一種b族鏈球菌pcr熒光探針法核酸檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種B族鏈球菌核酸檢測試劑盒，具體設(shè)及一種B族鏈球菌PCR巧光 探針法核酸檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] B族鏈球菌（groupBstreptococcus,GB巧是一種寄生于人類泌尿生殖道及下消 化道的條件致病菌，健康人群帶菌率可達(dá)35%。早在20世紀(jì)70年代B族鏈球菌就已經(jīng)被 證實為圍產(chǎn)期母嬰感染的重要致病菌之一。定植于產(chǎn)婦生殖道的B族鏈球菌，可在分娩時 垂直傳播給新生兒，而新生兒B族鏈球菌感染所引起的新生兒敗血癥、腦膜炎和肺炎等癥 致死率極高，并可導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。2010年美國疾病預(yù)防中屯、制定了《圍產(chǎn)期GBS預(yù) 防指南》，建議孕婦于妊娠35-37周進行GBS篩查。
[0003] 目前，B族鏈球菌的診斷方法主要有培養(yǎng)法和免疫學(xué)方法，其中，培養(yǎng)法的特異性 和敏感性高，但臨床檢測時間過長（至少需要24h-4她，甚至更長時間），過程繁瑣，需要 使用特殊的培養(yǎng)介質(zhì)W及易受雜菌影響，不適用于大范圍檢測。免疫學(xué)方法，如：乳膠凝 集實驗（latexagglutination,LA)，酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzymelinkedimmunosorbent assay,ELISA)，協(xié)同凝集試驗(^countercurrentimmunoelectrophotesis,CoA)及對流免疫 電泳kountercurrentimmunoelectrophotesis,CIE；)等，雖然特異性可W高達(dá) 95%，但是 敏感性不夠，檢出率較低。美國抑A已于1997年發(fā)出了運些方法假陰性和假陽性率均很高 的可行度警告，加之其試劑盒價格昂貴，所W運些方法的應(yīng)用迅速減少。
[0004] 近年來，聚核酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)法漸漸顯現(xiàn)了其在檢測上的優(yōu)勢，標(biāo)準(zhǔn)PCR過程分 為Ξ步：DNA變性（90°C-96°C):雙鏈DNA模板在熱作用下，氨鍵斷裂，形成單鏈DNA;退火 (60°C-65°C):系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈；延伸（70°C-75°C):在 Taq酶（在72°C左右，活性最佳）的作用下，W脫氧核糖核巧Ξ憐酸（dNT巧為原料，從引物 的3'端開始W從5' - 3'端的方向延伸，最終合成與模板互補的DNA鏈。每一循環(huán)經(jīng)過 變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。
[0005] 運用PCR技術(shù)檢測主要設(shè)及到兩個方面：核酸的提取和核酸的擴增檢測。目前，國 內(nèi)臨床上主要采用煮沸法對B族鏈球菌的核酸進行提?。合葘⒎置谖飿颖緷饪s、洗涂，再加 裂解液，煮沸，高速離屯、，取上清為模板。步驟繁瑣，而且各廠家濃縮和裂解效率差異較大， 樣本依賴性強，對于較復(fù)雜的樣本提取效率低。
