2' -F RNA)作為一種新型的寡核酸衍生物，是通過(guò)氟元素取代 核糖C2'位的羥基，加固了 C3'內(nèi)型的N構(gòu)型，使得核糖結(jié)構(gòu)的柔韌性降低，進(jìn)而增強(qiáng)了磷 酸鹽骨架局部結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。正是因?yàn)檫@樣的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，使得2-F RNA具有抗脫氧核苷酸 酶降解的特性，同時(shí)對(duì)DNA、RNA也有很好的親和力，且其與DNA、RNA進(jìn)行雜交后所形成的雙 螺旋結(jié)構(gòu)具有更好的穩(wěn)定性，序列中每增加一個(gè)2' -氟代RNA單體修飾，即可使解鏈溫度 (Tm)值升高1~2°C，利用這一特性有助于實(shí)現(xiàn)提高探針序列對(duì)非靶標(biāo)序列的錯(cuò)配識(shí)別能 力。
[0007] 下面所述的為本發(fā)明人率先將基于2'-氟代RNA單體修飾雙探針的電化學(xué)酶鏈放 大檢測(cè)方法應(yīng)用于快速檢測(cè)PML/RAR a融合基因 dsDNA片段：本實(shí)驗(yàn)針對(duì)APL中PML/RAR a 融合基因的相關(guān)堿基序列，設(shè)計(jì)了兩組2'-F RNA單體修飾探針（包含了捕獲探針和報(bào)告探 針），與酶聯(lián)放大技術(shù)相結(jié)合構(gòu)建一種新型的"三明治"構(gòu)型雙通道電化學(xué)DNA陣列傳感模 式，并將其用于人工合成的PML/RARa融合基因 dsDNA的檢測(cè)。
[0008] 該傳感模式包含有兩組檢測(cè)探針，每組探針各包含有一條3'端修飾巰基的捕 獲探針（Capture probe,以下簡(jiǎn)稱C)和一條5'端修飾有生物素的報(bào)告探針（Reporter probe，R)，且這兩組探針（以下簡(jiǎn)稱C1/R1和以下簡(jiǎn)稱C2/R2)分別與靶標(biāo)dsDNA中相應(yīng)的 兩條ssDNA(以下簡(jiǎn)稱Sa和Sb)部分基因序列存在互補(bǔ)。其中，修飾有巰基的捕獲探針（以 下簡(jiǎn)稱Cl和C2)能夠通過(guò)自組裝分別固定到不同的工作電極表面，而過(guò)量的報(bào)告探針（以 下簡(jiǎn)稱Rl和R2)則提前加入到含有待測(cè)靶標(biāo)dsDNA的雜交溶液中進(jìn)行熱變性后置于冰浴 中以確保雜交液中的DNA序列均保持ssDNA狀態(tài)，并將修飾了 Cl和C2的兩個(gè)金電極工作 電極放入含有報(bào)告探針Rl、R2和祀標(biāo)dsDNA的待測(cè)溶液中進(jìn)行雜交反應(yīng)。通過(guò)雜交反應(yīng)， 在兩個(gè)工作電極表面形成了"三明治"傳感模式。此時(shí)生物素已通過(guò)雜交修飾到電極表面， 親和素修飾的辣根過(guò)氧化物酶可以與生物素相互識(shí)別，將辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合到工作電極 上。最后，可將工作電極置于由3,3'，5,5'_四甲基聯(lián)苯胺（TMB)和H 2O2組成的檢測(cè)底液， 通過(guò)HRP催化使得H2O2氧化TMB產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)，利用雙通道電化學(xué)工作站進(jìn)行信號(hào)采集。 若溶液中不含靶標(biāo)dsDNA，則雜交反應(yīng)無(wú)法進(jìn)行，工作電極界面上無(wú)法形成"三明治"構(gòu)型傳 感模式，那么HRP也就無(wú)法固定到電極表面，電極無(wú)法對(duì)檢測(cè)底液進(jìn)行催化，所以雙通道電 化學(xué)工作站檢測(cè)到的電流信號(hào)很弱。