一種牛卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液及培養(yǎng)方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于細胞培養(yǎng)領域，具體涉及一種從絞股藍中分離純化出的天然產(chǎn)物，含 有該天然產(chǎn)物的牛卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液及培養(yǎng)方法。
【背景技術】
[0002] 絞股藍（Gynostemmapentaphyllum(Thunb. )Maki_no，GP)屬萌蘆科多年生蔓生草 本，又名七葉膽、五葉參等。因其葉有甜味在日本被稱為"甘茶蔓"。性涼、苦、微甘，歸肺、 脾、腎經(jīng)。具有益氣健脾，化痰止咳，清熱解毒的功效，可用于治療體虛乏力、虛勞失精、白細 胞減少癥、高脂血癥、病毒性肝炎、慢性胃腸炎、慢性氣管炎。該植物主要生長于亞熱帶，全 世界約有16種和3個變種，我國有15種和3個變種，廣泛分布秦嶺及長江以南地區(qū)。
[0003] 絞股藍主要化學成分為絞股藍皂苷，分布于植物營養(yǎng)器官包括同化組織及韌皮部 薄壁細胞，其含量因植物的部位不同而有所差別，一般情況下絞股藍葉中含量最高。目前從 絞股藍中共分離得到140多種絞股藍皂苷，其中絞股藍皂苷3、4、8、12分別與人參皂苷Rbi、 他3、1?(1、&結(jié)構(gòu)相同，為同物異名。此外，絞股藍還含有黃酮類、糖類、萜類等多種化學成分。
[0004] 現(xiàn)代藥理研究表明，絞股藍是一種化學成分比較明確的植物，具有藥效良好、毒副 作用小等特點。絞股藍皂苷對胃癌、宮頸癌、舌癌等培養(yǎng)癌細胞均具有顯著的細胞毒作用。 絞股藍皂苷具有顯著降低膽固醇（TCH)、甘油三脂（TG)、低密度脂蛋白（LDL)、升高高密度 脂蛋白（HDL)、保護血管內(nèi)壁，阻止脂質(zhì)在血管壁沉積，抗動脈硬化的作用。絞股藍可以調(diào) 節(jié)氧在體內(nèi)分解后產(chǎn)生的廢物一一脂肪酸，達到降血脂的目的。絞股藍皂苷具有明顯降低 血粘稠度、調(diào)整血壓功能、同時能防止微血栓形成并增加心肌細胞對缺氧的耐力，起到保護 心肌的作用。絞股藍皂苷可提高衰老成纖維細胞增殖能力，且增殖效應呈時間和濃度依賴 性，延緩細胞衰老。絞股藍具有免疫調(diào)節(jié)作用，其活性主要體現(xiàn)為：增強非特異性免疫、體液 免疫、細胞免疫；影響淋巴細胞轉(zhuǎn)化和白細胞介素2分泌；增強自然殺傷細胞（NK)的功能。 此外，絞股藍還可制成保健茶、飲料、食品添加劑等功能性食品，具有廣闊的開發(fā)前景。
[0005] 隨著現(xiàn)代繁殖生物技術的發(fā)展及胚胎體外生產(chǎn)技術的逐步完善，利用體外受精、 體細胞核移植等技術生產(chǎn)體外胚胎已呈現(xiàn)出廣闊的應用前景。家畜胚胎體外生產(chǎn)尤其是體 細胞核移植是快速擴大優(yōu)秀種群數(shù)量的有效途徑。獲得足夠數(shù)量的成熟卵母細胞是胚胎體 外生產(chǎn)的前提條件。雖然，從活體動物采集卵母細胞已經(jīng)在生產(chǎn)中得到了初步應用，但是這 種方法具有操作復雜、對母畜傷害大、需要精密儀器及獲取卵母細胞數(shù)目少等不足。對于大 規(guī)模的通過體外受精或是體細胞核移植生產(chǎn)體外胚胎，從屠宰場采集的卵巢中抽取卵母細 胞并進行體外培養(yǎng)是獲取成熟卵母細胞最有效、最經(jīng)濟的途徑。
[0006]目前的研究表明，體外成熟的卵母細胞進行體外受精后，其受精、卵裂及早期胚胎 發(fā)育率較低，囊胚發(fā)育率低于50%，核移植胚胎的發(fā)育率更低，限制了胚胎體外生產(chǎn)技術在 實踐中的推廣應用。導致體外胚胎發(fā)育率低的一個主要原因是卵母細胞體外成熟及培養(yǎng)系 統(tǒng)的缺陷造成胞質(zhì)未完全成熟所致。卵母細胞成熟包括核成熟和胞質(zhì)成熟，只有二者均成 熟才具有受精能力和發(fā)育潛力。核成熟的標志是第一極體的排放，而胞質(zhì)成熟的判斷標準 尚未統(tǒng)一。卵母細胞受精后的前三個細胞周期的一切事件是由成熟過程中貯存在細胞質(zhì)中 的rRNA、mRNA和蛋白質(zhì)負責完成，因此胞質(zhì)成熟對卵母細胞受精后發(fā)育潛力的影響顯得尤 為重要。同樣對用于核移植的受體卵母細胞，胞質(zhì)的成熟質(zhì)量將直接影響重構(gòu)胚能否維持 正常的分裂及后期發(fā)育。因此，改進卵母細胞體外成熟培養(yǎng)條件對提高體外胚胎生產(chǎn)效率 意義重大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種從絞股藍中分離純化出的天然產(chǎn)物，含有該天然產(chǎn)物 的牛卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液及培養(yǎng)方法。
[0008] 上述目的是通過如下技術方案實現(xiàn)的：
[0009] 具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I)，
[0010]
