專利名稱：一種酸性海藻糖酶及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種酸性海藻糖酶，特別是一種蟲生真菌酸性海藻糖酶及其制備方法。
背景技術(shù)：
已知，海藻糖(α-D-葡萄糖苷(1，1)-α-D-葡萄糖苷)是非還原性二糖，是昆蟲血淋巴中主要血糖，其含量高達(dá)20～100mM，占血糖總量的90％以上，這些昆蟲包括東亞飛蝗(Locustamigratoria)(Elbein，A.D；1974)。海藻糖在昆蟲生命活動中具有重要的生理作用，可概括為以下四點(1)作為昆蟲體內(nèi)的能量儲存，(2)作為抗凍保護(hù)劑避免在低溫下昆蟲血液凝固，(3)作為蛋白穩(wěn)定劑防止在熱應(yīng)急等情況下血淋巴蛋白變性，(4)作為采食反饋調(diào)控因子調(diào)節(jié)昆蟲取食。血淋巴中海藻糖的耗竭可能會對昆蟲起著致死的作用。
金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)是一種重要的蟲生真菌，廣泛運用于農(nóng)業(yè)害蟲的生物防治。在蟲生真菌侵染穿透體壁進(jìn)入昆蟲血腔直至昆蟲死亡以前，昆蟲血淋巴中豐富的海藻糖構(gòu)成了真菌潛在的重要營養(yǎng)源。然而，對許多真菌如金龜子綠僵菌來說，海藻糖是非透過性底物，必須在相應(yīng)胞外酸性海藻糖酶存在的條件下被水解成葡萄糖才能為真菌所利用。我們的研究顯示東亞飛蝗感染綠僵菌后，血液中海藻糖含量降低；此外，同工酶分析顯示血淋巴中出現(xiàn)較強的酸性海藻糖酶活性，這預(yù)示著酸性海藻糖酶在蟲生真菌侵入昆蟲血淋巴后，在與寄主競爭營養(yǎng)物質(zhì)并使昆蟲致病過程中起著重要的作用。然而對于蟲生真菌酸性海藻糖酶，國內(nèi)外的相關(guān)研究未見報道。分離純化海藻糖酶，研究其生化特性，這對于進(jìn)一步研究其對真菌在昆蟲致病機理中的作用，對提高蟲生真菌殺蟲劑的致病效率，有著重要的理論意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種蟲生真菌酸性海藻糖酶。
本發(fā)明的另一目的在于提供上述酶的制備方法。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的一種酸性海藻糖酶，它能特異地降解海藻糖為葡萄糖，并具有如下的物理化學(xué)特性(1)作用特異性降解海藻糖為葡萄糖；
(2)分子量在十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳上約為170kDa；(3)等電點在等電聚焦凝膠電泳(IEF)等電點電泳上約為4.7；(4)最適溫度和最佳pH海藻糖酶為該酶蛋白的專一性底物，其最適反應(yīng)溫度為30±0.2℃，最佳pH為5.5±0.2；(5)熱穩(wěn)定性此酶蛋白在40℃溫育240min對酶活性沒有影響，當(dāng)孵育溫度為50℃時，隨著孵育時間延長酶活性線性下降，當(dāng)溫度超過60℃時，酶活性迅速喪失；因此在溫度低于40℃條件下該酶蛋白是穩(wěn)定的；(6)抑制劑Trehazolin是此酶蛋白的專一性抑制劑，其IC50為1.3×10-8M；(7)酶動力學(xué)特性此酶蛋白的米氏常數(shù)Km為2.3mM，最大酶促反應(yīng)速度Vmax為0.412mmol min-1mg-1酶蛋白；其中所述酶是從保藏號為CGMCC No.0877的金龜子綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)CQM a102株中提取的。
本發(fā)明的另一目的，上述酸性海藻糖酶是這樣制得的首先活化上述金龜子綠僵菌菌株CQMA102孢子，并在營養(yǎng)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)能產(chǎn)生所述酶的微生物以形成所述的酶，并加以純化。
為了提高靈敏度及特異性，在上述分離純化過程中，本發(fā)明根據(jù)粗酶液酸性海藻糖酶同工酶檢測，確定純化目的蛋白的等電點；以酶活檢測得到的酶活為指示對天然表達(dá)的金龜子綠僵菌酸性海藻糖酶進(jìn)行分離純化。
上述金龜子綠僵菌菌株CQMA102孢子活化所用培養(yǎng)基由10g/l葡萄糖，2.5g/l蛋白胨，5.0g/l酵母浸膏，20g/l瓊脂組成，其pH值調(diào)至6.0；所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)采用的碳源是可溶性淀粉，可有效的誘導(dǎo)海藻糖同工酶產(chǎn)生，采用的氮源是硫酸銨，可有效減少培養(yǎng)液中蛋白種類和含量，避免外源蛋白對純化的不利影響，同時減少了蛋白酶的分泌對目標(biāo)蛋白的穩(wěn)定性影響，利于目標(biāo)蛋白分離純化；并根據(jù)酸性海藻糖酶的等電點、分子量特性，收集上柱前粗酶液，采用兩步離子交換層析、一步分子篩層析和一步窄pH范圍等電聚焦分離純化出所述的海藻糖酶。
