專利名稱：開關式核酸適體探針及其在腫瘤活細胞及活體檢測中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于核酸檢測技術領域，尤其涉及一種核酸適體探針及其在腫瘤檢測中的應用。
背景技術：
腫瘤是威脅人類健康的常見疾病。對腫瘤細胞進行準確的免疫分型有利于實現(xiàn)腫 瘤的早期診斷和治療，從而提高腫瘤治愈率?？乖?抗體反應是免疫學診斷的基礎，過去幾 十年間抗體技術的迅速發(fā)展對腫瘤診斷及治療相關研究做出了巨大貢獻，然而近年來核酸 適體的出現(xiàn)卻使得抗體技術受到前所未有的挑戰(zhàn)。核酸適體(又稱Aptamer)是利用核苷酸之間嚴格的識別能力和親和力而設計的 人工合成寡核苷酸，并通過指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進化(systematic evolution of ligands by exponentialenrichment, SELEX)技術篩選而獲得。核酸適體不僅具有類似抗體對靶標 高特異性和高親和力的特點，更在許多方面優(yōu)于抗體，如分子量小、無免疫原性、靶標種類 豐富(包括酶、生長因子、抗原、基因調(diào)節(jié)因子、細胞黏附分子、完整的腫瘤細胞等)、合成方 法簡單且重復性好、修飾靈活以及便于長期貯存和常溫運輸?shù)鹊?。這些特性使得核酸適體 作為腫瘤診斷探針得到了廣泛的關注和認可，而基于核酸適體的腫瘤識別與檢測方法正逐 漸成為一種新的、普遍適用的技術，為腫瘤細胞分型、診斷和治療相關領域的發(fā)展帶來了新 的契機。"Aptamers Evolved from Live Cells as Effective Molecular Probes for Cancer Study. ”《Proc. Natl. Acad. Sci. USA》2006，103(32) 11838-11843 ；Dihua Shangguan, Ying Li，Zhiwen Tang, et al.發(fā)展了一種以全細胞為靶標的 cell-SELEX 技 術，針對白血病細胞篩選出一組特異性核酸適體，并利用熒光染料標記的核酸適體成功實 現(xiàn)了對正常人骨髓抽吸混合細胞中目標白血病細胞的有效識別與檢測。隨后，該研究小組 又采用cell-SELEX技術篩選出分別針對淋巴瘤、肝癌、肺癌等多種腫瘤細胞的一系列核酸 適體，并將其廣泛應用于多種腫瘤細胞或組織的分型與檢測中。然而，目前基于核酸適體建 立的腫瘤檢測方法，還主要是采用單一的信號標記手段如熒光或放射性標記，僅僅將核酸 適體作為靶向分子，利用其與目標和非目標細胞之間的親和力差異來實現(xiàn)對腫瘤細胞的識 另O。由于核酸適體與非目標細胞之間必然存在一定的非特異性吸附，這類方法無法滿足對 復雜混合體系中腫瘤細胞的便捷、快速、高特異和高靈敏的分析要求，限制了臨床檢測中腫 瘤早期診斷的實現(xiàn)和相關治療的開展。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題是克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種具有較高穩(wěn)定性、特 異性、靈敏性的開關式核酸適體探針，還提供一種操作簡單、快速、靈敏、特異、成本低的開 關式核酸適體探針在腫瘤活細胞及活體檢測中的應用方法。