[0006] 巧光定量PCR技術(shù)是基于傳統(tǒng)PCR技術(shù)并結(jié)合光譜技術(shù)而發(fā)展起來的一種更靈 敏、更特異、更精確的核酸檢測技術(shù)。檢測結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性高，能動態(tài)反應(yīng)患者治療前、后 病原體動態(tài)變化及與臨床的關(guān)系，且整個過程中避免了傳統(tǒng)PCR需后處理的問題，減少了 污染。實時巧光定量PCR技術(shù)使用一種帶有巧光檢測裝置的PCR擴增儀，巧光檢測裝置能夠 按照一定的程序周期性地發(fā)出特定波長的激發(fā)光，收集檢測巧光信號，通過檢測巧光信號 的動態(tài)變化實時反映PCR的每個循環(huán)的擴增水平，試驗結(jié)束后可通過軟件自動分析獲得擴 增曲線，根據(jù)擴增曲線與巧光闊值線的交點（即Ct值）W及擴增曲線的形狀，可W判斷陰 陽性結(jié)果；如果同一反應(yīng)中有已知濃度的定量參考品或標(biāo)準(zhǔn)品，則可w通過軟件自動分析 獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，由此實現(xiàn)對未知樣本的定值（即定量檢測）。與傳統(tǒng)的PCR相對比，其在反 應(yīng)體系中增加了一條兩端分別標(biāo)記巧光報告基團和澤滅基團的探針。探針結(jié)構(gòu)完整時，巧 光報告基團發(fā)出的巧光能量被澤滅基團吸收，呈現(xiàn)澤滅效應(yīng)；如果擴增過程中有祀序列的 存在，隨著目標(biāo)片段的延伸，探針分子逐漸被Taq酶水解切斷，巧光報告基團與澤滅基團相 互解離，阻斷了二者間巧光能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，巧光報告基團發(fā)出的巧光信號被巧光檢測裝置 收集。隨著擴增的進行，巧光信號隨著目的片段的擴增而呈現(xiàn)線性增強。試驗結(jié)束后，可W 通過巧光PCR儀自帶的軟件自動分析數(shù)據(jù)，可W獲得陰陽性結(jié)果和樣本濃度的定值結(jié)果， 因此，該技術(shù)在祀多核巧酸樣品的檢測和定量分析中，已逐漸取代傳統(tǒng)的PCR方法，得到十 分廣泛的應(yīng)用。研究顯示，實時巧光PCR檢測方法與標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)菌培養(yǎng)方法在GBS檢測的敏 感性和特異性方面均達(dá)90%W上，達(dá)到篩檢標(biāo)準(zhǔn)，已經(jīng)得到美國食品和藥品管理局（抑A) 的批準(zhǔn)并應(yīng)用于臨床。因此，在國內(nèi)采用實時巧光PCR技術(shù)進行GBS篩檢是最快速、可靠的 方法。
[0007] 目前，國內(nèi)已有數(shù)種基于實時巧光PCR技術(shù)檢測B族鏈球菌-DNA的試劑盒應(yīng)用于 臨床檢測中，運些試劑盒所提供的B族鏈球菌-DNA提取方法主要是煮沸法。在實際臨床應(yīng) 用中，此方法暴露出諸多不足之處：1)核酸提取過程較復(fù)雜，樣本處理耗時長，且在處理樣 本時，經(jīng)過煮沸裂解、高速離屯、富集DNA等多個步驟，DNA損耗嚴(yán)重，且對高濃度的樣本存在 裂解和富集不充分的問題；2)同時由于采用了水浴或金屬浴的高溫加熱步驟，容易造成氣 溶膠污染；3)檢測靈敏度偏低，約在lOOOcopies/ml左右；4)沒有設(shè)置陽性內(nèi)對照（即內(nèi) 標(biāo)），無法監(jiān)控假陰性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明提供一種B族鏈球菌PCR巧光探針法核酸檢測試劑盒，W解決現(xiàn)有技術(shù)中 試劑盒檢測效果差、靈敏度低的問題。
[0009] 本發(fā)明提供一種核酸釋放劑在B族鏈球菌檢測中的應(yīng)用，所述核酸釋放劑包含莎 梵婷0.05-0.51111/1、氯化鐘 100-3001111/1、十二烷基橫酸鋼0.05-3%和乙醇0.01-1%。