上述誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基由可溶性淀粉10±0.5g/l，硫酸銨2±0.2g/l，氯化鉀1±0.1g/l，五水硫酸鎂0.5±0.05g/l，磷酸二氫鉀1±0.1g/l，2-(N-嗎啉)-乙基磺酸10±0.5g/l，微量元素0.1％七水硫酸亞鐵和0.3％五水硫酸鋅10±0.5ml/l組成，調(diào)pH值為6.00～6.10；所述離子交換層析采用的層析柱分別為High Q Sepharoes陰離子柱和25 Q Sepharoes陰離子柱(Bio-Rad)；所述分子篩層析柱為Sepharcyl-200sHR(Pharmacia)；所述窄pH范圍等電聚焦采用的等電聚焦膠板為安發(fā)瑪西亞產(chǎn)的pH值范圍為4.0～5.0的膠板。
在所述制備方法中，對所述的酶進(jìn)行同工酶檢測是先進(jìn)行等電聚焦電泳，然后采用凝膠染色進(jìn)行檢測；其中的凝膠染色，是采用覆蓋膠法對等電聚焦后凝膠中酸性海藻糖酶進(jìn)行活性顯色，A液由0.1M pH5.0檸檬酸緩沖液10ml，1000U葡萄糖氧化酶50μl，2500U/ml過氧化物酶50μl，25mg/ml 3-氨基-9-乙基-咔唑丙酮溶液組成，B液為2％瓊脂；并將A液2ml、海藻糖100mg、B液12ml混勻。
具體地說，上述酸性海藻糖酶的制備方法，所述金龜子綠僵菌菌株CQMa102的活化將金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)CQMa102分生孢子接種于1/4SDA平板培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，菌株在26～28℃黑暗條件下生長7～14d，直至產(chǎn)孢，然后于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?；所述產(chǎn)酶誘導(dǎo)培養(yǎng)收集1/4SDA平板培養(yǎng)基上CQMa102菌株分生孢子，并配制成3×107～4×107孢子/ml菌懸液；每100ml液體培養(yǎng)基接種3×107～4×107孢子，在開放式搖床上150rpm振蕩培養(yǎng)72h，培養(yǎng)溫度為26～27℃；所述分離純化誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后，去除培養(yǎng)液中的菌絲，收集濾液進(jìn)行透析、離心、抽濾，并調(diào)節(jié)其電導(dǎo)率為0.6～0.7ms/cm2的上柱前粗酶液；所述層析步驟均在Duo-flow高壓層析系統(tǒng)(Bio-Rad)上進(jìn)行；所述離子交換層析柱采用0.0～0.5M氯化鈉線形洗脫梯度洗脫結(jié)合的酸性海藻糖酶，收集含海藻糖酶活性部分；對收集的海藻糖酶活性部分超濾濃縮，再進(jìn)行分子篩層析，對分子篩層析后所得的海藻糖酶液經(jīng)超濾濃縮后，再進(jìn)行窄PH范圍等電聚焦電泳分離，電泳結(jié)束后，將含海藻糖酶活性部分的條帶切下來轉(zhuǎn)入透析管中，再將酶蛋白洗出，即得純化的酸性海藻糖酶。
更為具體地說，純化中上柱前待純化粗酶液的收集是指培養(yǎng)結(jié)束后，培養(yǎng)液用紗布過濾去除菌絲，收集濾液裝入透析袋中，分子截留量為5000，用10倍體積的去離子水在4℃透析30h，期間換4～5次水；然后用鹽酸將透析液PH值調(diào)節(jié)到5.8，溶液在13，500rpm、4℃離心20min，然后用三層濾紙抽濾處理，最后用氯化鈉調(diào)節(jié)電導(dǎo)率為0.6～0.7ms/cm2，得到上柱前待純化粗酶液。
上述第一步離子層析是20ml High Q Sepharoes陰離子柱用10mM 2-(N-嗎啉)-乙基磺酸pH5.8，電導(dǎo)0.6～0.7ms/cm2平衡緩沖液平衡后，將上述粗酶液上柱，上柱流速為3.0ml/min，上柱完畢后用平衡緩沖液以3.0ml/min流速沖洗直至所有未結(jié)合的蛋白都被沖走(280nm不再有吸收值)；采用200ml 0.0～0.50M氯化鈉線形洗脫梯度洗脫結(jié)合的酸性海藻糖酶，收集管設(shè)置為2ml/管，收集含海藻糖酶活性部分用于下一步純化；上述第二步離子層析是指High Q Sepharoes陰離子層析后收集的酶液裝入透析袋中，在4℃條件下于約2L 15mM醋酸緩沖液pH5.0，電導(dǎo)1.00～1.05ms/cm2中透析24h，其間換3次緩沖液；充分透析后的酶液再與15mM醋酸緩沖液pH5.0，電導(dǎo)1.00～1.05ms/cm2以等體積混合后，上2ml 25Q Sepharoes陰離子柱，此層析柱先用15mM醋酸緩沖液平衡過，上柱流速為1.0ml/min；上柱完畢后用平衡緩沖液以1.0ml/min流速沖洗直至所有未結(jié)合的蛋白都被沖走(280nm不再有吸收值)；采用100ml 0.0～0.50M氯化鈉線形洗脫梯度洗脫結(jié)合的酸性海藻糖酶，收集管設(shè)置為1ml/管，收集含海藻糖酶活性部分用于下一步純化；上述分子篩層析是指25Q Sepharoes陰離子洗脫得到的樣品經(jīng)0.5ml超濾離心管Millipore，10kDa超濾濃縮至1ml體積，然后進(jìn)行分子篩層析；2.6×60cm分子篩層析柱Sepharcyl-200s HR(Pharmacia)預(yù)先用15mM醋酸緩沖液pH5.0，電導(dǎo)1.05ms/cm2充分平衡后，然后通過上樣環(huán)上樣1ml，酸性海藻糖酶用同樣的醋酸緩沖液洗出，流速設(shè)置為0.5ml/min，收集體積設(shè)置為1.0ml/管，收集含海藻糖酶活性部分用于下一步純化；上述窄pH范圍等電聚焦分離是指分子篩層析后所得海藻糖酶液經(jīng)0.5ml超濾離心管Millipore，10kDa超濾濃縮體積至0.5ml，然后用pH值范圍為4.0～5.0預(yù)制等電聚焦膠板(Pharmacia)進(jìn)行電泳分離，電泳結(jié)束后，將含海藻糖酶活的條帶切下來，轉(zhuǎn)入透析管中，用電洗脫方式將酶蛋白洗出。
