辛?；疓hrelin在促進牛卵母細胞體外成熟中的應用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種牛卵母細胞體外前成熟液，所述前成熟液以牛卵母細胞體外培養(yǎng)液為基質，所述基質中含有辛?；腉hrelin。本發(fā)明通過辛?；疓hrelin體外培養(yǎng)抑制牛卵母細胞減數(shù)分裂的恢復，從而使得卵母細胞核和細胞質同步成熟，進而提高了牛卵母細胞的質量以及體外發(fā)育能力。能夠成為新型的減數(shù)分裂制劑藥物在畜牧業(yè)生產上推廣應用，具有良好的市場效應和社會效應。
【專利說明】
辛醜化Ghre I i n在促進牛卵母細胞體外成熟中的應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明設及家畜配子胚胎工程技術領域，具體設及辛酷化化relin在促進牛卵母 細胞體外成熟中的應用。
【背景技術】
[0002] 牛卵母細胞體外成熟（In Vitro Maturation, IVM)作為胚胎體外生產技術（In Vitro Production，IVP)的=大技術環(huán)節(jié)之一，是一項重要的繁殖生物技術，也是決定體外 胚胎生產的關鍵技術。其通過體外成熟培養(yǎng)屠宰場廢棄卵巢有腔卵泡來源卵母細胞獲得大 量可用卵子，可W為育種、克隆、性別控制、細胞核移植、轉基因動物生產等提供豐富的成熟 卵源，變廢為寶。
[0003] 卵母細胞體外成熟是指卵母細胞離開卵泡環(huán)境后，在體外一定培養(yǎng)條件下能夠自 發(fā)恢復減數(shù)分裂進程，并獲得能夠正常受精W及進一步發(fā)育的能力。卵母細胞的體外成熟 是一個復雜的生理過程，主要包括細胞核成熟和細胞質成熟。但在體外成熟過程中，雖然能 夠使卵母細胞在體外環(huán)境下完成減數(shù)分裂，但是由于離開了卵泡液，細胞質在未發(fā)育好的 情況下細胞核恢復減數(shù)分裂，導致細胞核、細胞質成熟不同步，運樣就會造成卵母細胞質量 W及受精后胚胎發(fā)育能力較差，因此限制了此項技術的利用效率，細胞核、細胞質同步成熟 成為亟待解決的問題。
[0004] 鑒于W上原因，許多學者開發(fā)了卵母細胞體外兩段成熟培養(yǎng)方法，即通過體外使 用減數(shù)分裂抑制劑暫時可逆的阻止卵母細胞減數(shù)分裂恢復，同時促進胞質發(fā)育，然后移出 減數(shù)分裂抑制環(huán)境，進行體外成熟。其中發(fā)明專利CN 102899286 A公開了卵母細胞體外成 熟的培養(yǎng)液W及分段培養(yǎng)方法。
[0005] 化relinWhre在印歐語系作詞根，意為"grow")。目前，我國學術界對化relin尚沒 有統(tǒng)一的譯名，所W有生長激素促釋放劑、生長激素促分泌素、生長激素釋放膚、生長素和 腦腸膚等多種稱謂。Ghrelin含28個氨基酸殘基組成，其中經測定，發(fā)現(xiàn)在血液和組織中 GhrelinW兩種主要形式存在:N端辛酷化和脫酷化修飾的化relin。
[0006] Ghrelin的功能除了具有調節(jié)生長素的分泌、胃腸生理活動、能量代謝、屯、血管活 動等功能外，還具有調節(jié)生殖的作用。越來越多的研究表明，Ghrelin在生殖軸的不同層次 影響著動物的生殖。其中，對激素的分泌有著十分重要的調節(jié)作用。同時，化relin還具有調 節(jié)動物的發(fā)情，胚胎的發(fā)育等功能。
[0007] 但是，辛酷化化relin在牛卵母細胞體外分段成熟培養(yǎng)W及進一步用于體外受精、 胚胎生產的作用尚不確定，目前尚無此方面的研究報道。

【發(fā)明內容】

[000引本發(fā)明的目的是提供一種牛卵母細胞體外成熟前培養(yǎng)液。
[0009] 本發(fā)明另一目的是提供一種促進牛卵母細胞體外成熟的培養(yǎng)液及方法。