[0010] 本發(fā)明還提供一種B族鏈球菌PCR巧光探針法核酸檢測試劑盒，所述B族鏈球菌 PCR巧光探針法核酸檢測試劑盒包括：核酸釋放劑和PCR反應(yīng)液，所述核酸釋放劑包含莎梵 婷0. 05-0. 氯化鐘100-300mM/l、+二烷基橫酸鋼0. 05-3%和乙醇0. 01-1% ;所述 PCR反應(yīng)液包括用于祀多核巧酸擴增的上游引物、下游引物W及用于祀多核巧酸檢測的探 針。
[0011] 優(yōu)選的，所述用于祀多核巧酸檢測的探針序列為：5'-CAAATAACATTTCATATGTTATCT GGCAACAAAAGT-3^ 〇
[0012] 優(yōu)選的，所述用于祀多核巧酸擴增的上游引物和下游引物的序列分別為：上游引 物：5' -TTCTCAGCCTTCGCACGCG-3' ；下游引物：5' -AGATGGCACGACAGAGAATGGAAG-3'。
[0013] 優(yōu)選的，所述B族鏈球菌PCR巧光探針法核酸檢測試劑盒還包括內(nèi)標(biāo)，所述內(nèi)標(biāo)序 列為：5，-TTCTCAGCCTTCGCACGCGTATTACTCTTGTCACAGCGTCGTTTGCGGTCTGTGGTATGCACGAAGGTC TTTGAAGTTTGTGCTGTCTTCCATTCTCTGTCGTGCCATCT-3 >。
[0014] 優(yōu)選的，所述B族鏈球菌PCR巧光探針法核酸檢測試劑盒還包括用于內(nèi)標(biāo)片段擴 增的上下游引物和用于檢測內(nèi)標(biāo)的探針，且所述檢測內(nèi)標(biāo)的探針序列為：5' -ATTACTCTTGTC ACAGCGTCGTTTGCG-3'。
[001引優(yōu)選的，所述B族鏈球菌PCR巧光探針法核酸檢測試劑盒中還包括酶混合液，所述 酶混合液中包括耐熱DNA聚合酶和尿喀晚DNA糖基化酶，同時在所述PCR反應(yīng)液中還包括 加TP。
[0016] 優(yōu)選的，所述B族鏈球菌PCR巧光探針法核酸檢測試劑盒還包括陽性對照和陰性 對照。
[0017] 本發(fā)明還提供一種B族鏈球菌PCR巧光探針法核酸檢測試劑盒，所述B族鏈球菌 PCR巧光探針法核酸檢測試劑盒包括PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液包括用于祀多核巧酸擴 增的上游引物、下游引物W及用于祀多核巧酸檢測的探針，且所述用于祀多核巧酸擴增的 上游引物和下游引物的序列分別為：上游引物：5' -TTCTCAGCCTTCGCACGCG-3';下游引物： 5' -AGATGGCACGACAGAGAATGGAAG-3'。
[0018] 本發(fā)明還提供一種B族鏈球菌PCR巧光探針法核酸檢測試劑盒，所述B族鏈球菌 PCR巧光探針法核酸檢測試劑盒包括PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液包括用于祀多核巧酸擴增 的上游引物、下游引物W及用于祀多核巧酸檢測的探針，且所述用于祀多核巧酸檢測的探 針序列為：5'-CAAATAACATTTCATATGTTATCTGGCAACAAAAGT-3，。
[0019] 本發(fā)明的實施例提供的技術(shù)方案可W包括W下有益效果：
[0020] 本發(fā)明提供一種B族鏈球菌PCR巧光探針法核酸檢測試劑盒，所述B族鏈球菌PCR 巧光探針法核酸檢測試劑盒包括：核酸釋放劑和PCR反應(yīng)液，所述核酸釋放劑包含莎梵婷 0.05-0.51111/1、氯化鐘100-3001111/1、十二烷基橫酸鋼0.05-3%和乙醇0.01-1%;所述口〇? 反應(yīng)液包括用于祀多核巧酸擴增的上游引物、下游引物W及用于祀多核巧酸檢測的探針。