本發(fā)明，首先建立了快速簡便的酸性海藻糖酶檢測體系，利于對純化進(jìn)程進(jìn)行監(jiān)控；同時只用培養(yǎng)濾液作起始純化酶液，其蛋白都為真菌代謝產(chǎn)生并分泌到體外的，初始蛋白含量很低，種類相對較少，利于純化。采用20ml High Q陰離子交換作為純化第一步，將上柱pH設(shè)置到5.8可以快速富積目標(biāo)蛋白同時去除培養(yǎng)液中存在的大部分雜蛋白及其它大分子物質(zhì)如淀粉。純化的第二步采用2ml 25Q陰離子交換并將上柱pH設(shè)置到5.0，接近目標(biāo)蛋白等電點，提高了層析的分辨率。第三步采用分子篩層析，根據(jù)分子量大小的差異對酸性海藻糖酶進(jìn)行了進(jìn)一步的分離，第四步采用窄pH范圍預(yù)制等電聚焦膠板(Pharmacia，pH4.0～5.0)進(jìn)行分離，能將等電點相差很小的蛋白分開，從而使酸性海藻糖酶進(jìn)一步得以純化。
采用本發(fā)明所述的分離純化方法得到的酸性海藻糖酶，能特異降解海藻糖為葡萄糖，具有活性高、底物專一性高的特點，可以廣泛運用于科學(xué)研究中海藻糖含量的定性定量檢測，能避免其它二糖的干擾。


圖1濾液濃縮后酸性海藻糖酶同工酶分析；圖220ml High Q Sepharoes(Bio-Rad)陰離子層析流出圖；圖32ml 25 Q Sepharoes(Bio-Rad)陰離子層析流出圖；圖42.6×60cm分子篩層析(Sepharcyl-200s HR，Parmacheica)流出圖；圖5不同純化階段SDS-PAGE蛋白銀染檢測；圖6純化后的酸性海藻酶IEF銀染檢測；圖7抑制劑Trehazolin對純化的酸性海藻糖酶活性的影響；圖8溫度對酸性海藻糖酶活性的影響；圖9.pH對酸性海藻糖酶活性的影響；圖10.酸性海藻糖酶的熱穩(wěn)定性；圖11.Lineweaver-Burk方程測定純化的酸性海藻糖酶Km和Vmax。
在圖5中，1是25Q流出峰2；2是分子篩流出峰1；3是純化的酸性海藻糖酶；M是蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；在圖6中，1是粗酶液；2是純化的酸性海藻糖酶。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不僅限于此。
金龜子綠僵菌菌株CQMa102孢子的活化本例的金龜子綠僵菌菌株CQMa102(Metarhiziumanisopliaevar.acridumCQMa102)是從罹病竹蝗僵蟲體內(nèi)分離培養(yǎng)純化得到，由重慶大學(xué)基因工程中心分離純化，中國微生物所菌種保存中心保存的菌株，保藏編號CGMCC No.0877，其分生孢子存儲于30％甘油溶液中，于-80℃超低溫冰箱中長期保存。將-80℃保存的金龜子綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)CQMa102菌株接種于1/4SDA平板培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，所用培養(yǎng)基由10g/l葡萄糖，2.5g/l蛋白胨，5.0g/l酵母浸膏，20g/l瓊脂組成，并將其pH值調(diào)至6.0，菌株在26～28℃黑暗條件下生長7～14d，直至產(chǎn)孢，然后于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> 產(chǎn)酶誘導(dǎo)培養(yǎng)條件所用培養(yǎng)基由可溶性淀粉10±0.5g/l，硫酸銨2±0.2g/l，氯化鉀1±0.1g/l，五水硫酸鎂0.5±0.05g/l，磷酸二氫鉀1±0.1g/l，2-(N-嗎啉)-乙基磺酸10±0.5g/l，微量元素0.1％七水硫酸亞鐵和0.3％五水硫酸鋅10±0.5ml/l組成，并將其pH調(diào)至6.00～6.10。具體配制方法稱取3L培養(yǎng)基物質(zhì)于1L玻璃燒杯中，先加入約1L去離子水，用玻棒攪拌后于微波爐中加熱徹底溶解可溶性淀粉。然后待培養(yǎng)基冷卻后用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至6.00～6.10。最后將培養(yǎng)基用去離子水調(diào)至3L，分裝到250ml三角瓶，每瓶100ml培養(yǎng)液。培養(yǎng)基滅菌備用。