為解決上述技術問題，本發(fā)明提出的技術方案為一種開關式核酸適體探針，該核 酸適體探針包括探針本體和分別連接于該探針本體兩端的熒光發(fā)生單元和熒光熄滅單元， 所述探針本體包含有對目標腫瘤細胞具有特異性識別功能的核酸適體片段(設為片段1) 和與該核酸適體片段形成6 12對堿基互補序列(連續(xù)的)的核酸片段(設為片段2)，所 述核酸適體片段和核酸片段通過一 7 15nm長的連接片段(設為片段3)連接形成一發(fā)夾 型結構；所述核酸片段競爭性雜交所述核酸適體片段的能力弱于所述目標腫瘤細胞雜交核 酸適體片段的能力。該技術方案中，所述片段1具有對目標腫瘤細胞的特異性識別能力；所 述片段2由于與片段1形成6-12對堿基互補序列，因此片段2的主要作用是與片段1的部 分序列雜交以形成穩(wěn)定的發(fā)夾構型，同時其雜交能力不會影響目標腫瘤細胞對片段1的競 爭性結合；所述片段3的主要作用是將片段1和片段2連接成一條探針本體。所述片段2 應當是與片段1靠近端部熒光發(fā)生(或熄滅)單元處的序列互補，以使得探針兩端的熒光 發(fā)生單元和熒光熄滅單元能盡可能靠近。上述的開關式核酸適體探針中，所述熒光發(fā)生單元優(yōu)選為熒光染料分子或熒光納 米顆粒；所述熒光熄滅單元優(yōu)選為熒光熄滅基團或者為具有熒光淬滅效果的功能化納米材 料。上述的開關式核酸適體探針中，所述熒光染料分子優(yōu)選為熒光素、羅丹明或Cy5; 所述熒光納米顆粒優(yōu)選為包裹熒光染料的二氧化硅納米顆?；驘晒饬孔狱c。所述熒光熄滅 基團優(yōu)選為DABCYL、BHQ1或BHQ2 ；所述具有熒光淬滅效果的功能化納米材料優(yōu)選為金納米 顆粒或碳納米管。本領域人員可以自行確定和選擇熒光發(fā)生單元和熒光熄滅單元的實施組 合方式，例如熒光素與DABCYL、熒光素與BHQ1、四甲基羅丹明與BHQ2、四甲基羅丹明與金納 米顆粒、Cy5與金納米顆粒、Cy5與碳納米管、包裹熒光染料的二氧化硅納米顆粒與BHQ2、熒 光量子點與BHQ2等等。上述的開關式核酸適體探針中，所述核酸適體片段優(yōu)選是指通過指數(shù)富集的配體 系統(tǒng)進化技術(簡稱SELEX技術)篩選出來的腫瘤細胞特異性核酸適體。更優(yōu)選的，所述 核酸適體片段是指對人急性淋巴細胞白血病T淋巴細胞(簡稱CCRF-CEM腫瘤細胞)具有 特異性識別能力的核酸適體序列1或者對人B淋巴細胞瘤細胞(簡稱Ramos細胞)具有特 異性識別能力的核酸適體序列2或者對小鼠肝細胞瘤細胞(簡稱MEAR細胞)具有特異性 識別能力的核酸適體序列3 ；其中，所述核酸適體序列1的核苷酸序列為5' -ATC TAA CTG CTG CGC CGC CGG GAA AAT ACT GTA CGG TTA GA-3'；所述核酸適體序列2的核苷酸序列為5，-MC ACC GTG GAG GAT AGT TCG GTG GCT GTT CAG GGT CTC CTC CCG GTG-3 ‘；所述核酸適體序列3的核苷酸序列為5' -AGT CCA TTT TAT TCC TGA ATA TTT GTT AAC CTC ATG GAC-3‘。上述的開關式核酸適體探針中，所述連接片段優(yōu)選為一段不會與所述核酸適體片 段和核酸片段雜交的片段，或者為一段具有親水性和生物相容性的聚合物鏈(如聚乙二醇
寸J ο作為一個總的技術構思，本發(fā)明還提供一種上述的開關式核酸適體探針在腫瘤活 細胞及活體檢測中的應用，所述應用包括以下三種檢測中的至少一種
(1)對緩沖液中腫瘤活細胞的特異性檢測；(2)對血清中腫瘤活細胞的有效檢測；(3)活動物體內(nèi)腫瘤的實時熒光成像和活體檢測。上述的應用中，所述對緩沖液中腫瘤活細胞的特異性檢測的具體檢測步驟優(yōu)選為在待測緩沖液中加入所述開關式核酸適體探針5 50nM，于常溫下避光培育15min后， 立即采用流式細胞儀檢測細胞的熒光信號，并對收集到的細胞群(例如可以10000個計為 一群)的熒光強度進行統(tǒng)計分析，當熒光強度高于10的特定細胞數(shù)占細胞群中細胞總數(shù)的 20%以上時，即認為待測緩沖液中有目標腫瘤活細胞被所述開關式核酸適體探針檢出。上述的應用中，所述對血清中腫瘤活細胞的有效檢測的具體檢測步驟優(yōu)選為在 待測血清中加入所述開關式核酸適體探針5 50nM，于冰上避光培育30min后，立即采用流 式細胞儀檢測細胞的熒光信號，并對收集到的細胞群(例如可以10000個計為一群)的熒 光強度進行統(tǒng)計分析，當熒光強度高于10的特定細胞數(shù)占細胞群中細胞總數(shù)的20%以上 時，即認為待測血清中有目標腫瘤活細胞被所述開關式核酸適體探針檢出。