[0010] 本發(fā)明再一目的是提供辛酷化化relin在促進牛卵母細胞成熟中的應用及辛酷化 Ghrelin在制備用于促進牛卵母細胞體外成熟藥物/減數(shù)分裂抑制劑藥物中的應用。
[0011]所述牛卵母細胞體外前成熟培養(yǎng)液W牛卵母細胞體外培養(yǎng)液為基質，在所述基質 中含有辛酷化Ghrelin。
[001 ^ 優(yōu)選地，所述辛酷化趾re 1 in濃度為10-50ng/mL，更優(yōu)選，所述辛酷化Ghrel in濃度 為50ng/mL。
[0013] 優(yōu)選地，所述基質為不含h邱e S的TCM199培養(yǎng)液。
[0014] 本發(fā)明還提供牛卵母細胞體外成熟方法，其是將牛卵母細胞在上述牛卵母細胞體 外前成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)，然后進行體外成熟培養(yǎng)。牛卵母細胞采集后在添加辛酷化Ghrelin 的細胞培養(yǎng)液內前成熟處理6h，然后在成熟液內成熟28h，成熟后的卵母細胞進行體外受 精，然后進行體外胚胎培養(yǎng)。
[001引優(yōu)選地，所述牛卵母細胞為3-8mm的卵丘-卵母細胞復合體。
[0016] 優(yōu)選地，所述前成熟培養(yǎng)的培養(yǎng)時間為化;所述辛酷化化relin濃度為10-50ng/ mL，更優(yōu)選所述辛酷化G虹el in濃度為50ng/mL，所述基質為不含hepes的TCM199培養(yǎng)液。
[0017] 優(yōu)選地，所述體外成熟培養(yǎng)的成熟培養(yǎng)液為含有FSH 10iig/ml，LH10iig/ml，E2化 g/ml，肝素鋼lOiig/ml，半脫氨酸lOiig/ml，10%FBS的TCM199培養(yǎng)液;培養(yǎng)時間為2她。
[0018] 成熟培養(yǎng)后的卵母細胞還用于體外受精或體外胚胎生產。
[0019] 進一步，本發(fā)明提供辛酷化趾relin在促進牛卵母細胞體外成熟中的應用。
[0020] 進一步，本發(fā)明提供辛酷化化relin在制備用于促進牛卵母細胞體外成熟藥物/減 數(shù)分裂抑制劑藥物中的應用。
[0021] 有益效果：
[0022] 1)本發(fā)明應用辛酷化化relin前成熟處理牛卵母細胞，促進細胞核和細胞質成熟 同步，提高了卵母細胞的質量W及體外發(fā)育能力，促進了卵裂率W及囊胚率。辛酷化 Ghrelin可W作為新型的卵母細胞減數(shù)分裂抑制劑藥物在家畜胚胎工程上推廣應用。
[0023] 2)本發(fā)明所述的辛酷化化relin為體內存在的生物活性膚類物質，對卵母細胞的 毒害作用小。
【具體實施方式】：
[0024] W下實施例用于進一步說明本發(fā)明，但不應理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本 發(fā)明精神和實質的前提下，對本發(fā)明所作的修飾或者替換，均屬于本發(fā)明的范圍。實驗用卵 巢采自河北省大廠縣屠宰場，牛辛酷化化relin多膚由北京中科亞光生物科技有限公司合 成。
[0025] 實施例1卵母細胞成熟培養(yǎng)
[0026] (1)卵母細胞采集
[0027] 使用含有2ml抽卵液(含25mM hepes M199+l%PVA+200uM IBMX+1%雙抗）的 10ml 注射器從屠宰場獲取的牛卵巢表面抽取直徑3-8mm卵泡。將吸取卵母細胞后的吸卵液放入 7cm3國產培養(yǎng)皿中，在體視顯微鏡下挑選出胞質均勻，且有3層及W上緊密卵丘顆粒細胞包 裹的卵丘-卵母細胞復合體(cumulus-00巧te omplexes，COCs)用于體外前成熟培養(yǎng)。
[00%] (2)卵母細胞前成熟處理