收集1/4SDA平板培養(yǎng)基上CQMa102菌株分生孢子，用滅菌的0.05％吐溫80溶液配制成3×107孢子/ml菌懸液；每100ml培養(yǎng)液接種3×107孢子。培養(yǎng)液在開放式搖床上150rpm振蕩培養(yǎng)72h，培養(yǎng)溫度為26～27℃。
酸性海藻糖酶同工酶檢測等電聚焦電泳參照汪家政(2001)，采用T＝5％，C＝3％垂直板聚丙烯酰胺等電聚焦電泳(PAGE-IEF)，采用寬pH范圍兩性電解質(zhì)(pH 3-9.5)。電泳設(shè)備為Mini-Proteanapparatus(Bio-Rad)。陰極電泳液是為2mM NaOH溶液；陽極電解液是由0.84ml磷酸溶于1L蒸餾水中配置而成。樣品溶液中含有50％甘油。采用分步電泳，先在100V電壓下電泳1h，接著在250V電壓下電泳2h。
凝膠染色采用覆蓋膠法(overlay gel)對等電聚焦后凝膠中酸性海藻糖酶進(jìn)行活性顯色(Manchenk，1994)。A液由0.1M pH5.0檸檬酸緩沖液10ml，1000U葡萄糖氧化酶50μl，2500U/ml過氧化物酶50μl，25mg/ml 3-氨基-9-乙基-咔唑丙酮溶液組成，用量2ml，海藻糖100mg，B液為2％瓊脂(60℃)，用量12ml混合后，均勻傾倒在凝膠表面，然后將凝膠放置在37℃下進(jìn)行保溫直到出現(xiàn)紅棕色染色條帶。用7％的乙酸對凝膠進(jìn)行固定。
酸性海藻糖酶酶活檢測以酶與海藻糖反應(yīng)釋放的葡萄糖含量來確定海藻糖酶酶活。取一定體積酶液(xμl)和12.5μl 0.1M的海藻糖溶液，在20mM 2-(N-嗎啉)-乙基磺酸(pH5.5)中、30℃下反應(yīng)10min，反應(yīng)體系總體積50μl。反應(yīng)結(jié)束后先在100℃水浴5min終止反應(yīng)，接著冰浴5min以防止酶蛋白質(zhì)重折疊。酶促反應(yīng)后釋放出的葡萄糖含量用改進(jìn)的葡萄糖氧化酶法測定(Trinder1969)，加入150μl葡萄糖測定試劑[含0.5mM 4-氨基安替比林(4-aminoantipryine)，20mM p-羥基苯磺酸鹽(p-hydroxybenzene sulphonate)，15,000U/L葡萄糖氧化酶和10,000U/L過氧化物酶(horseradish)，在27℃下顯色30min。以一系列不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，使用Model 550酶標(biāo)儀(Bio-Rad)，于490nm測光吸收值。酶活定義為每分鐘釋放1mmol葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位(U)。
為便于樣品處理，本例中每批次培養(yǎng)接種3L培養(yǎng)液，經(jīng)過72h培養(yǎng)，所得濾液經(jīng)過透析處理后，體積為2.7L左右。由于培養(yǎng)基中不含外源蛋白，培養(yǎng)液中蛋白均來源于真菌自身代謝并分泌到培養(yǎng)基中的，因此總蛋白含量很低，只有20mg左右。同工酶分析顯示有兩條同工酶帶，其中一條帶pI(等電點)在4.7，活性較高，而另一條帶pI在8.4左右(見圖1)，活性較弱，其它方面實驗顯示pI 4.7的同工酶可能為真菌在蝗蟲浸染過程中起作用的酸性海藻糖酶。
酸性海藻糖酶的純化培養(yǎng)結(jié)束后，培養(yǎng)液用紗布過濾去除菌絲，收集濾液裝入透析袋(分子截留量為5000)中，用10倍體積的去離子水在4℃透析30h，期間換4～5次水。然后用HCl溶液將透析液pH值調(diào)節(jié)到5.8，溶液在13，500rpm、4℃離心20min，然后用三層濾紙抽濾處理，最后用NaCl溶液調(diào)節(jié)電導(dǎo)率為0.7ms/cm2，得到上柱前粗酶液。
本發(fā)明的所有層析都是在Duo-flow高壓層析系統(tǒng)(Bio-Rad)上進(jìn)行。第一步離子層析是20ml High Q Sepharoes陰離子柱用10mM MES(pH5.8，電導(dǎo)0.7ms/cm2)平衡緩沖液平衡后，將上述粗酶液上柱，上柱流速為3.0ml/min，上完后用平衡緩沖液以3.0ml/min流速沖洗直至所有未結(jié)合的蛋白都被沖走(280nm不再有吸收值)。采用200ml0.0～0.5M NaCl溶液線形洗脫梯度洗脫結(jié)合的酸性海藻糖酶，收集管設(shè)置為2ml/管，收集含海藻糖酶活性部分用于下一步純化。
第二步離子層析High Q陰離子層析后收集的酶液裝入透析袋中，在4℃條件下于2L 15mM醋酸緩沖液(pH5.0，電導(dǎo)1.05ms/cm2)中透析24h，其間換3次緩沖液。充分透析后的酶液再與15mM醋酸緩沖液(pH5.0，電導(dǎo)1.05ms/cm2)以等體積混合后，上2ml25 Q Sepharoes陰離子柱(層析柱事先用15mM醋酸緩沖液平衡)，上柱流速為1.0ml/min。上柱完畢后用平衡緩沖液以1.0ml/min流速沖洗直至所有未結(jié)合的蛋白都被沖走(280nm不再有吸收值)。采用100ml 0.0～0.5M NaCl溶液線形洗脫梯度洗脫結(jié)合的酸性海藻糖酶，收集管設(shè)置為1ml/管，收集含海藻糖酶活性部分用于下一步純化。