上述的應用中，所述活動物體內(nèi)腫瘤的實時熒光成像和活體檢測的具體檢測步驟 優(yōu)選為向待測活動物體內(nèi)靜脈注射0. 3 0. 5nmol的開關式核酸適體探針和10倍以上 于開關式核酸適體探針濃度的隨機序列寡核苷酸，然后立即采用活體熒光影像系統(tǒng)實時記 錄動物體內(nèi)各個部位的熒光強度變化，當觀察到某一組織部位的熒光信號明顯高于其他組 織部位時(當然應當排除該熒光信號增強并非由開關式核酸適體探針因被動靶向而聚集 于肝臟、心臟、腎臟、膀胱等代謝相關組織所導致的前提下，這對于本領域人員來說是公知 的)，即認為該動物體內(nèi)有目標腫瘤細胞被所述開關式核酸適體探針檢出，且腫瘤部位位于 熒光信號明顯增強處。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于本發(fā)明巧妙地利用了核酸適體對腫瘤細胞 的特異性高親和力和發(fā)夾型核酸探針的高靈敏信號轉換機制特性，建立了基于開關式核酸 適體探針的腫瘤活細胞及活體檢測技術(Aptamer-based Switchable Probe，簡稱ASP)。 本發(fā)明利用該發(fā)夾型核酸探針作為ASP中的信號轉換元件，將核酸適體對目標腫瘤細胞的 識別能力高靈敏、高特異性地轉換為熒光信號的發(fā)生，避免了現(xiàn)有基于單一熒光或放射性 標記核酸適體的檢測方法中，為克服非特異性吸附信號而進行的繁瑣的洗滌過程，縮短了 檢測時間，拓展了可適用的檢測體系。同時，基于發(fā)夾型核酸探針信號轉換機制，ASP與目 標腫瘤細胞結合前后因構象發(fā)生變化而引起熒光信號“從無到有”，極大地提高了檢測方法 的靈敏性和特異性，這是傳統(tǒng)分析方法所無法比擬的。核酸適體在本發(fā)明的技術方案中不 僅起到了篩選、識別腫瘤細胞的作用，而且起到了控制ASP信號從“關閉”到“打開”的重要 作用。由于核酸適體在與腫瘤細胞結合時，對腫瘤細胞具有較高的選擇性，再加上發(fā)夾型核 酸探針的設計使得構象或信號轉換需要核酸適體與腫瘤細胞之間存在更強的親和力，因此 ASP對目標腫瘤細胞的檢測具有高度的選擇性和特異性，從而實現(xiàn)了在復雜混合體系(如 血清)、甚至活動物體內(nèi)無需分離的實時分析檢測。本發(fā)明為核酸適體在腫瘤活細胞檢測和活體成像研究中的應用提供了全新的手 段和思路。該開關式核酸適體探針對腫瘤活細胞和活體腫瘤組織的檢測分析操作簡單、快 速、靈敏、特異、成本低，具有重要的科學價值和廣闊的市場前景，有巨大的社會效益和經(jīng)濟 效益。
圖1為本發(fā)明實施例1中開關式核酸適體探針與腫瘤細胞結合前后的結構示意圖 (其中實線表示核酸適體片段、虛線表示連接片段、點線表示核酸片段)。圖2為本發(fā)明實施例1中開關式核酸適體探針對腫瘤細胞的檢測原理圖。
圖3為現(xiàn)有技術中基于單一熒光標記的核酸適體探針對腫瘤細胞的檢測原理圖。圖4為本發(fā)明實施例2中不同探針在不同生理緩沖液中的熒光光譜表征圖；其中， 各曲線從下往上依次為曲線a為空白生理緩沖液的背景熒光光譜；曲線b為開關式核酸適體探針在空白生理緩沖液中的熒光光譜；曲線c為開關式對照核酸探針在空白生理緩沖液中的熒光光譜；曲線d為開關式對照核酸探針在含有與開關式核酸適體探針互補核酸片段的生 理緩沖液中培育后的熒光光譜；曲線e為單一熒光標記的核酸適體探針在空白生理緩沖液中的熒光光譜；曲線f為單一熒光標記的對照核酸探針在空白生理緩沖液中的熒光光譜；曲線g為開關式核酸適體探針在含有與開關式核酸適體探針互補核酸片段的生 理緩沖液中雜交后的熒光光譜。圖5為本發(fā)明實施例3中開關式核酸適體探針和開關式對照核酸探針對不同腫瘤 細胞緩沖液的檢測結果對比圖。