大豆紫色酸性磷酸酶GmPAP36、其編碼基因及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及大豆紫色酸性磷酸酶GmPAP36、其 編碼基因及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 土壤磷有50%~80%以有機(jī)態(tài)形式存在，植酸磷占一半以上;且植酸磷大多不溶 于水，不能被植物直接吸收利用（Lung et al.，2006;Bilyeu et al.，2008;George et al.，2008)。同時(shí)，每年施入土壤的大部分磷肥還會(huì)由于吸附、沉降和轉(zhuǎn)化作用成為有機(jī)態(tài) 形式而被固定于土壤，不能被當(dāng)季植物吸收(Baek et al.，2013;Wang et al.，2013)。據(jù)統(tǒng) 計(jì)，我國每年約施用1100萬噸純磷，占世界總用量30%左右，但磷肥當(dāng)季利用率卻僅有10% ~15%，相當(dāng)于每年約有1000萬噸純磷積累于土壤，形成植物不能直接利用的非有效態(tài)(吳 平，2010)。由此可見，土壤中的總磷含量并不低，只是植物可吸收利用的有效態(tài)磷含量較 低，即所謂的"遺傳學(xué)缺磷"。土壤現(xiàn)已成為巨大的"潛在磷庫"，亟待開發(fā)利用（Rose et al.，2013;Teng et al. ,2013)。因此，如何充分利用土壤中的有機(jī)態(tài)磷(尤其是植酸磷），減 少外部磷肥施入量就成為磷素營養(yǎng)研究中的重要課題，對(duì)于提高磷肥利用效率、解決植物 磷素短缺、緩解磷肥危機(jī)及減少環(huán)境磷污染等均具有重要意義。
[0003] 土壤中的有機(jī)磷(植酸磷)不可被直接吸收利用，但可經(jīng)根際周圍磷酸酶或植酸酶 水解后釋放出無機(jī)磷進(jìn)而被吸收利用，因而植物根際周圍的酸性磷酸酶或植酸酶對(duì)于提高 土壤磷的生物有效性具有重要作用（Richardson et al.，2001;Li et al.，2009;Tran et al. ,2010;Maougal et al. ,2014)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，酸性磷酸酶是植物對(duì)缺磷脅迫最早和最劇 烈的反應(yīng)之一，其活性高低甚至可以作為診斷植株磷素豐缺的指標(biāo)，也可作為磷高效品種 遴選的生化指標(biāo)(戴開結(jié)等，2006)。云杉根際土壤酸性磷酸酶活性為非根際土壤2.0~2.5 倍;油菜根際土壤中的磷酸酶活性可達(dá)到非根際土壤10倍;番茄在缺磷脅迫下的酸性磷酸 酶分泌量是正常條件的6倍(喬亞科等，2007)。可見，促使植株向根際分泌大量有活性、能分 解土壤有機(jī)磷的酸性磷酸酶，使有機(jī)磷分解為易于吸收利用的有效態(tài)，是增強(qiáng)植株抵御低 磷逆境的重要途徑。
[0004] 近年來，有學(xué)者從水稻、擬南芥、苜蓿、菜豆、白羽扇豆、番茄、煙草、馬鈴薯等植物 中克隆獲得酸性磷酸酶基因，且有些基因已在模式植物中開展功能研究(Madsen et al.， 2013;Sun et al.，2013;Zamani et al. ,2014)。但真正應(yīng)用于植物轉(zhuǎn)基因育種的卻寥寥無 幾，重要農(nóng)作物磷高效轉(zhuǎn)基因育種中仍然缺乏應(yīng)用潛力大、功能明確的酸性磷酸酶基因（李 喜煥等，2012)。
[0005] 肖凱等(2006)將蒺藜苜蓿中的酸性磷酸酶MtPAPl轉(zhuǎn)入擬南芥發(fā)現(xiàn)，在植酸鹽為唯 一磷源條件下，超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的生物學(xué)產(chǎn)量、無機(jī)磷和全磷含量均明顯高于對(duì)照;Ma等 (2009)將MtPAPl轉(zhuǎn)入白三葉草，在有機(jī)態(tài)磷條件下，轉(zhuǎn)基因植株的磷吸收量明顯增加，生物 產(chǎn)量也較野生型有所提高，植株利用有機(jī)態(tài)磷的能力得到明顯改善。谷俊濤等（2007)將白 羽扇豆中的酸性磷酸酶Apase轉(zhuǎn)入白三葉草，植酸鹽為唯一磷源條件下，超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株 的磷素累積量、鮮重和干重顯著增加，表明基因具有明顯增強(qiáng)白三葉草吸收有機(jī)態(tài)磷的能 力。Bozzo等(2002)研究番茄酸性磷酸酶基因發(fā)現(xiàn)，該酶在酸性條件下可水解胞外磷脂化合 物釋放出磷以供植物利用;Wang等(2009)將擬南芥酸性磷酸酶基因 AtPAPl 5轉(zhuǎn)入大豆，在酸 性土壤中生長的3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系產(chǎn)量性狀均明顯優(yōu)于野生型，單株莢數(shù)提高35.9%、 41.0%、59.0%，單株粒數(shù)提高46.0%、48.3%、66.7% liang等（2010)研究菜豆酸性磷酸 酶基因 PvPAP3發(fā)現(xiàn)，缺磷條件下，PvPAP3在葉和根中表達(dá)量升高，且在磷高效品種中的表達(dá) 量高于低效品種，與菜豆磷素利用效率顯著相關(guān)，進(jìn)一步分析還發(fā)現(xiàn)PvPAP3編碼蛋白可通 過利用胞外ATP作為磷源使植物適應(yīng)低磷狀態(tài)。
