一種衰老腎小管細(xì)胞的分選方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種分選衰老細(xì)胞的方法，特別涉及一種應(yīng)用DcR2抗體偶聯(lián)免疫磁珠分選衰老腎小管細(xì)胞的分選方法。所述的方法是首先向待分選的細(xì)胞液中加入DcR2抗體，使DcR2抗體與細(xì)胞結(jié)合，得預(yù)處理的分選細(xì)胞液；然后向預(yù)處理的分選細(xì)胞液中加入免疫磁珠，用免疫磁珠分離方法進(jìn)行分離，免疫磁珠吸附的部分為衰老腎小管細(xì)胞。該方法可分選出高純度的衰老腎小管細(xì)胞，并進(jìn)一步證實(shí)分選出的衰老腎小管細(xì)胞具有生物學(xué)活性。
【專利說(shuō)明】
一種衰老腎小管細(xì)胞的分選方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種分選衰老細(xì)胞的方法，特別涉及一種應(yīng)用DcR2抗體偶聯(lián)免疫磁珠分選衰老腎小管細(xì)胞的分選方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]各種病理性應(yīng)激刺激下，可引發(fā)細(xì)胞發(fā)生與增齡無(wú)關(guān)的細(xì)胞周期停滯狀態(tài)，即應(yīng)激性衰老(Stress-1nduced premature senescence )。衰老細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞扁平肥大，月旨褐素沉積，特異性的標(biāo)志是34-01&1、？16、？21、5411?等。細(xì)胞衰老后細(xì)胞增殖與再生能力喪失，還通過釋放衰老相關(guān)分泌表型(SASP)等機(jī)制，不僅導(dǎo)致器官加速衰老，同時(shí)也是引發(fā)腫瘤、心腦血管疾病以及糖尿病等重大慢性疾病進(jìn)展的重要機(jī)制。
[0003]慢性腎臟病(CKD)已被證實(shí)是一種組織器官早衰的臨床模型。大量研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞應(yīng)激衰老是高血壓腎病、移植性腎病、糖尿病腎病等CKD重要的組織學(xué)改變特征之一。糖尿病腎病(DN)作為最常見的CKD之一，亦是導(dǎo)致終末期腎衰竭的主要原因。腎小管間質(zhì)損傷在 DN進(jìn)展發(fā)揮十分重要作用。腎小管上皮細(xì)胞富含線粒體，是高能耗、高代謝細(xì)胞，在物質(zhì)代謝紊亂和血流動(dòng)力學(xué)異常條件下易發(fā)生氧化應(yīng)激進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)激衰老。在DN患者腎組織中發(fā)現(xiàn)，腎小管細(xì)胞衰老最為顯著，并且衰老腎小管細(xì)胞與腎小管間質(zhì)損傷及腎功能損害密切關(guān)聯(lián)。因此，研究衰老腎小管細(xì)胞的病理生理學(xué)意義在DN進(jìn)展中具有重要意義。
[0004]為了研究衰老細(xì)胞的病理生理學(xué)效應(yīng)，我們需要高純度且具有生物學(xué)活性的衰老細(xì)胞。既往采用流式細(xì)胞分析技術(shù)基于衰老細(xì)胞肥大和脂褐素分選衰老細(xì)胞，雖然可以獲得具有一定生物學(xué)活性的衰老細(xì)胞，但純度并不高。此外，在流式細(xì)胞儀高壓條件下，可損傷細(xì)胞活性。而如果利用流式細(xì)胞分選技術(shù)基于其他經(jīng)典的核蛋白衰老標(biāo)志如P16分選衰老細(xì)胞，雖可獲得高純度衰老細(xì)胞，但因?yàn)橥ㄍ讣?xì)胞膜而生物學(xué)活性喪失。因此，開發(fā)出一種新型的損傷性小的分選衰老細(xì)胞的技術(shù)方法尤為必要。
[0005]
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]有鑒于此，本發(fā)明提供了一種衰老腎小管細(xì)胞的分選方法，該方法可分選出高純度具有生物學(xué)活性的衰老腎小管細(xì)胞。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為:一種衰老腎小管細(xì)胞的分選方法，包括如下進(jìn)行的步驟:(1)向待分選的細(xì)胞液中加入DcR2抗體，使DcR2抗體與細(xì)胞結(jié)合，得預(yù)處理的分選細(xì)胞液；(2)向預(yù)處理的分選細(xì)胞液中加入免疫磁珠，用免疫磁珠分離方法進(jìn)行分離，免疫磁珠吸附的部分為衰老腎小管細(xì)胞。