分子篩層析25Q Sepharoes陰離子洗脫得到的樣品經(jīng)0.5ml超濾離心管(Millipore，10KDa)超濾濃縮至1ml體積，然后進(jìn)行分子篩層析。2.6×60cm分子篩層析柱(Sepharcyl-200s HR，Pharmacia)預(yù)先用15mM醋酸緩沖液(pH5.0，電導(dǎo)1.05ms/cm2)充分平衡后，通過上樣環(huán)上樣，酸性海藻糖酶用同樣的緩沖液洗出，流速設(shè)置為0.5ml/min，收集體積設(shè)置為1.0ml/管，收集含海藻糖酶活性部分用于下一步純化。
窄pH范圍等電聚焦分離分子篩層析后所得海藻糖酶液經(jīng)0.5ml超濾離心管(Millipore，10kDa)超濾濃縮體積至0.5ml，然后用窄pH范圍預(yù)制等電聚焦膠板(Pharmacia，pH4.0～5.0)進(jìn)行分離，按說明書要求在水平板電泳儀(北京六一)上進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后，將含海藻糖酶活的條帶切下來，轉(zhuǎn)入透析管中，用電洗脫方式將酶蛋白洗出，即可得到純化的酸性海藻糖酶。
本例結(jié)合同工酶分析資料，首先選用20ml High Q Sepharoes(Bio-Rad)陰離子層析，該介質(zhì)直徑為50μm，流速較快，可以較快地將樣品中的目標(biāo)蛋白吸附到介質(zhì)上，從而達(dá)到快速富集目標(biāo)蛋白的目的，將上柱pH設(shè)置為5.8，電導(dǎo)率調(diào)到0.7是為了讓目標(biāo)蛋白很好的吸附到柱上，如圖2所示，通過這一步層析，去除掉了濾液中大部分雜蛋白和淀粉等雜質(zhì)，同時將目標(biāo)蛋白從2700ml濃縮至約30ml左右。從圖2中，我們還可看出，海藻糖酶活性部分集中在18～34管(30ml)。
經(jīng)過第一步陰離子交換層析后，樣品中雜蛋白及其它干擾因子減少，進(jìn)一步采用2ml25Q Sepharoes陰離子交換，25Q Sepharoes陰離子介質(zhì)直徑為25μm，由于柱子小，介質(zhì)細(xì)，因而分辨率更高，采用pH 5.0，電導(dǎo)率1.05上柱，上柱PH非常接近酸性海藻糖酶等電點4.7，但能將目標(biāo)蛋白吸附到柱上，進(jìn)一步減少非特異蛋白的吸附，增加層析的分辨率；經(jīng)過洗脫，得到了較好的洗脫峰，酸性海藻糖酶活性部分在第2個峰中出現(xiàn)，體積進(jìn)一步降到3ml(參見圖3)。
25Q離子交換層析后，樣品經(jīng)過SDS-PAGE檢測，只含有幾條主蛋白帶，且分子量相差較大，因此進(jìn)一步選用分子篩層析，利用蛋白之間分子量大小差異進(jìn)行分離。如圖4所示，經(jīng)過分子篩層析后，酸性海藻糖酶活性部分在第一個洗脫峰中出現(xiàn)，活性部分體積收集為10ml。
分子篩層析后，收集酸性海藻糖酶活性部分，經(jīng)SDS-PAGE檢測，只剩下2條蛋白帶(銀染)，兩條蛋白分子量分別為170KDa和87KDa，但在分子篩層析時卻在同一個峰中出現(xiàn)，推測87KDa蛋白在天然條件下是一個二聚體。
進(jìn)一步采用窄pH范圍預(yù)制等電聚焦膠板(Pharmacia，pH4.0～5.0)進(jìn)行分離，經(jīng)分離后得到酸性海藻糖酶純品，SDS-PAGE(參見圖5)和IEF(參見圖6)檢測均只有一條蛋白帶。純化的酸性海藻糖酶分子量為170KDa，等電點(pI)為4.7。對純化的蛋白生化特性進(jìn)行了鑒定(圖7-11，表1)。
表1.金龜子綠僵菌酸性海藻糖酶底物特異性分析

將本例純化得到的酸性海藻糖酶進(jìn)行特性鑒定1、分子量和等電點分子量的測定是根據(jù)Laemmli的方法用12％的SDS-PAGE測定，蛋白質(zhì)分子量Marker是低分子量Marker(Pharmacia)。等電點是在IEF-PAGE上測定的。
2、抑制劑trehazolin對海藻糖酶活性的影響Trehazolin是海藻糖酶專一性抑制劑，最初是從Micromonospora的培養(yǎng)物中分離得到，系海藻糖結(jié)構(gòu)類似物。0-50ng/ml濃度梯度(終濃度)的trehazolin分別加入到1.5ml含12.5mM 2-(N-嗎啉)-乙基磺酸，pH5.5，12.5mM海藻糖和25ng純化的酸性海藻糖酶溶液的離心管中，反應(yīng)總體積為50μl；在30℃水浴反應(yīng)10min，100℃滅活5min，冰浴5min，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)入96孔酶標(biāo)板中，每孔加入150μl Trinder測糖試劑，在27℃反應(yīng)30min，使用Model 550酶標(biāo)儀(Bio-Rad)，于490nm測光吸收值。每個梯度作三次重復(fù)，共設(shè)8個梯度；在實驗中另設(shè)一空白對照，不加抑制劑和純化的海藻糖酶，以扣除背景值。
結(jié)論Trehazolin是酸性海藻糖酶專一性抑制劑，其IC50為1.3×10-8M。