[0029] 將挑選出的COCs在洗卵液(含h邱es M199+1%PVA巧OOuM IBMX+1%雙抗）中清洗3 次，在含有辛酷化化relin的前成熟液（添加1-lOOOng/ml濃度辛酷化化relin的M199培養(yǎng) 液）中清洗3次，然后放入預先在C〇2培養(yǎng)箱中平衡化的前成熟培養(yǎng)液的培養(yǎng)滴中（3.5cm3培 養(yǎng)皿，6化1體積培養(yǎng)液/滴，20枚COCs)，培養(yǎng)條件為含5 % C〇2的空氣，溫度38.5 °C，飽和濕 度，培養(yǎng)時間為化。前成熟后一部分COCs脫去顆粒細胞，4%多聚甲醒固定后DAPI染色在顯 微鏡下觀察辛酷化化relin對牛卵母細胞減數(shù)分裂的抑制情況(未添加辛酷化化relin的前 成熟液培養(yǎng)的COCs為對照），統(tǒng)計卵母細胞維持在生發(fā)泡(germinal vesicle，GV)階段的數(shù) 目。前成熟后的卵母細胞進行下一步成熟培養(yǎng)用于檢測發(fā)育能力W及受精能力。同時，收集 培養(yǎng)后的前成熟培養(yǎng)液，用于雌二醇、孕酬W及cAMP和MPK的檢測。結果見表1-3。
[0030]表1不同濃度辛酷化趾relin體外前成熟處理對牛卵母細胞減數(shù)分裂的影響 「nmi 1
[0032] 注：同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。
[0033] 表1實驗結果表明50ng/ml辛酷化化relin處理化后抑制了牛卵母細胞減數(shù)分裂， 卵母細胞維持在GV階段的比例顯著高于與對照(P<0.05)。
[0034] 表2不同濃度辛酷化化relin前處理對牛卵母細胞卵丘細胞復合體雌二醇和孕酬 分泌的影響
[0035]
[0
[0037] 表2結果顯示:5化g/ml的化relin能夠促進顆粒細胞中雌二醇和孕酬的分泌。
[0038] 表3不同濃度化relin前處理對牛卵母細胞卵丘細胞復合體cAMP和MAPK分泌的影 響 「nnoni

[0040] 表3結果顯示，G虹elin體外處理牛卵丘卵母細胞復合體化對卵丘細胞內MAPK分泌 有影響，50ng/ml處理濃度卵丘細胞內MAPK W及MPF水平最低。由此推測，G虹e 1 in在50ng/ml 處理濃度抑制卵母細胞GV抓發(fā)生主要是通過抑制MAPK的活性來實現(xiàn)的。有研究表明，在正 常情況下，MAPK在GVBD之前被激活，通過抑制mytl來活化MPF，從而刺激卵母細胞的GVBD。 [0041 ] (3)卵母細胞成熟培養(yǎng)
[0042] 前成熟處理后的牛卵母細胞在成熟液中進行體外成熟培養(yǎng)2她。
[0043] 在本發(fā)明中針對當前常用的體外成熟培養(yǎng)液進行了調整，本發(fā)明配置的成熟液A (F細 10μg/ml，LH 10μg/ml，E2 lμg/ml，肝素鋼 10μg/ml，半脫氨酸 10μg/ml，10%FBS的 TCM199培養(yǎng)液）W及常規(guī)成熟液B(添加 FSH 10μg/ml，LH liig/ml，E2 lμg/ml，EGF lOng/ml， 10%FBS的TCM199培養(yǎng)液），成熟培養(yǎng)時間為2她，同時沒有經過前成熟處理的卵母細胞設定 為對照。
[0044] 實施例2體外受精與體外胚胎生產
[0045] 用實施例1卵母細胞成熟培養(yǎng)的卵母細胞進行進一步實驗。
[0046] (1)體外受精
[0047] 采用培養(yǎng)皿微滴法，首先將成熟的卵母細胞在受精液(B0液+20mg/mlBSA+20mg/mL 肝素鋼+l〇〇mg/mL鏈霉素+100IU/mL青霉素）中清洗2-3次后放入平衡好的受精液中（放入量 為每60iil受精液，20枚卵母細胞），未添加辛酷化化relin的前成熟液培養(yǎng)的卵母細胞為對 照;然后采用上浮法處理冷凍精液，精子在2ml洗精液(B0液+3.38mg/mL咖啡因）上浮30min， 之后取上清600-800]il放入1.5ml離屯、管離屯、（1800轉，離屯、5min)2次，離屯、后除去上清加入 受精液最終體積為20化1，取40iU處理后的精液加入已放入卵母細胞的受精液中，精子終濃 度為1 X 106精子/ml，培養(yǎng)條件為5 % C〇2的空氣，溫度38.5 °C，飽和濕度，受精時間為化。