[0008]免疫磁珠細(xì)胞分選(MACS)是細(xì)胞分選的新型技術(shù)方法。分選細(xì)胞具有純度高、對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，不影響細(xì)胞生物學(xué)特異的特點(diǎn)。免疫磁珠分選細(xì)胞是基于細(xì)胞膜上特異性抗原進(jìn)行細(xì)胞分選。[00〇9] DcR2(Decoyreceptor2)作為跨膜受體，近年被證實(shí)為衰老細(xì)胞的膜性生物標(biāo)志， 本申請(qǐng)的發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)DN腎組織中DcR2特異性表達(dá)于腎小管細(xì)胞。因此，基于DcR2利用免疫磁珠分選出高純度且具有活性的衰老細(xì)胞是可行的方案。在本申請(qǐng)中，發(fā)明人通過構(gòu)建高糖刺激原代腎小管細(xì)胞的衰老模型(衰老細(xì)胞陽(yáng)性率約30-40%)，采用免疫磁珠分選出 DcR2陽(yáng)性細(xì)胞，并進(jìn)一步證實(shí)DcR2陽(yáng)性細(xì)胞具有生物學(xué)活性，并且是高純度的衰老細(xì)胞。
[0010]進(jìn)一步，所述的分選方法，所述步驟(2)中，免疫磁珠為抗兔IgG免疫磁珠。
[0011]進(jìn)一步，所述的分選方法，所述步驟(1)中DcR2抗體的濃度與待分選的細(xì)胞液的體積比為 lyg/yl: l〇〇-5〇〇iil。
[0012]進(jìn)一步，優(yōu)選的，DcR2抗體的濃度與待分選的細(xì)胞液的體積比為lyg/yl: lOOiil。[0〇13]進(jìn)一步，所述的分選方法，所述步驟(2)中，免疫磁珠與細(xì)胞的比例為:每1個(gè)細(xì)胞加入20-50ul免疫磁珠。
[0014]進(jìn)一步，所述的分選方法，所述步驟(1)的具體方法是:向待分選的細(xì)胞液中加入 DcR2抗體，充分混勻，4°C ± 2°C孵育0.5-1.5小時(shí)，離心，去上清，加入緩沖液洗滌1-3次，離心，去上清，加入緩沖液重懸，得預(yù)處理的分選細(xì)胞液。
[0015]進(jìn)一步，所述的分選方法，所述步驟(2)的具體方法是:向預(yù)處理的分選細(xì)胞液中加入免疫磁珠，充分混勻，4°C ± 2°C孵育0.5-1.5小時(shí)，離心，去上清，加入緩沖液洗滌1-3 次，離心，去上清，加入緩沖液重懸，然后過免疫磁珠分選柱，用緩沖液重復(fù)洗滌免疫磁珠分選柱1-3次，然后取下免疫磁珠分選柱，免疫磁珠吸附的部分為衰老腎小管細(xì)胞。
[0016]進(jìn)一步，所述的分選方法，所述緩沖液為含0.5%BSA和2.0mmo 1/L EDTA的磷酸緩沖鹽溶液。優(yōu)選所述緩沖液的pH值為7.2。
[0017]本發(fā)明還保護(hù)DcR2抗體偶聯(lián)免疫磁珠在衰老腎小管細(xì)胞分選中的應(yīng)用。
[0018]【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1 DcR2陽(yáng)性細(xì)胞與DcR2陰性細(xì)胞的DcR2表達(dá)情況。[〇〇2〇]圖2 DcR2陽(yáng)性細(xì)胞與DcR2陰性細(xì)胞形態(tài)及增殖能力評(píng)估結(jié)果。[〇〇21] 圖3 DcR2陽(yáng)性細(xì)胞與DcR2陰性細(xì)胞SA-0-gal染色結(jié)果。[〇〇22] 圖4 DcR2陽(yáng)性細(xì)胞與DcR2陰性細(xì)胞CyclinDl染色結(jié)果。[〇〇23] 圖5 DcR2陽(yáng)性細(xì)胞與DcR2陰性細(xì)胞pl6染色結(jié)果。[〇〇24] 圖6 DcR2陽(yáng)性細(xì)胞與DcR2陰性細(xì)胞p21染色結(jié)果。【具體實(shí)施方式】[〇〇25]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于此。