[0011] 所述的化合物（I)的制備方法，包含以下操作步驟：(a)將絞股藍的干燥葉粉 碎，用80~90 %乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和 水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步驟 (a)中乙酸乙酯萃取物用D101型大孔吸附樹脂除雜，先用10 %乙醇洗脫8個柱體積，再用 80 %乙醇洗脫6個柱體積，收集80 %乙醇洗脫液，減壓濃縮得80 %乙醇洗脫物浸膏；（c)步 驟（b)中80 %乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為75:1、45:1、25:1、12:1和 1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到5個組分；（d)步驟（c)中組分4用正相硅膠進一步分 離，依次用體積比為20:1、12:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟 (d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為70%的甲醇水溶液 等度洗脫，收集10~12個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物（I)。
[0012] 進一步地，所述的化合物（I)的制備方法中步驟（a)中熱回流的乙醇為85%乙 醇。
[0013] 進一步地，所述的化合物（I)的制備方法中步驟（b)中所述大孔吸附樹脂為 D101型大孔吸附樹脂。
[0014] -種牛卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液，所述牛卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液組成如下：所 述化合物（I)50~70yg/mL，大豆苷元0.4~0.6yg/mL，青霉素90~110IU/mL，鏈霉 素90~110yg/mL，血清體積百分含量8%~20%，溶劑為常規(guī)培養(yǎng)液；所述常規(guī)培養(yǎng)液為 M199、DMEM、F12、MEM中的一種或多種。
[0015] 進一步地，所述培養(yǎng)液組成如下：所述化合物（I)60iig/mL，大豆苷元0? 5iig/ mL，青霉素100IU/mL，鏈霉素100yg/mL，血清體積百分含量10%，溶劑為M199培養(yǎng)液。
[0016] 利用所述牛卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液進行牛卵母細胞體外培養(yǎng)及體外受精的方 法，所述方法包括：（1)配制牛卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液；（2)將牛卵母細胞體外成熟培養(yǎng) 液在一次性塑料培養(yǎng)皿上形成體積為50~100yL的培養(yǎng)小滴，置38~39°C環(huán)境中預熱 1~3小時，牛卵母細胞經(jīng)沖洗后放入預熱后的培養(yǎng)小滴，在38~39°C、5% 0)2的環(huán)境內(nèi) 培養(yǎng)20~24小時；（3)用受精培養(yǎng)液在一次性塑料培養(yǎng)皿上形成體積為50~100yL的 受精小滴，置38~39°C環(huán)境中預熱1~3小時，將儲存在液氮罐中的凍精解凍，然后與步 驟⑵培養(yǎng)后的牛卵母細胞一同放入受精小滴，在38~39°C、5%C02的環(huán)境內(nèi)培養(yǎng)15~ 18小時，進行受精，得到受精后的早期胚胎；(4)用胚胎體外培養(yǎng)液在一次性塑料培養(yǎng)皿上 形成體積為50~100yL的培養(yǎng)小滴，置38~39°C環(huán)境中預熱1~3小時，將受精后的早 期胚胎沖洗后，放入培養(yǎng)小滴中，在38~39°C、5% 0)2的環(huán)境內(nèi)培養(yǎng)。
[0017] 進一步地，所述的牛卵母細胞體外培養(yǎng)及體外受精的方法中步驟（3)所述受精培 養(yǎng)液為含5~10mg/mL肝素的B0液或者Tyrode's改良液。
[0018] 進一步地，所述的牛卵母細胞體外培養(yǎng)及體外受精的方法中步驟（4)所述胚胎體 外培養(yǎng)液為含體積百分比10 %血清的S0F培養(yǎng)液。
[0019] 所述的化合物（I)在制備牛卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液方面的應用。
[0020] 有益效果：本發(fā)明提供了一種結(jié)構(gòu)新穎的雜萜類化合物（I)，含有該化合物的牛 卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液，和基于該培養(yǎng)液的牛卵母細胞體外成熟培養(yǎng)方法；本發(fā)明將化 合物（I)和大豆苷元組合應用于牛卵母細胞體外培養(yǎng)，相比于單獨使用化合物（I)或 者大豆苷元，可以顯著促進卵母細胞的細胞質(zhì)成熟，解決了目前牛體外成熟的卵母細胞受 精后胚胎體外發(fā)育率低的問題。這可能與化合物（I)和大豆苷元聯(lián)用對牛卵母細胞具有 保護作用有關。
【附圖說明】
[0021] 圖1為化合物（I)結(jié)構(gòu)式；
[0022] 圖2為化合物（I)理論E⑶值與實驗E⑶值比較。
【具體實施方式】
[0023] 下面結(jié)合實施例進一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護范 圍。盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對 本發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的實質(zhì)和范圍。
[0024] 實施例1 :化合物（I)