3、底物特異性分析分別測定了純化的海藻糖酶對8種二糖的水解作用。1.5ml含12.5mM 2-(N-嗎啉)-乙基磺酸，pH 5.5和25ng純化的酸性海藻糖酶溶液的離心管中分別加入12.5mM終濃度的海藻糖，纖維二糖(glucose β1-4 glucose)，麥芽糖(glucoseα1-4 glucose)，蔗糖(glucose α1-2βglucose)，半乳糖(galactose1-4glucose)，p-硝基苯-β-葡糖苷(pnp galactopyranoside)，p-硝基苯-α-葡糖苷(pnp α-glucopyranoside)，p-硝基苯-β半乳糖苷(pnp β-glucopyranoside)，反應(yīng)總體積為50μl。每個底物處理設(shè)置一個空白對照，即在上述反應(yīng)體系中不加純化的海藻糖酶，其余成分相同，以扣除背景值。在30℃水浴反應(yīng)10min，100℃滅活5min，冰浴5min，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)入96孔酶標(biāo)板中，每孔加入150μl葡萄糖測定試劑，27℃反應(yīng)30min，使用Model 550酶標(biāo)儀(Bio-Rad)，于490nm測光吸收值。每種底物分別作三次重復(fù)(包括空白和實驗處理)。
結(jié)論海藻糖為該蛋白酶專一性底物。
4、海藻糖酶反應(yīng)最適溫度和pH測定從15～70℃每隔5℃設(shè)置一個溫度梯度，1.5ml離心管在冰上分別加入12.5mM終濃度的海藻糖，12.5mM MES，pH 5.5和25ng純化的酸性海藻糖酶，總體積50μl，然后放入上述不同溫度梯度的水浴鍋中反應(yīng)10min，100℃滅活5min，冰浴5min，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)入96孔酶標(biāo)板中，每孔加入150μl Trinder測糖試劑，27℃反應(yīng)30min，使用Model 550酶標(biāo)儀(Bio-Rad)，于490nm測光吸收值。每個溫度梯度分別作三次重復(fù)。
從pH3.0～9.0每隔0.5個pH設(shè)置一個梯度，其中3.0～5.0用醋酸緩沖液，5.5～6.5用MES緩沖液，7.0～7.5用HEPES緩沖液，8.0～9.0用Tris-HCl作緩沖液，1.5ml離心管在冰上分別加入終濃度為30mM的不同pH緩沖液，12.5mM終濃度的海藻糖和25ng純化的酸性海藻糖酶，總體積50μl。在30℃水浴反應(yīng)10min，100℃滅活5min，冰浴5min，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)入96孔酶標(biāo)板中，每孔加入150μl Trinder測糖試劑，27℃反應(yīng)30min，使用Model 550酶標(biāo)儀(Bio-Rad)，于490nm測光吸收值。每種pH梯度分別作三次重復(fù)。
結(jié)論海藻糖酶反應(yīng)最適溫度為30℃，最適反應(yīng)PH值為5.5。
5、酸性海藻糖酶熱穩(wěn)定性測定純化的酸性海藻糖酶在40，50，60，70℃條件下分別水浴10min，30min，60min，120min和240min，然后取5μl(25ng)測定殘存的酶活。測定條件為12.5mM終濃度的海藻糖，12.5mM MES，pH5.5和25ng熱處理過的酸性海藻糖酶，總體積50μl，在30℃水浴反應(yīng)10min，100℃滅活5min，冰浴5min，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)入96孔酶標(biāo)板中，每孔加入150μl Trinder測糖試劑，27℃反應(yīng)30min，使用Model 550酶標(biāo)儀(Bio-Rad)，于490nm測光吸收值。每個處理分別作三次重復(fù)。
結(jié)論此酸性海藻糖酶在40℃溫育240min對酶活性沒有影響，當(dāng)孵育溫度為50℃時，隨著孵育時間延長酶活性線性下降，當(dāng)溫度超過60℃時，酶活性迅速喪失。
6、酶動力學(xué)特性測定海藻糖終濃度設(shè)置為0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.8，1.0，1.25mM，不同濃度梯度的海藻糖分別與25ng純化的酸性海藻糖酶在30℃，pH5.5條件下反應(yīng)10min(反應(yīng)體系總體積為50μl)，反應(yīng)完畢后100℃滅活5min，冰浴5min，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)入96孔酶標(biāo)板中，每孔加入150μl Trinder測糖試劑，27℃反應(yīng)30min，使用Model550酶標(biāo)儀(Bio-Rad)，于490nm測光吸收值。每個處理分別作三次重復(fù)。與此同時，配置0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.6mM葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)梯度，每個酶標(biāo)板孔中加入50μl標(biāo)準(zhǔn)濃度葡萄糖溶液，然后與150μl Trinder測糖試劑在27℃反應(yīng)30min，使用Model 550酶標(biāo)儀(Bio-Rad)，于490nm測光吸收值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(n＝3)。應(yīng)用Lineweaver-Burk方程計算純化的酸性海藻糖酶Km和Vmax。