圖6為本發(fā)明實施例4中不同種類的探針對緩沖液中CCRF-CEM腫瘤細胞的檢測 靈敏性比較結果圖，其中曲線h為CCRF-CEM細胞在緩沖液中與單一熒光標記的對照核酸探針培育后的熒 光強度統(tǒng)計分析結果；曲線i為CCRF-CEM細胞在緩沖液中與開關式對照核酸探針培育后的熒光強度統(tǒng) 計分析結果；曲線j為CCRF-CEM細胞在緩沖液中與單一熒光標記的核酸適體探針培育后的熒 光強度統(tǒng)計分析結果；曲線k為CCRF-CEM細胞在緩沖液中與開關式核酸適體探針培育后的熒光強度統(tǒng) 計分析結果。圖7為本發(fā)明實施例5中開關式核酸適體探針在血清中的熒光穩(wěn)定性考察圖。圖8為本發(fā)明實施例6中開關式核酸適體探針和開關式對照核酸探針對血清中不 同腫瘤細胞的特異性檢測結果圖。圖9為本發(fā)明實施例7中不同種類的探針在荷瘤裸鼠體內(nèi)的腫瘤活體檢測結果對 比圖，其中圓圈所指示的位置即為CCRF-CEM腫瘤所在的位置。圖10為本發(fā)明實施例8中開關式核酸適體探針在植有不同腫瘤的裸鼠體內(nèi)的活 體腫瘤特異性檢測結果對比圖，其中第(1)行為開關式核酸適體探針在未種瘤正常裸鼠體內(nèi)的熒光成像結果；第(2)行為開關式核酸適體探針在Ramos荷瘤裸鼠體內(nèi)的熒光成像結果；第(3)行為開關式核酸適體探針在CCRF-CEM荷瘤裸鼠體內(nèi)的熒光成像結果。
圖例說明1、探針本體；11、核酸適體片段；12、連接片段；13、核酸片段；2、熒光發(fā)生單元；3、 熒光熄滅單元。
具體實施例方式以下結合優(yōu)選的實施例對本發(fā)明作進一步描述，但并不因此而限定本發(fā)明。實施例1 (針對CCRF-CEM腫瘤細胞設計的開關式核酸適體探針的檢測原理示意圖)一種如圖1所示的本發(fā)明的開關式核酸適體探針，該核酸適體探針包括探針本體 1和分別連接于該探針本體1兩端的熒光發(fā)生單元2和熒光熄滅單元3，探針本體1包含有 對目標腫瘤細胞具有特異性識別功能的核酸適體片段11和與該核酸適體片段11部分序列 互補的核酸片段13，核酸適體片段11和核酸片段13通過一連接片段12連接形成一發(fā)夾型 結構。核酸片段13競爭性雜交核酸適體片段11的能力弱于目標腫瘤細胞。本實施例中的 熒光發(fā)生單元2為熒光染料分子Cy5近紅外熒光基團，其連接于核酸片段13的端部；本實 施例中的熒光熄滅單元3為BHQ2熒光熄滅基團，其連接于核酸適體片段11的端部。本實 施例的開關式核酸適體探針設計完成后直接交Takara生物工程公司合成。本實施例中的核酸適體片段11是一段對CCRF-CEM腫瘤細胞具有特異性識別能力 的DNA，其核苷酸序列為5' -ATC TAA CTG CTG CGC CGC CGG GAA AAT ACT GTA CGG TTA GA-3'；本實施例中的連接片段12是一段由多個胸腺嘧啶脫氧核苷酸聚合而成的DNA，其 核苷酸序列為5， -TTT TTT TTT TTT TTT TT-3'；本實施例中的核酸片段13是一段與核酸適體片段11部分序列互補的DNA，其核苷 酸序列為5， -CTA ACC GT-3'；上述三個片段依次連接好后組成的開關式核酸適體探針的全序列為[5，- (Cy5)-CTA ACC GT TTT TTT TTT TTT TTT TT ATC TAA CTG CTG CGC CGC CGGGAA AAT ACT GTA CGG TTA GA- (BHQ2)-3']。本實施例的開關式核酸適體探針的檢測原理如圖2所示，當待檢測體系中不存在 CCRF-CEM腫瘤細胞時，開關式核酸適體探針主要為發(fā)夾型構象，一端的Cy5近紅外熒光基 團的熒光信號被另一端的BHQ2熒光熄滅基團吸收，使得熒光信號處于“關閉”狀態(tài)；而當 開關式核酸適體探針與CCRF-CEM腫瘤細胞特異性結合時，核酸適體構型發(fā)生變化導致其 發(fā)夾型構象被破壞從而產(chǎn)生明顯的熒光恢復，熒光信號處于“打開”狀態(tài)；由于核酸適體片 段11只有與CCRF-CEM腫瘤細胞結合時才會發(fā)生構型變化，沒有與CCRF-CEM腫瘤細胞結合 的熒光信號始終處于“關閉”狀態(tài)，因此檢測背景較低，這樣就實現(xiàn)了對CCRF-CEM腫瘤細胞 高特異、高靈敏和免分離的實時分析診斷。