專利名稱：誘導(dǎo)、增強(qiáng)或調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的免疫刺激性雙鏈rna和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及可用于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的基序。具體地講，本申請(qǐng)涉及在與或不與抗原組合的情況下被用于誘導(dǎo)，增強(qiáng)或調(diào)節(jié)包括B細(xì)胞(抗體)并且任選包括T細(xì)胞成分的免疫應(yīng)答的非編碼RNA基序。
背景技術(shù)：
大量的病毒感染與在正常狀態(tài)下通常不會(huì)遇到的RNA種類相關(guān)，或者會(huì)導(dǎo)致它們的產(chǎn)生。所述RNAs是基因組片段(在含有雙鏈RNAs的病毒的情況下)，復(fù)制性中間體或莖-環(huán)-結(jié)構(gòu)，它們能由諸如Toll-樣受體3(TLR3)的先天免疫受體識(shí)別，并且誘導(dǎo)IFN-I和其他可溶性介質(zhì)的產(chǎn)生。另外，業(yè)已證實(shí)某些dsRNA基序，如polyI:polyC(pI:pC或pI:C)能激活不成熟的樹(shù)突細(xì)胞達(dá)到能夠發(fā)揮專門(mén)的APC的作用的階段。盡管事實(shí)業(yè)已證實(shí)polyI:polyC和IFN-I能影響對(duì)蛋白抗原的抗體應(yīng)答，所獲得的有關(guān)由先天免疫模型產(chǎn)生的dsRNA-免疫調(diào)節(jié)基序的大部分信息限制的于天然殺傷細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和其他缺乏特異性抗原受體的細(xì)胞亞型。因此，還沒(méi)有證實(shí)與雙鏈或其他RNA種類相關(guān)的基序僅僅對(duì)適應(yīng)性免疫應(yīng)答具有有限的作用，或者起著能防止免疫耐受并且指導(dǎo)特定T細(xì)胞的分化的危險(xiǎn)信號(hào)的作用。另外，關(guān)于是否存在對(duì)免疫應(yīng)答有潛在的分化影響的多種RNA相關(guān)的危險(xiǎn)基序的關(guān)鍵問(wèn)題沒(méi)有得到解答。另外，尚未能確定非編碼RNA基序是否能夠在病毒感染期間促進(jìn)I類-限制的免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)，直到最近還認(rèn)為，在大部分情況下，是在抗原呈遞細(xì)胞(APC)的無(wú)效的或生產(chǎn)性感染之后發(fā)生的。
在病毒感染期間，特定T淋巴細(xì)胞暴露于通過(guò)MHC分子展示的外源表位，并且B淋巴細(xì)胞識(shí)別可溶形式的抗原。確定所述適應(yīng)性免疫應(yīng)答的淋巴細(xì)胞的增殖和分化，所述免疫應(yīng)答由特定的效應(yīng)細(xì)胞和記憶細(xì)胞組成。在所述免疫應(yīng)答的起始階段，先天免疫能識(shí)別與微生物相關(guān)的基序以及病變誘導(dǎo)的內(nèi)源危險(xiǎn)信號(hào)，該信號(hào)能指導(dǎo)特定淋巴細(xì)胞隨后的分化，以及免疫應(yīng)答的總體特征。在缺乏危險(xiǎn)信號(hào)的情況下，所述T和B細(xì)胞應(yīng)答強(qiáng)度減弱，并且導(dǎo)致免疫耐受，特別是在中等至高劑量抗原情況下。業(yè)已提出它是分辨無(wú)害的和與感染相關(guān)的′危險(xiǎn)′抗原的關(guān)鍵機(jī)制。該機(jī)制還顯示了免疫系統(tǒng)分辨自身和非自身抗原的不同策略，以前認(rèn)為只能在抗原-受體所有組成成分水平上確定。