結(jié)論此酸性海藻糖酶特征米式常數(shù)Km為2.3mM，最大酶促反應(yīng)速度Vmax為0.412mmolmin-1mg-1酶蛋白protein。
權(quán)利要求
1.一種酸性海藻糖酶，它能特異地降解海藻糖為葡萄糖，并具有如下的物理化學(xué)特性(1)作用特異性降解海藻糖為葡萄糖；(2)分子量在十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳上約為170kDa；(3)等電點在等電聚焦凝膠電泳等電點電泳上約為4.7；(4)最適溫度和最佳pH海藻糖酶為該酶蛋白的專一性底物，其最適反應(yīng)溫度為30±0.2℃，最佳pH為5.5±0.2；(5)熱穩(wěn)定性此酶蛋白在40℃溫育240min對酶活性沒有影響，當(dāng)孵育溫度為50℃時，隨著孵育時間延長酶活性線性下降，當(dāng)溫度超過60℃時，酶活性迅速喪失；(6)抑制劑Trehazolin是此酶蛋白的專一性抑制劑，其IC50為1.3×10-8M；(7)酶動力學(xué)特性此酶蛋白的米氏常數(shù)Km為2.3mM，最大酶促反應(yīng)速度Vmax為0.412mmol min-1mg-1；其中所述酶是從保藏號為CGMCC No.0877的金龜子綠僵菌CQM a102菌株中提取的。
2.一種制備權(quán)利要求1所述的酸性海藻糖酶的方法，所述方法包括活化所述金龜子綠僵菌菌株CQMa102孢子，并在營養(yǎng)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)能產(chǎn)生所述酶的微生物以形成所述的酶，并加以純化。
3.如權(quán)利要求2所述的制備酸性海藻糖酶的方法，其特征在于在所述制備方法中，對所述的酶進(jìn)行同工酶檢測和酶活檢測，以確定目的蛋白的等電點，再進(jìn)行純化。
4.如權(quán)利要求2所述的制備酸性海藻糖酶的方法，其特征在于所述金龜子綠僵菌菌株CQMa102孢子活化所用培養(yǎng)基由10g/l葡萄糖，2.5g/l蛋白胨，5.0g/l酵母浸膏，20g/l瓊脂組成，其pH值調(diào)至6.0；所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)采用的碳源是可溶性淀粉，采用的氮源是硫酸銨；所述純化采用上柱前粗酶液的收集、兩步離子交換層析、一步分子篩層析和一步窄pH范圍等電聚焦分離純化出所述的海藻糖酶。
5.如權(quán)利要求4所述的制備酸性海藻糖酶的方法，其特征在于所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基由可溶性淀粉10±0.5g/l，硫酸銨2±0.2g/l，氯化鉀1±0.1g/l，五水硫酸鎂0.5±0.05g/l，磷酸二氫鉀1±0.1g/l，2-(N-嗎啉)-乙基磺酸10±0.5g/l，微量元素0.1％七水硫酸亞鐵和0.3％五水硫酸鋅10±0.5ml/l組成，調(diào)pH值為6.00～6.10；所述離子交換層析采用的層析介質(zhì)分別為High Q Sepharoes陰離子介質(zhì)和25QSepharoes陰離子介質(zhì)；所述分子篩層析柱為Sepharcyl-200s HR；所述窄pH范圍等電聚焦采用的等電聚焦膠板為安發(fā)瑪西亞產(chǎn)的pH值范圍為4.0～5.0的膠板。
6.如權(quán)利要求3所述的制備酸性海藻糖酶的方法，其特征在于在所述制備方法中，對所述的酶進(jìn)行同工酶檢測是先進(jìn)行等電聚焦電泳，然后采用凝膠染色進(jìn)行檢測；其中的凝膠染色，是采用覆蓋膠法對等電聚焦后凝膠中酸性海藻糖酶進(jìn)行活性顯色，A液由0.1M pH5.0檸檬酸緩沖液10ml，1000U葡萄糖氧化酶50μl，2500U/ml過氧化物酶50μl，25mg/ml 3-氨基-9-乙基-咔唑丙酮溶液組成，B液為2％瓊脂；并將A液2ml、海藻糖100mg、B液12ml混勻。