[0026]以下實(shí)施例中所涉及的主要實(shí)驗(yàn)儀器及試劑有:主要實(shí)驗(yàn)儀器:免疫磁珠分選器、免疫磁珠分選柱(LS柱)、試管混勾器(德國(guó)Miltenyi)，激光共聚焦顯微鏡、倒置顯微鏡(德國(guó)Leica)，超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)ThermoForm)、恒溫孵箱、恒溫水浴箱、手術(shù)器械(上海躍進(jìn))，微量加樣器(美國(guó)Gilson)。[〇〇27]實(shí)驗(yàn)試劑:抗兔IgG免疫磁珠(德國(guó)Miltenyi)，腎小管上皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基(美國(guó)promocell)，2 型膠原酶、BSA(美國(guó)sigma)，標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清、胰蛋白酶(美國(guó)Hyclone公司)，SA-0-gal檢測(cè)試劑盒、熒光二抗Cy3、熒光二抗FITC、DAPI工作液(碧云天)，pl6抗體、p21抗體(美國(guó) santacruz)、DcR2抗體、cylinDl抗體(英國(guó)Abeam公司)、葡萄糖等其他常用化學(xué)試劑(重慶試劑)。
[0028]實(shí)施例1構(gòu)建高糖刺激原代腎小管細(xì)胞的衰老模型 1、原代腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)(1)將2-3周齡C57/BL6雄性小鼠斷頸處死，無(wú)菌獲取雙腎，用含1%胎牛血清的枸櫞酸緩沖液反復(fù)沖洗雙腎。[〇〇29](2)將腎皮質(zhì)切成小塊，用含1%胎牛血清的枸櫞酸緩沖液反復(fù)沖洗，然后1500轉(zhuǎn)離心5分鐘。
[0030](3)取離心后的固體部分加膠原酶于37°C消化腎組織30min。[〇〇31](4)取步驟(3)消化后的組織雙重過濾，依次通過180uM和80uM篩網(wǎng)，同時(shí)反復(fù)多次研磨腎組織。[〇〇32](5)1%BSA溶液反復(fù)沖洗篩網(wǎng)和過濾腎組織碎片，然后1500轉(zhuǎn)離心5分鐘。[〇〇33](6)取離心后的組織接種至培養(yǎng)皿，室溫靜置2小時(shí)，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。[〇〇34](7)48小時(shí)后首次更換培養(yǎng)基，此后每?jī)商旄鼡Q1次，所述培養(yǎng)基為市售的進(jìn)口成品培養(yǎng)基。[〇〇35]2、消化傳代至第二代腎小管細(xì)胞取第1步中培養(yǎng)的原代腎小管上皮細(xì)胞進(jìn)行消化，傳代培養(yǎng)至第二代腎小管細(xì)胞。
[0036]3、高糖(30mmol/L)誘導(dǎo)腎小管細(xì)胞衰老待第2步中培養(yǎng)的第二代腎小管細(xì)胞增殖至覆蓋率約為30%時(shí)，更換為30mmol/L的高糖培養(yǎng)基(成品培養(yǎng)基中加入50%葡萄糖配置成30mmol/L高糖培養(yǎng)基)誘導(dǎo)72h，建立高糖誘導(dǎo)的腎小管細(xì)胞衰老模型。
[0037]實(shí)施例2免疫磁珠分選DcR2陽(yáng)性細(xì)胞與DcR2陰性細(xì)胞(1)取實(shí)施例1中建立的腎小管細(xì)胞衰老模型，進(jìn)行細(xì)胞消化，制備細(xì)胞懸液，并計(jì)數(shù)。 然后1500轉(zhuǎn)離心5分鐘，去掉上清液即得待分選的細(xì)胞液。[〇〇38](2)向待分選的細(xì)胞液中加入DcR2抗體，充分混勻，4°C孵育1小時(shí)，1500轉(zhuǎn)離心5分鐘，去上清，加入緩沖液(磷酸緩沖鹽溶液，其中含0.5%BSA和2.0mm〇l/L EDTA，pH值為 7.2)洗滌1-3次，1500轉(zhuǎn)離心5分鐘，去上清，加入緩沖液重懸，得預(yù)處理的分選細(xì)胞液。 DcR2抗體的濃度與待分選的細(xì)胞液的體積比為lyg/yl: 100yl。