通過(guò)對(duì)雙通道所采集到的電流信號(hào)進(jìn)行處理，比較其 最終結(jié)果的信號(hào)變化就可以說(shuō)明雜交反應(yīng)是否進(jìn)行，溶液中是否含有靶標(biāo)dsDNA。該傳感模 式通過(guò)修飾有2'-F RNA的DNA檢測(cè)探針和酶的催化功能，極大地增強(qiáng)了該檢測(cè)方法測(cè)定雙 鏈DNA的特異性及靈敏度，從而建立了高靈敏度、高特異性的急性早幼粒細(xì)胞白血病基因 檢測(cè)方法，應(yīng)用于有效解決急性早幼粒細(xì)胞白血病早期診斷這一臨床迫切的實(shí)際問(wèn)題，無(wú) 疑具有極其重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于提供一種基于氟代核糖核酸雙探針的雙通道電化學(xué)傳感器及 其檢測(cè)急性早幼粒細(xì)胞白血病PML/RARa融合基因 dsDNA的方法，旨在解決臨床實(shí)際樣品 中DNA多以雙鏈片段形式存在，雙鏈片段中與靶標(biāo)單鏈DNA相互補(bǔ)的另一條DNA鏈容易對(duì) 探針的檢測(cè)造成干擾，影響檢測(cè)效果，且現(xiàn)有檢測(cè)方法靈敏度低、檢測(cè)周期長(zhǎng)、價(jià)格昂貴等。
[0010] 本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明所述的基于2' -氟代核糖核酸雙探針的雙通 道電化學(xué)傳感器，包含有兩組檢測(cè)探針，其特征在于每組探針包含有一條3'端修飾巰基的 捕獲探針和一條5'端修飾有生物素的報(bào)告探針，且這兩組探針?lè)謩e與靶標(biāo)急性早幼粒細(xì) 胞白血病PML/RARa融合基因 dsDNA中相應(yīng)的兩條ssDNA部分基因序列存在互補(bǔ)；其中， 兩個(gè)修飾有巰基的捕獲探針能夠通過(guò)自組裝相應(yīng)固定到位于兩個(gè)通道上的兩個(gè)具有型號(hào) 相同的金電極工作電極表面上，在兩個(gè)金電極工作電極表面未結(jié)合的位點(diǎn)通過(guò)封閉劑進(jìn)行 封閉，而過(guò)量的報(bào)告探針則提前加入到含有待測(cè)靶標(biāo)dsDNA的雜交溶液中進(jìn)行熱變性后置 于冰浴中以確保雜交液中的DNA序列均保持ssDNA狀態(tài)，并將一組中的修飾有巰基的一條 捕獲探針的金電極工作電極和另一組中的修飾有巰基的另一條捕獲探針的金電極工作電 極一同放入含有一條5'端修飾有生物素的報(bào)告探針、另一條5'端修飾有生物素的報(bào)告探 針和靶標(biāo)急性早幼粒細(xì)胞白血病PML/RARa融合基因 dsDNA的待測(cè)溶液中進(jìn)行雜交反應(yīng)， 通過(guò)雜交反應(yīng)，在兩個(gè)金電極工作電極表面形成了 "三明治"傳感模式，此時(shí)生物素已通過(guò) 雜交修飾到電極表面，加入親和素修飾的辣根過(guò)氧化物酶與生物素相互識(shí)別，將辣根過(guò)氧 化物酶結(jié)合到金電極工作電極上；所述的金電極工作電極置于由3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯 胺和H2O2組成的檢測(cè)底液中，通過(guò)辣根過(guò)氧化物酶HRP催化使得H 202氧化TMB產(chǎn)生電化 學(xué)信號(hào)，利用雙通道電化學(xué)工作站進(jìn)行信號(hào)采集，當(dāng)溶液中不含靶標(biāo)dsDNA時(shí)，則雜交反應(yīng) 無(wú)法進(jìn)行，金電極工作電極界面上無(wú)法形成"三明治"構(gòu)型傳感模式，那么辣根過(guò)氧化物酶 HRP也就無(wú)法固定到金電極工作電極表面上，金電極工作電極無(wú)法對(duì)檢測(cè)底液進(jìn)行催化， 所以雙通道電化學(xué)工作站檢測(cè)到的電流信號(hào)很弱，通過(guò)對(duì)雙通道所采集到的電流信號(hào)進(jìn) 行處理，比較所采集到的電流信號(hào)變化就能說(shuō)明雜交反應(yīng)是否進(jìn)行，溶液中是否含有靶標(biāo) dsDNA。