相比于圖3所示的基于單一熒光標記的核酸適 體探針對CCRF-CEM腫瘤細胞進行檢測的檢測原理相比，不論待檢測體系中是否存在目標 腫瘤細胞，基于單一熒光標記的核酸適體探針的熒光信號均可被檢測到，對目標腫瘤細胞 進行分析還需要進行繁瑣的洗滌過程，從而難以實現(xiàn)對目標腫瘤細胞實時、高效、便捷地檢測。實施例2 開關式核酸適體探針在緩沖液中的熒光光譜表征在四個200 μ L 緩沖液(Dulbecco，s PBS，4. 5g/L 葡萄糖，5mM MgCl2, lmg/mL BSA) 樣本中分別加入IOOnM的上述實施例1的開關式核酸適體探針、開關式對照核酸探針、單一 熒光標記的核酸適體探針和單一熒光標記的對照核酸探針，四種探針的核苷酸序列分別如 下開關式核酸適體探針[5，-(Cy5)-CTAACC GT TTT TTT TTT TTT TTT TT ATC TAA CTGCTG CGC CGC CGG GAA AAT ACT GTA CGG TTA GA-(BHQ2)-3‘]；開關式對照核酸探針[5，-(Cy5)-ACGGTT AG TTT TTT TTT TTT TTT TT ATA CGG TGACTG CGC CGC CGG GAA AAT ACT GTC TAA CCG TA-(BHQ2)-3‘]；單一熒光標記的核酸適體探針[5，-(Cy5) -ATC TAA CTG CTG CGC CGC CGG GAA AATACT GTA CGG TTA GA-3']；單一熒光標記的對照核酸探針[5，-(Cy5)-ATACGG TGA CTG CGC CGC CGG GAA AATACT GTC TAA CCG TA-3‘]。將添加有上述探針后的緩沖液于6°C左右的冰箱中放置過夜后，在6°C溫育，待熒 光強度穩(wěn)定后用熒光分光光度計(Hitachi日本F-2500型)記錄熒光光譜(參見圖4中的 曲線a、b、c、e和f)，激發(fā)波長為620nm，發(fā)射波長為640 740nm。另取兩個200 μ L的上述生理緩沖液作為兩個補充樣本，向兩樣本中分別加入 300ηΜ與上述核酸適體片段11完全互補的核酸片段(5’-TCT AAC CGT ACA GTA TTT TCC CGG CGGCGC AGC AGT TAG AT-3')，再向兩個補充樣本中分別加入IOOnM的上述開關式 核酸適體探針及開關式對照核酸探針，混勻后于6°C左右冰箱中放置過夜，隨后在6°C下溫 育，待熒光強度穩(wěn)定后用熒光分光光度計(Hitachi日本，F(xiàn)-2500型)記錄熒光光譜(參見 圖4中的曲線d和g)，激發(fā)波長620nm，發(fā)射波長640 740nm。由圖4可見，在沒有目標物存在的空白生理緩沖液中，開關式核酸適體探針的熒 光信號較單一熒光標記的核酸適體探針及單一熒光標記的對照核酸探針均大幅下降，具有 較低的檢測背景；而當本發(fā)明的開關式核酸適體探針與核酸適體的互補序列雜交之后，該 開關式核酸適體探針的熒光得到極大恢復，且信號強度高于單一熒光標記的核酸適體探 針。實施例3 開關式核酸適體探針對緩沖液中腫瘤細胞的高特異性檢測在200 μ L分散有2Χ IO5個CCRF-CEM腫瘤細胞的兩個緩沖液樣本中，分別加入 25ηΜ實施例2中準備的開關式核酸適體探針、開關式對照核酸探針，混合均勻后于常溫下 避光孵育15min，隨即用FACSCalibur流式細胞儀(Becton-Dickinson，美國)檢測細胞的 熒光信號。另外，分別對含有Ramos細胞、人多發(fā)性骨髓瘤細胞(簡稱U266細胞)、非洲絨 猴B淋巴細胞(簡稱B95-8細胞)等陰性對照細胞的緩沖液進行檢測，操作如前所述，對含 有前述四種不同腫瘤細胞緩沖液的檢測結果如圖5所示。