[0039](3)向預(yù)處理的分選細(xì)胞液中加入免疫磁珠，免疫磁珠的加入量按照每107個(gè)細(xì)胞加20ul免疫磁珠進(jìn)行加入，然后充分混勻，4°C孵育1小時(shí)，1500轉(zhuǎn)離心5分鐘，去上清，加入緩沖液(磷酸緩沖鹽溶液，其中含〇.5%BSA和2.0mmo 1 /L EDTA，pH值為7.2)洗滌1 -3次，1500 轉(zhuǎn)離心5分鐘，去上清，加入緩沖液重懸得細(xì)胞混懸液(108個(gè)/ul)。
[0040](4)LS柱上免疫磁珠分選器，加入3ml緩沖液(磷酸緩沖鹽溶液，其中含0.5%BSA和 2.0mmol/L EDTA，pH值為7.2)潤(rùn)濕，取500微升細(xì)胞混懸液待分選，細(xì)胞混懸液過免疫磁珠分選柱。然后用緩沖液(磷酸緩沖鹽溶液，其中含〇.5%BSA和2.0mmol/L EDTA，pH值為7.2)重復(fù)洗滌免疫磁珠分選柱2次，同時(shí)所收集的細(xì)胞為DcR2陰性細(xì)胞。
[0041](5)然后取下免疫磁珠分選柱，3ml緩沖液大力沖洗2遍，所收集的細(xì)胞為DcR2陽(yáng)性細(xì)胞。
[0042]實(shí)施例3免疫磁珠分選DcR2陽(yáng)性細(xì)胞與DcR2陰性細(xì)胞的鑒定 (l)DcR2陽(yáng)性細(xì)胞與DcR2陰性細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察待細(xì)胞懸液接種2小時(shí)后，將培養(yǎng)瓶置于倒置顯微鏡下觀察DcR2陰性細(xì)胞和DcR2陽(yáng)性細(xì)胞貼壁能力。分別于接種第ld，第3d，第5d于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量增加情況。[〇〇43](2)DcR2陽(yáng)性細(xì)胞與DcR2陰性細(xì)胞衰老表型檢測(cè)1)細(xì)胞固定，然后用PBS沖洗3次，每次沖洗5min。[0〇44]2)SA-0-gal染色(按照說(shuō)明書進(jìn)行操作)，滴加一抗DcR2、cyclinDl、pl6、p21^J^^^，4°C孵育過夜。[〇〇45]3)然后再用PBS沖洗3次，每次沖洗5min。
[0046]4)滴加相應(yīng)種屬熒光二抗，37°C孵育1小時(shí)。[〇〇47]5)用PBS沖洗3次，每次沖洗5min。[〇〇48]6)滴加DAPI工作液，常溫下靜置lOmin，然后用roS沖洗3次，每次沖洗5min，最后用PBS浸泡備用。[〇〇49](3)DcR2陽(yáng)性細(xì)胞與DcR2陰性細(xì)胞DcR2表達(dá)情況免疫熒光共染發(fā)現(xiàn)DcR2陽(yáng)性細(xì)胞均表達(dá)DcR2,而DcR2陰性細(xì)胞不表達(dá)DcR2。表明免疫磁珠分選可獲得高純度的DcR2陽(yáng)性細(xì)胞和DcR2陰性細(xì)胞。結(jié)果如圖1所示。
[0050](4)DcR2陽(yáng)性細(xì)胞與DcR2陰性細(xì)胞形態(tài)及增殖能力評(píng)估通過連續(xù)培養(yǎng)觀察細(xì)胞至第5天發(fā)現(xiàn)，DcR2陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)扁平肥大狀，通過計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn) DcR2陽(yáng)性細(xì)胞基本不增殖。而DcR2陰性細(xì)胞呈鋪路石樣，折光性好，增殖能力強(qiáng)。表明DcR2 陽(yáng)性細(xì)胞不具有增殖能力。結(jié)果如圖2所示。[〇〇51 ](5)DcR2陽(yáng)性細(xì)胞與DcR2陰性細(xì)胞衰老表型檢測(cè)1 )DcR2陽(yáng)性細(xì)胞與DcR2陰性細(xì)胞SA-0-gal染色SA-13-gal染色發(fā)現(xiàn)，DcR2陽(yáng)性細(xì)胞陽(yáng)性率較非分選細(xì)胞明顯增高，DcR2陰性細(xì)胞陽(yáng)性率較非分選細(xì)胞明顯降低。表明免疫磁珠分選可將衰老細(xì)胞純度提高。結(jié)果如圖3所示。 [〇〇52]2)DcR2陽(yáng)性細(xì)胞與DcR2陰性細(xì)胞CyclinDl、pl6、p21染色激光共聚焦染色發(fā)現(xiàn)DcR2陽(yáng)性細(xì)胞07〇1111〇1、？16、？21陽(yáng)性率較0(^2陰性細(xì)胞明顯增高，表明DcR2陽(yáng)性細(xì)胞具有衰老表型。結(jié)果如圖4-圖6所示。[〇〇53]由上述結(jié)果可知，基于DcR2利用免疫磁珠分選技術(shù)可分選出高純度(80%以上)具有生物學(xué)活性的衰老腎小管細(xì)胞，能夠?yàn)楹罄m(xù)研究DN進(jìn)展中衰老腎小管細(xì)胞的病理生理學(xué)意義奠定了夯實(shí)的基礎(chǔ)。