7.如權(quán)利要求2至6任一權(quán)利要求所述的制備酸性海藻糖酶的方法，其特征在于所述金龜子綠僵菌菌株CQMa102的活化將金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)CQMa102分生孢子接種于1/4SDA平板培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，菌株在26～28℃黑暗條件下生長7～14d，直至產(chǎn)孢，然后于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?；所述產(chǎn)酶誘導(dǎo)培養(yǎng)收集1/4SDA平板培養(yǎng)基上CQMa102菌株分生孢子，并配制成3×107～4×107孢子/ml菌懸液；每100ml液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基接種1ml，在開放式搖床上150rpm振蕩培養(yǎng)72h，培養(yǎng)溫度為26～27℃；所述分離純化誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后，去除培養(yǎng)液中的菌絲，收集濾液進(jìn)行透析、離心、抽濾，并調(diào)節(jié)上柱前待純化粗酶液電導(dǎo)率為0.6～0.7ms/cm2；所述層析步驟均在Duo-flow高壓層析系統(tǒng)(Bio-Rad)上進(jìn)行；所述離子交換層析柱采用0.0～0.5M氯化鈉線形洗脫梯度洗脫結(jié)合的酸性海藻糖酶，收集含海藻糖酶活性部分；對收集的海藻糖酶活性部分超濾濃縮，再進(jìn)行分子篩層析，對分子篩層析后所得的海藻糖酶液經(jīng)超濾濃縮后，再進(jìn)行窄PH范圍等電聚焦電泳分離，電泳結(jié)束后，將含海藻糖酶活性部分的條帶切下來轉(zhuǎn)入透析管中，再將酶蛋白洗出，即得純化的酸性海藻糖酶。
8.如權(quán)利要求4所述的制備酸性海藻糖酶的方法，其特征在于所述純化中上柱前粗酶液的收集是指培養(yǎng)結(jié)束后，培養(yǎng)液用紗布過濾去除菌絲，收集濾液裝入透析袋中，分子截留量為5000，用10倍體積的去離子水在4℃透析30h，期間換4～5次水；然后用鹽酸將透析液pH值調(diào)節(jié)到5.8，溶液在13,500rpm、4℃離心20min，然后用三層濾紙抽濾，再用氯化鈉調(diào)節(jié)電導(dǎo)率為0.6～0.7ms/cm2，得到上柱前待純化粗酶液；所述第一步離子層析是20ml High Q Sepharoes陰離子柱用10mM 2-(N-嗎啉)-乙基磺酸pH5.8，電導(dǎo)0.6～0.7ms/cm2平衡緩沖液平衡后，將上述待純化粗酶液上柱，上柱流速為3.0ml/min，上完柱后用平衡緩沖液以3.0ml/min流速沖洗直至所有未結(jié)合的蛋白都被沖走；采用200ml 0.0～0.50M氯化鈉線形洗脫梯度洗脫結(jié)合的酸性海藻糖酶，收集管設(shè)置為2ml/管，收集含海藻糖酶活性部分用于下一步純化；所述第二步離子層析是指High Q Sepharoes陰離子層析后收集的酶液裝入透析袋中，在4℃條件下于2L 15mM醋酸緩沖液pH5.0，電導(dǎo)1.00～1.05ms/cm2中透析24h，其間換3次緩沖液；充分透析后的酶液再與15mM醋酸緩沖液pH5.0，電導(dǎo)1.00～1.05ms/cm2以等體積混合后，上2ml 25Q Sepharoes陰離子柱，此層析柱先用15mM醋酸緩沖液平衡過，上柱流速為1.0ml/min；上柱完畢后用平衡緩沖液以1.0ml/min流速沖洗直至所有未結(jié)合的蛋白都被沖走；采用100ml 0.0～0.50M氯化鈉線形洗脫梯度洗脫結(jié)合的酸性海藻糖酶，收集管設(shè)置為1ml/管，收集含海藻糖酶活性部分用于下一步純化；所述分子篩層析是指25Q Sepharoes陰離子洗脫得到的樣品經(jīng)0.5ml超濾離心管Millipore，10kDa超濾濃縮至1ml體積，然后進(jìn)行分子篩層析；2.6×60cm分子篩層析柱Sepharcyl-200s HR(Pharmacia)預(yù)先用15mM醋酸緩沖液pH5.0，電導(dǎo)1.05ms/cm2充分平衡后，然后通過上樣環(huán)上樣1ml，酸性海藻糖酶用同樣的醋酸緩沖液洗出，流速設(shè)置為0.5ml/min，收集體積設(shè)置為1.0ml/管，收集含海藻糖酶活性部分用于下一步純化；所述窄pH范圍等電聚焦分離是指分子篩層析后所得海藻糖酶液經(jīng)0.5ml超濾離心管Millipore，10kDa超濾濃縮體積至0.5ml，然后用pH值范圍為4.0～5.0預(yù)制等電聚焦膠板Pharmacia進(jìn)行電泳分離，電泳結(jié)束后，將含海藻糖酶活的條帶切下來，轉(zhuǎn)入透析管中，用電洗脫方式將酶蛋白洗出。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蟲生真菌金龜子綠僵菌菌株CQMa102酸性海藻糖酶及其制備方法。它采用活化金龜子綠僵菌菌株CQMa102孢子，并在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)能產(chǎn)生所述酶的微生物以形成所述的酶，并加以純化制得。制得的蛋白酶是糖蛋白，等電點4.7，分子量170kDa；Trehazolin是其特異性抑制劑，其IC
文檔編號C12N1/14GK1793348SQ200510057408
公開日2006年6月28日 申請日期2005年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月30日
發(fā)明者夏玉先, 趙華, 王中康, 殷幼平, 彭國雄 申請人:重慶大學(xué), 重慶重大生物技術(shù)發(fā)展有限公司