[0006] 關(guān)于大豆酸性磷酸酶基因，Li等（2012)曾利用已測序大豆基因組序列，通過同源 比對(duì)與生物信息學(xué)分析方法進(jìn)行預(yù)測，認(rèn)為在大豆基因組中可能存在35個(gè)酸性磷酸酶基 因，經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR分析這些候選基因表達(dá)差異發(fā)現(xiàn)，低磷(5μΜ KH2P〇4)處理?xiàng)l件下，基因分 別在大豆根系、莖桿、葉片、花瓣、豆莢、籽粒中誘導(dǎo)表達(dá)。盡管該研究預(yù)測了 35個(gè)大豆酸性 磷酸酶基因，但到目前為止，已克隆基因全長并開展功能研究的僅有4個(gè)（GmPAPl~ GmPAP4)。其中，GmPAPl、GmPAP2在低磷條件下誘導(dǎo)表達(dá)，但其功能研究并未深入開展 (LeBansky et al.，1992;Schenk et al.，1999;Liao et &1.，2003)。6111?厶？3是1^&〇等 (2003)克隆獲得的酸性磷酸酶基因，然而該基因功能研究發(fā)現(xiàn)，僅受NaCl鹽脅迫誘導(dǎo)，而不 受低磷脅迫誘導(dǎo)，是一個(gè)與大豆耐鹽性密切相關(guān)的基因。GmPAP4是Kong等（2014)克隆獲得 的酸性磷酸酶基因，該基因具有提高轉(zhuǎn)基因擬南芥磷素利用效率的功能，也是目前報(bào)道的 大豆中唯一具有分解利用有機(jī)態(tài)磷功能的酸性磷酸酶基因 ?？梢?，在諸多大豆酸性磷酸酶 候選基因中發(fā)掘與土壤有機(jī)磷(植酸磷)高效利用密切相關(guān)的功能基因非常必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供大豆紫色酸性磷酸酶GmPAP36、其編碼基因及應(yīng)用。
[0008]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的大豆紫色酸性磷酸酶GmPAP36,其氨基酸序列如 SEQ ID NO: 1所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的 氨基酸序列。
[0009] 本發(fā)明還提供所述大豆紫色酸性磷酸酶GmPAP36的編碼基因，其為大豆紫色酸性 磷酸酶GmPAP36基因，該基因的cDNA序列如SEQ ID N0:2所示。
[0010] 本發(fā)明還提供含有基因 GmPAP36的載體，優(yōu)選地，出發(fā)載體包括但不限于pCamE、 ρΖΥΙΟΙο
[0011] 攜帶有所述基因的表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微 注射、電穿孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞中（Weissbach，1998，Method for Plant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，第411-463頁；Geiserson和Corey， 1998,Plant Molecular Biology,2nd Edition)〇
[0012] 本發(fā)明還提供含有基因 GmPAP36或上述載體的宿主細(xì)胞、工程菌及轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。 [0013]本發(fā)明還提供基因 GmPAP36在提高轉(zhuǎn)基因植物對(duì)環(huán)境中磷元素利用率中的應(yīng)用。 其中，所述磷元素以有機(jī)態(tài)磷形式存在，優(yōu)選地，所述有機(jī)態(tài)磷為植酸磷。
[0014] 本發(fā)明還提供基因 GmPAP36在植物品種改良中的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明中涉及的植物包括但不限于擬南芥、大豆（例如大豆品種'中黃15 '、'冀 NF58'）。
[0016] 本發(fā)明進(jìn)一步提供一種轉(zhuǎn)基因植株的構(gòu)建方法，優(yōu)選采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法或花粉管 通道法，將含有基因 GmPAP36的載體轉(zhuǎn)入植物中，篩選轉(zhuǎn)基因植株。
[0017] 本發(fā)明利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)，獲得了紫色酸性磷酸酶基因 GmPAP36原核表 達(dá)蛋白，在IPTG誘導(dǎo)條件下，GmPAP36基因表達(dá)出一條分子量61.2KDa的融合蛋白，而對(duì)照 (轉(zhuǎn)空白質(zhì)粒)無該蛋白。