由圖5可見，開關式核酸適體探 針和開關式對照核酸探針對Ramos細胞、U266細胞、B958細胞等陰性對照細胞均不能產(chǎn)生 較強的熒光信號，但本發(fā)明的開關式核酸適體探針在與CCRF-CEM腫瘤細胞結合后能發(fā)生較強的熒光恢復，而開關式對照核酸探針仍不能產(chǎn)生較強的熒光信號，這顯示出本實施例 的開關式核酸適體探針對不同腫瘤細胞檢測的高度特異性。實施例4 開關式核酸適體探針與傳統(tǒng)方法對緩沖液中腫瘤細胞的檢測靈敏性比較在200 μ L分散有2 X IO5個CCRF-CEM腫瘤細胞的緩沖液中，分別加入25ηΜ實施例 2中準備的開關式核酸適體探針、開關式對照核酸探針、單一熒光標記的核酸適體探針或單 一熒光標記的對照核酸探針，混合均勻后于常溫下避光孵育15min，隨即用FACSCalibur流 式細胞儀(Becton-Dickinson，美國)檢測細胞的熒光信號。檢測結果如圖6所示，由圖6 可見，開關式對照核酸探針和單一熒光標記的對照核酸探針的熒光強度較弱，這說明其對 CCRF-CEM腫瘤細胞不具有特異性識別能力；而較基于單一熒光基團標記的普通核酸適體 探針而言，在相同CCRF-CEM腫瘤細胞濃度的條件下，本發(fā)明的開關式核酸適體探針能夠產(chǎn) 生更大的信背比，因此可用于較低濃度的目標腫瘤細胞的檢測。實施例5:開關式核酸適體探針在血清中的熒光穩(wěn)定性考察在200 μ L小鼠血清中同時加入175ηΜ開關式核酸適體探針和2. 25 μ M未做任何 標記的隨機核酸片段(5，-CTA ACC GTT TTT TTT TTT TTT TTT TAT CTA ACT GCT GCG CCG CCGGGA AAA TAC TGT AC_3')，于37°C下溫育，同時用熒光分光光度計(Hitachi日本， F-2500型)監(jiān)測熒光強度，激發(fā)波長640nm，發(fā)射波長660nm，直到熒光強度穩(wěn)定后結束監(jiān) 測。監(jiān)測結果如圖7所示，由圖7可見，隨著培育時間的延長，開關式核酸適體探針的熒光 逐漸上升，這可能是血清中的核酸酶對探針的降解所致，也可能是由于某些非特異性蛋白 與探針的結合使其構型發(fā)生變化，從而使熒光得到一定程度的恢復。由圖7可知，37°C下， 本實施例開關式核酸適體探針在小鼠血清中的半衰期大約為23分鐘，這一穩(wěn)定性足以滿 足體內(nèi)外腫瘤細胞檢測的需要。實施例6 開關式核酸適體探針對血清中腫瘤細胞的特異性檢測在200 μ L分散有2 X IO5個CCRF-CEM腫瘤細胞的小鼠血清中，分別單獨加入25ηΜ 實施例2中準備的開關式核酸適體探針及開關式對照核酸探針，混合均勻后于冰上避光孵 育30min，隨即用FACSCalibur流式細胞儀(Becton-Dickinson，美國)檢測細胞的熒光信 號。另對含Ramos細胞的小鼠血清采用如前所述的操作，最后的檢測結果如圖8所示。由圖 8可見，即使是在血清這一復雜混合體系中，本實施例的開關式核酸適體探針仍然可以實現(xiàn) 對目標CCRF-CEM腫瘤細胞的高特異性檢測。實施例7 開關式核酸適體探針在活體腫瘤檢測中的應用將200 μ L約含IX IO7個生長旺盛的CCRF-CEM細胞懸液皮下注射入3 4周 齡BALB/c雄性裸鼠的右前肢背部，生長3 4周后即可明顯成瘤。隨后選取具有合適大 小腫瘤的荷瘤裸鼠，以尾靜脈注射約140 μ L含4. 5nmole未做任何標記的隨機核酸片段和 0. 35nmole實施例2中的開關式核酸適體探針的生理鹽水(另采用實施例2中的開關式對 照核酸探針的生理鹽水作對照)，同時采用Maestro 活體熒光成像系統(tǒng)(CRI，美國)實時 監(jiān)測腫瘤部位的熒光強度。與此相比較的傳統(tǒng)成像方法則是使用0. 5nmole實施例2中的單一熒光標記的核酸適體探針以尾靜脈注入荷瘤裸鼠體內(nèi)，其余操作同前所述。