[0011] 所述的待檢測(cè)APL的PML/RAR a融合基因 dsDNA型別為長(zhǎng)型融合基因，所述兩組探 針中的捕獲探針和5'端修飾有生物素的報(bào)告探針均是2'-氟代核糖核酸單體探針，其中一 組探針中的一捕獲探針和一報(bào)告探針以及另一組探針中的另一捕獲探針和另一報(bào)告探針， 其中捕獲探針基因?yàn)椋?'-GCGCCG GGGAGG CAGCCA TTGAGA CCCAGA TnTTITITT-C6-SH-3'； 報(bào)告探針基因?yàn)椋?' -biotin-TCCTGC CCAACA GCAACC ACGTGG CCAGTG-3';另一捕獲探針基 因?yàn)椋?' -TCTGGG TCTCAA TGGCTG CCTCCC CGGCGC TTTTTTTTTT-C6-SH-3' ；另一報(bào)告探針基 因?yàn)椋?' -biotin-GGCTGG GCACTA TCTCTTCAGAACTGCTGC-3'。
[0012] 本發(fā)明所述的雙通道電化學(xué)傳感器檢測(cè)急性早幼粒細(xì)胞白血病PML/RARa融合 基因的方法，包括如下步驟：待檢測(cè)基因?yàn)榧毙栽缬琢＜?xì)胞白血病的PML/RARa融合基因， 95%的APL病人為t 15 ;17q22;q21，在PML和RARa基因發(fā)生斷裂時(shí)，RARa基因斷裂點(diǎn) 較為固定，發(fā)生在第2內(nèi)含子，在與RARa基因發(fā)生融合時(shí)，PML基因的斷裂點(diǎn)通常集中在 三個(gè)區(qū)域，分別稱為bcrl、bcr2和bcr3, Bcrl位于PML的第6內(nèi)含子，形成長(zhǎng)型融合基因， 約占病人的55% ;bcr2位于PML的第6外顯子，在與RARa第3外顯子融合區(qū)內(nèi)常常插入 RARa第2內(nèi)含子中的3~127bp，形成變異型融合基因，約占病人的5%;bcr3位于PML的 第3內(nèi)含子，形成短型融合基因，約占病人的40%;為了實(shí)現(xiàn)對(duì)APL的PML/RARa融合基因 的檢測(cè)，從NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)中查找長(zhǎng)型、變異型及短型PML/RARa融合基因 dsDNA的融合 位點(diǎn)，選擇位點(diǎn)前后的堿基作為人工合成的兩組檢測(cè)探針使用，檢測(cè)探針長(zhǎng)度為30堿基， 經(jīng)過(guò)同源比對(duì)，同時(shí)利用生物學(xué)軟件對(duì)兩組檢測(cè)探針與其相應(yīng)的靶標(biāo)序列兩兩間的解鏈溫 度進(jìn)行模擬，以確保探針的特異性，將對(duì)應(yīng)序列作為APL的特異性序列進(jìn)行合成，采用電化 學(xué)酶鏈放大檢測(cè)和應(yīng)用雙通道電化學(xué)工作站檢測(cè)APL的PML/RAR a融合基因 dsDNA，通過(guò)對(duì) 采集信號(hào)的計(jì)算處理實(shí)現(xiàn)對(duì)PML/RARa融合基因 dsDNA的定性定量檢測(cè)。
[0013] 所述的待檢測(cè)APL的PML/RARa融合基因型別為長(zhǎng)型融合基因作為靶標(biāo)，分 別設(shè)計(jì)了兩組2' -氟代核糖核酸單體探針，分別為一組探針的捕獲探針和報(bào)告探針以 及另一組探針的另一捕獲探針和另一報(bào)告探針，其中一組探針中的一捕獲探針基因?yàn)椋?5'-GCGCCG