[0018] 本發(fā)明的大豆紫色酸性磷酸酶GmPAP36具有分解植株根際周圍植酸磷、提高轉(zhuǎn)基 因擬南芥及大豆根際植酸磷利用效率的功能，其特征如下：
[0019] (1)以植酸磷（土壤中有機(jī)態(tài)磷的主要存在形式）為唯一磷源處理42d~56d， GmPAP36基因在磷高效大豆品種'中黃15'中的表達(dá)量顯著或極顯著高于磷低效大豆品種 '牛毛黃'，且二者表達(dá)量的差異最大可達(dá)3.6倍，表明GmPAP36與植酸磷的分解利用密切相 關(guān)。
[0020] (2)與擬南芥野生型對(duì)照相比，轉(zhuǎn)GmPAP36的T3代超表達(dá)擬南芥植株在植酸磷處理 下的缺磷癥狀明顯減輕，表現(xiàn)出葉片較大、葉柄較長、生長勢(shì)強(qiáng)等特點(diǎn)，且植株根系酸性磷 酸酶活性、植酸酶活性、植株磷含量均較對(duì)照顯著或極顯著增加，植株生物重也比野生型對(duì) 照提高39.3%，二者差異達(dá)極顯著水平，表明GmPAP36具有提高轉(zhuǎn)基因擬南芥根際周圍植酸 磷利用效率的功能。
[0021] (3)與大豆野生型對(duì)照相比，超表達(dá)轉(zhuǎn)GmPAP36大豆植株在植酸磷處理下的根系酸 性磷酸酶活性、植酸酶活性、植株磷含量均較對(duì)照顯著或極顯著增加，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的單 株莢數(shù)比野生型對(duì)照分別增加25.0%、19.7%、32.9%，單株粒重分別增加15.1 %、14.4%、 17.7%，且達(dá)到顯著或極顯著水平，說明由于GmPAP36的轉(zhuǎn)入，使得轉(zhuǎn)基因大豆能夠分解利 用根際周圍的植酸磷，提高了植株體內(nèi)的磷素含量，受低磷影響較小，單株莢數(shù)和單株粒重 顯著增加，GmPAP36具有分解利用轉(zhuǎn)基因大豆根際周圍植酸磷的作用。
[0022] 本發(fā)明利用前期基于抑制性差減雜交（suppression subtractive hybridization，SSH)技術(shù)構(gòu)建的低磷誘導(dǎo)大豆根系cDNA差減文庫，從中選擇低磷脅迫誘導(dǎo) 表達(dá)的酸性磷酸酶候選EST，在此基礎(chǔ)上，克隆酸性磷酸酶候選基因序列，采用實(shí)時(shí)定量PCR 技術(shù)分析候選基因在植酸磷處理?xiàng)l件下的表達(dá)差異;構(gòu)建基因原核表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)基因原 核表達(dá)，同時(shí)構(gòu)建基因真核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化擬南芥、大豆，獲得轉(zhuǎn)基因陽性植株，分析基因 的生物學(xué)功能，為植物磷高效轉(zhuǎn)基因育種提供功能基因。
【附圖說明】
[0023]圖1是本發(fā)明實(shí)施例1中磷高效大豆品種'中黃15'在低磷處理?xiàng)l件下的cDNA進(jìn)行 PCR擴(kuò)增的結(jié)果圖。其中1泳道為空白對(duì)照，2泳道獲得約1.4kb左右的一條特異條帶。該條帶 與電子序列大小一致，回收該片段，與T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選重組子，經(jīng)測序分析 獲得擴(kuò)增片段序列。圖中Μ為DNA Marker DL 2000; 1為空白對(duì)照，2為'中黃15'低磷處理 cDNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果。
[0024]圖2是本發(fā)明實(shí)施例2中植酸磷處理下GmPAP36基因在'中黃15'（磷高效大豆品種） 與'牛毛黃'（磷低效大豆品種)根系中的差異表達(dá)結(jié)果圖。其中，橫坐標(biāo)表示植酸磷處理天 數(shù)，縱坐標(biāo)表示GmPAP36在'中黃15 '與'牛毛黃'根系的表達(dá)量。
[0025]圖3是本發(fā)明實(shí)施例3中GmPAP36基因原核表達(dá)蛋白SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果。圖中 箭頭所示為表達(dá)目的片段61.2KDa;M是蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量；1~3分別為未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的空菌 株BL21、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的BL21、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的BL21;4~6分別為IPTG誘導(dǎo)3h的空菌株、空質(zhì)