本實施例的檢測結果如圖9所示，由圖9可見，作為陰性對照的開關式對照核酸 探針在注入CCRF-CEM荷瘤裸鼠體內(nèi)后，并沒有在腫瘤部位觀察到明顯的熒光信號；而開關 式核酸適體探針在注入CCRF-CEM荷瘤裸鼠體內(nèi)10分鐘左右即可在腫瘤部位觀察到明顯 的熒光信號，且隨著時間延長，該腫瘤部位與其他非靶組織的熒光信號對比度逐漸增大；到 30分鐘左右，腫瘤部位仍然保持了較高的熒光信號對比度，有效實現(xiàn)了對目標腫瘤細胞的 活體靶向成像和檢測。與之相比較的單一熒光標記的核酸適體探針在注入CCRF-CEM荷瘤 裸鼠體內(nèi)后，熒光信號快速遍布小鼠全身，且隨著時間延長熒光信號逐漸降低；雖然腫瘤部 位與其他非靶組織的對比度在慢慢增加，且當時間延長至2小時后也較為明顯，但由于背 景太高導致其對比度明顯不如本實施例的開關式核酸適體探針，且檢測時間太長，成像機 理相對復雜，不利于腫瘤早期診斷的實現(xiàn)。
實施例8:開關式核酸適體探針的腫瘤活體檢測特異性考察將200 μ L約含1 X IO7個生長旺盛的CCRF-CEM細胞懸液皮下注射入3 4周齡 BALB/c雄性裸鼠的右前肢背部，生長3 4周后即可明顯成瘤，另注射Ramos細胞懸液到另 一只雄性裸鼠中作為對照。隨后用前述兩只具有合適大小腫瘤(但腫瘤細胞不同)的荷瘤 裸鼠，分別以尾靜脈注射約140 μ L含4. 5nmole未做任何標記的隨機核酸片段和0. 35nmole 實施例2中的開關式核酸適體探針的生理鹽水，同時采用Maestro 活體熒光成像系統(tǒng) (CRI，美國)實時監(jiān)測腫瘤部位的熒光強度，監(jiān)測結果如圖10所示。由圖10可見，本實施 例的開關式核酸適體探針對腫瘤的活體檢測具備高度特異性，僅能在CCRF-CEM腫瘤部位 發(fā)生強熒光信號。<110>湖南大學<120>開關式核酸適體探針及其在腫瘤活細胞及活體檢測中的應用<160>4<210>1<211>66bp<212>dna<213>人工序列<400>1ctaaccgttt tttttttttt tttttatcta actgctgcgc cgccgggaaa atactgtacg 60gttaga66<210>2<211>66bp<212>dna<213>人工序列<400>2acggttagtt tttttttttt tttttatacg gtgactgcgc cgccgggaaa atactgtcta 60accgta66<210>3
<211>41bp<212>dna<213>人工序列<400>3atctaactgc tgcgccgccg ggaaaatact gtacggttag a41<210>4<211>41bp<212>dna<213>人工序列<400>4atacggtgac tgcgccgccg ggaaaatact gtctaaccgt a 4權利要求
一種開關式核酸適體探針，其特征在于該核酸適體探針包括探針本體和分別連接于該探針本體兩端的熒光發(fā)生單元和熒光熄滅單元，所述探針本體包含有對目標腫瘤細胞具有特異性識別功能的核酸適體片段和與該核酸適體片段形成6～12對堿基互補序列的核酸片段，所述核酸適體片段和核酸片段通過一7～15nm長的連接片段連接形成一發(fā)夾型結構；所述核酸片段競爭性雜交所述核酸適體片段的能力弱于所述目標腫瘤細胞雜交核酸適體片段的能力。
2.根據(jù)權利要求1所述的開關式核酸適體探針，其特征在于所述熒光發(fā)生單元為熒 光染料分子或熒光納米顆粒；所述熒光熄滅單元為熒光熄滅基團或者為具有熒光淬滅效果 的功能化納米材料。
3.根據(jù)權利要求2所述的開關式核酸適體探針，其特征在于所述熒光染料分子為熒 光素、四甲基羅丹明或Cy5 ；所述熒光納米顆粒為包裹熒光染料的二氧化硅納米顆?；驘?光量子點；所述熒光熄滅基團為DABCYL、BHQl或BHQ2 ；所述具有熒光淬滅效果的功能化納 米材料為金納米顆粒或碳納米管。
4.根據(jù)權利要求1或2或3所述的開關式核酸適體探針，其特征在于所述核酸適體 片段是指通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術篩選出來的腫瘤細胞特異性核酸適體。