[0054]實(shí)施例4免疫磁珠分選衰老腎小管細(xì)胞(1)取待分選的細(xì)胞液，向待分選的細(xì)胞液中加入DcR2抗體，DcR2抗體的濃度與待分選的細(xì)胞液的體積比為1 yg/y 1:300y 1然后充分混勻，4 °C ± 2 °C孵育0.5-1.5小時(shí)，離心，去上清，加入緩沖液洗滌1-3次，離心，去上清，加入緩沖液重懸，得預(yù)處理的分選細(xì)胞液。
[0055](2)向預(yù)處理的分選細(xì)胞液中加入免疫磁珠，免疫磁珠與細(xì)胞的比例為:每108個(gè)細(xì)胞加入40ul免疫磁珠，然后充分混勻，4°C ± 2 °C孵育0.5-1.5小時(shí)，離心，去上清，加入緩沖液洗滌1-3次，離心，去上清，加入緩沖液重懸，然后過免疫磁珠分選柱，用緩沖液重復(fù)洗滌免疫磁珠分選柱1-3次，然后取下免疫磁珠分選柱，免疫磁珠吸附的部分為衰老腎小管細(xì)胞。
[0056]最后說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種衰老腎小管細(xì)胞的分選方法，其特征在于，包括如下進(jìn)行的步驟:(1)向待分選的細(xì)胞液中加入DcR2抗體，使DcR2抗體與細(xì)胞結(jié)合，得預(yù)處理的分選細(xì)胞 液；(2)向預(yù)處理的分選細(xì)胞液中加入免疫磁珠，用免疫磁珠分離方法進(jìn)行分離，免疫磁珠 吸附的部分為衰老腎小管細(xì)胞。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分選方法，其特征在于，所述步驟(2)中，免疫磁珠為抗兔IgG 免疫磁珠。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分選方法，其特征在于，所述步驟(1)中DcR2抗體的濃度與待 分選的細(xì)胞液的體積比為lyg/yl:1〇〇-5〇〇yl。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分選方法，其特征在于，所述步驟(2)中，免疫磁珠與細(xì)胞的比 例為:每107_8個(gè)細(xì)胞加入20-50ul免疫磁珠。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分選方法，其特征在于，所述步驟(1)的具體方法是:向待分選 的細(xì)胞液中加入DcR2抗體，充分混勻，4°C ± 2°C孵育0.5-1.5小時(shí)，離心，去上清，加入緩沖 液洗滌1-3次，離心，去上清，加入緩沖液重懸，得預(yù)處理的分選細(xì)胞液。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分選方法，其特征在于，所述步驟(2)的具體方法是:向預(yù)處理 的分選細(xì)胞液中加入免疫磁珠，充分混勻，4°C ± 2°C孵育0.5-1.5小時(shí)，離心，去上清，加入 緩沖液洗滌1-3次，離心，去上清，加入緩沖液重懸，然后過免疫磁珠分選柱，用緩沖液重復(fù) 洗滌免疫磁珠分選柱1-3次，然后取下免疫磁珠分選柱，免疫磁珠吸附的部分為衰老腎小管 細(xì)胞。7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的分選方法，其特征在于，所述緩沖液為含0.5%BSA和 2.0mmol/L EDTA的磷酸緩沖鹽溶液。8.DcR2抗體偶聯(lián)免疫磁珠在衰老腎小管細(xì)胞分選中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N5/071GK106047794SQ201610470775
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年6月23日
【發(fā)明人】陳佳, 何婭妮, 付碧瓊, 陳客宏
【申請(qǐng)人】中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院