[004引（2)體外胚胎生產
[0049] 受精后的合子在前期發(fā)育液(CR1液+6mg/ml BSA，lOOul/滴)洗涂3次后采用微滴 兩步法培養(yǎng):首先在10化1前期發(fā)育液(20枚左右合子)培養(yǎng)2d，計數(shù)卵裂胚胎后移入10化1 后期發(fā)育液(CRl液+10%FBS)培養(yǎng)5d，隔天半量換液，培養(yǎng)條件為5%C02的空氣，溫度38.5 °C，飽和濕度，胚胎發(fā)育第7天計數(shù)囊胚數(shù)。結果見表4、表5。
[0050] 表4辛酷化Ghrelin前處理對體外牛卵母細胞受精后卵裂率的影響 「nn。1
[0052]注:同列不同字母表示差異顯著(P<0.05);卵裂率=卵裂數(shù)/卵母細胞數(shù)
[0053]表5辛酷化Ghrelin前處理對體外牛卵母細胞受精后囊胚率的影響 r00541
[0055] 注:同列不同字母表示差異顯著(P<0.05);囊胚率=囊胚數(shù)/卵母細胞數(shù)
[0056] 實驗結果表明辛酷化化rel in前成熟處理化后進行體外成熟培養(yǎng)，在成熟培養(yǎng)2她 后卵裂率(表4)和囊胚率(表5)均顯著高于對照(P<0.05)。成熟液A的效果要優(yōu)于B，差異顯 著。
[0057] 結論：由W上結果可知辛酷化化relin能抑制牛卵母細胞減數(shù)分裂進程，促進牛卵 母細胞體外發(fā)育能力，提高牛卵母細胞受精后卵裂率和囊胚發(fā)育率W及胚胎質量。因此，辛 酷化Ghrelin可作為潛在的減數(shù)分裂抑制劑應用于牛的卵母細胞體外培養(yǎng)。
【主權項】
1. 一種牛卵母細胞體外前成熟培養(yǎng)液，其特征在于，以牛卵母細胞體外培養(yǎng)液為基質， 在所述基質中含有辛?；疓hrelin。2. 根據(jù)權利要求1所述的牛卵母細胞體外前成熟培養(yǎng)液，其特征在于，所述辛?；?611代1;[11濃度為1〇-50即/111匕3. 根據(jù)權利要求1或2所述的牛卵母細胞體外前成熟培養(yǎng)液，其特征在于，所述辛酰化 611代1;[11濃度為5〇]^/111匕4. 根據(jù)權利要求1或2所述的牛卵母細胞體外前成熟培養(yǎng)液，其特征在于，所述基質為 不含hepes的TCM199培養(yǎng)液。5. 牛卵母細胞體外成熟培養(yǎng)的方法，其是將牛卵母細胞在權利要求1-4任一項所述的 牛卵母細胞體外前成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)，然后進行體外成熟培養(yǎng)。6. 根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于，所述牛卵母細胞為3-8mm的卵丘-卵母細胞 復合體。7. 根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于，所述牛卵母細胞的前成熟培養(yǎng)時間為6h。8. 根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于，所述體外成熟培養(yǎng)的培養(yǎng)液為含有FSH 10 μg/ml，LH 10μg/ml，E 2 lμg/ml，肝素鈉10μg/ml，半胱氨酸10μg/ml，10%FBS的TCM199培養(yǎng) 液。9. 辛?；疓hrel in在促進牛卵母細胞體外成熟中的應用。10. 辛?；疓hrelin在制備用于促進牛卵母細胞體外成熟藥物/減數(shù)分裂抑制劑藥物中 的應用。
【文檔編號】C12N5/075GK106047799SQ201610621595
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年8月1日
【發(fā)明人】許曉玲, 劉彥, 白佳樺, 馮濤, 宋玉清, 肖霖力, 肖銀霞
【申請人】北京市農林科學院