5.根據(jù)權利要求4所述的開關式核酸適體探針，其特征在于所述核酸適體片段是指 對人急性淋巴細胞白血病T淋巴細胞具有特異性識別能力的核酸適體序列1或者對人B淋 巴細胞瘤細胞具有特異性識別能力的核酸適體序列2或者對小鼠肝細胞瘤細胞具有特異 性識別能力的核酸適體序列3 ；所述核酸適體序列1的核苷酸序列為5' -ATC TAA CTG CTG CGC CGC CGG GAA AAT ACT GTA CGG TTA GA-3'；所述核酸適體序列2的核苷酸序列為5' -AAC ACC GTG GAG GAT AGT TCG GTG GCT GTT CAG GGT CTC CTC CCG GTG-3‘；所述核酸適體序列3的核苷酸序列為5' -AGT CCA TTT TAT TCC TGA ATA TTT GTT AAC CTC ATG GAC-3‘。
6.根據(jù)權利要求1或2或3所述的開關式核酸適體探針，其特征在于所述連接片段 為一段不會與所述核酸適體片段和核酸片段雜交的片段，或者為一段具有親水性和生物相 容性的聚合物鏈。
7.—種如權利要求1 6中任一項所述的開關式核酸適體探針在腫瘤活細胞及活體檢 測中的應用，其特征在于，所述應用包括以下三種檢測中的至少一種(1)對緩沖液中腫瘤活細胞的特異性檢測；(2)對血清中腫瘤活細胞的有效檢測；(3)活動物體內(nèi)腫瘤的實時熒光成像和活體檢測。
8.根據(jù)權利要求7所述的應用，其特征在于所述對緩沖液中腫瘤活細胞的特異性檢測的具體檢測步驟為在待測緩沖液中加入所 述開關式核酸適體探針5 50nM，于常溫下避光培育15min后，立即采用流式細胞儀檢測細 胞的熒光信號，并對收集到的細胞群的熒光強度進行統(tǒng)計分析，當熒光強度高于10的特定 細胞數(shù)占細胞群中細胞總數(shù)的20%以上時，即認為待測緩沖液中有目標腫瘤活細胞被所述 開關式核酸適體探針檢出；所述對血清中腫瘤活細胞的有效檢測的具體檢測步驟為在待測血清中加入所述開關 式核酸適體探針5 50nM，于冰上避光培育30min后，立即采用流式細胞儀檢測細胞的熒光 信號，并對收集到的細胞群的熒光強度進行統(tǒng)計分析，當熒光強度高于10的特定細胞數(shù)占 細胞群中細胞總數(shù)的20%以上時，即認為待測血清中有目標腫瘤活細胞被所述開關式核酸 適體探針檢出；所述活動物體內(nèi)腫瘤的實時熒光成像和活體檢測的具體檢測步驟為向待測活動物體內(nèi)靜脈注射0. 3 0. 5nmol的開關式核酸適體探針和10倍以上于開關式核酸適體探針濃 度的隨機序列寡核苷酸，然后立即采用活體熒光影像系統(tǒng)實時記錄動物體內(nèi)各個部位的熒 光強度變化，當觀察到某一組織部位的熒光信號明顯高于其他組織部位時，即認為該動物 體內(nèi)有目標腫瘤細胞被所述開關式核酸適體探針檢出，且腫瘤部位位于熒光信號明顯增強 處。
全文摘要
本發(fā)明屬于核酸檢測技術領域，具體公開了一種開關式核酸適體探針及其應用，該核酸適體探針包括探針本體和分別連接于該探針本體兩端的熒光發(fā)生單元和熒光熄滅單元，探針本體包含有對目標腫瘤細胞具有特異性識別功能的核酸適體片段和與該核酸適體片段形成互補序列的核酸片段，核酸適體片段和核酸片段通過一7～15nm長的連接片段連接形成一發(fā)夾型結構；核酸片段競爭性雜交核酸適體片段的能力弱于目標腫瘤細胞。本發(fā)明探針的應用可以是對緩沖液中腫瘤活細胞的特異性檢測、對血清中腫瘤活細胞的有效檢測及活動物體內(nèi)腫瘤的實時熒光成像和活體檢測中的至少一種。本發(fā)明的探針具有較高穩(wěn)定性、特異性和靈敏性，其應用操作簡單、快速、靈敏、特異、成本低。
文檔編號G01N21/64GK101812528SQ201010155148
公開日2010年8月25日 申請日期2010年4月26日 優(yōu)先權日2010年4月26日
發(fā)明者伍旭, 何曉曉, 葉曉生, 周冰, 王柯敏, 石慧, 郭秋平 申請人:湖南大學