發(fā)明概述適應(yīng)性免疫應(yīng)答是通過(guò)T和B細(xì)胞表位的識(shí)別誘導(dǎo)的，并且通過(guò)經(jīng)先天免疫受體發(fā)揮作用的“危險(xiǎn)”信號(hào)形成。在本申請(qǐng)中業(yè)已證實(shí)了與非編碼雙鏈或單鏈RNA相關(guān)的基序提供了所述免疫應(yīng)答的關(guān)鍵特征，病毒感染的回憶，如，促炎趨化因子表達(dá)的快速誘導(dǎo)，抗原呈遞細(xì)胞(APC)的募集和激活，調(diào)控細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，Th1細(xì)胞的分化，交叉激發(fā)的同種型轉(zhuǎn)換和刺激，存在于MHC I類-限制的免疫應(yīng)答中。本申請(qǐng)證實(shí)了RNA相關(guān)基序的異質(zhì)性導(dǎo)致了對(duì)免疫應(yīng)答特征的不同影響。根據(jù)特定RNA-基序阻斷耐受性誘導(dǎo)和在病毒感染期間有效組織免疫防御的能力，證實(shí)了所述RNA種類是有效的″危險(xiǎn)信號(hào)″。本申請(qǐng)披露了利用選定的RNA基序作為佐劑，以便優(yōu)化對(duì)亞基疫苗的免疫應(yīng)答?？傊诓《靖腥酒陂g產(chǎn)生的RNA-相關(guān)基序不僅對(duì)先天免疫具有短期影響，而且聯(lián)系早期應(yīng)答和晚期適應(yīng)性階段，包括抗原特異性B和T細(xì)胞的激活和分化。
在本申請(qǐng)中，證實(shí)了除了RNA的單鏈與雙鏈性質(zhì)之外，所述寡核苷酸組成是先天免疫受體識(shí)別非編碼RNA基序的關(guān)鍵決定因素。另外，異源RNA基序?qū)m應(yīng)性免疫具有有效的和不同的影響，在病毒感染期間介導(dǎo)免疫應(yīng)答的大部分特征。最后，業(yè)已證實(shí)了所披露的RNA-基序能有效啟動(dòng)防御機(jī)制，在傳染性疾病或癌方面具有預(yù)防性或治療性用途。
本申請(qǐng)要求2002年3月15日提交的美國(guó)申請(qǐng)流水號(hào)60/364,490和2002年9月20日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)流水號(hào)60/412,219的優(yōu)先權(quán)，并且被收作本文參考。
本發(fā)明的各種實(shí)施方案包括1.一種增強(qiáng)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法，包括施用由雙鏈RNA組成的組合物和與所述抗原共同施用所述組合物。
2.一種增強(qiáng)或調(diào)節(jié)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法，當(dāng)所述抗原已經(jīng)存在于體內(nèi)時(shí)，包括施用由雙鏈RNA組成的組合物。
3.如段落1的方法，其中，所述RNA是非編碼RNA。
4.如段落1或2的方法，其中，所述雙鏈RNA由聚腺嘌呤和聚尿嘧啶組成。
5.如段落1或2的方法，其中，所述雙鏈RNA由聚鳥(niǎo)嘌呤和聚胞嘧啶或聚肌苷和聚胞嘧啶之一組成。
6.如段落1或2的方法，其中，所述雙鏈RNA由腺嘌呤和尿嘧啶組成。
7.如段落1或2的方法，其中，所述雙鏈RNA由鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶或肌苷和胞嘧啶組成。
8.如段落1的方法，其中，所述方法能增強(qiáng)Th1和Tc1細(xì)胞應(yīng)答。
9.如段落1的方法，其中，所述方法能誘導(dǎo)Tc1細(xì)胞應(yīng)答。
10.如段落1的方法，其中，所述方法能增強(qiáng)B細(xì)胞應(yīng)答。
11.如段落1的方法，其中，所述抗原是與其他抗原共同施用的。
12.如段落1的方法，其中，所述方法能誘導(dǎo)CXC和CC趨化因子。
13.如段落12的方法，其中，所述方法能誘導(dǎo)MIP-1α，MIP-1β，MIP-3α和IP-10。
14.如段落1的方法，其中，所述組合物的施用能通過(guò)募集和激活CD11b+單核細(xì)胞或CD11c+樹(shù)突細(xì)胞而增強(qiáng)T和B細(xì)胞應(yīng)答。
15.如段落1的方法，其中，雙鏈RNA組合物能通過(guò)恢復(fù)抗原呈遞細(xì)胞而增強(qiáng)免疫應(yīng)答。
16.如段落1的方法，其中，所述抗原呈遞細(xì)胞是專門(mén)的APC。
17.如段落1或2的方法，其中，所述雙鏈RNA組合物由肌苷和胞嘧啶組成，并且能誘導(dǎo)CD11c+樹(shù)突細(xì)胞的有效募集。
18.如段落1或2的方法，其中，所述雙鏈RNA選自含有肌苷和胞嘧啶的RNA組合物和含有腺嘌呤和尿嘧啶的RNA組合物，并且所述方法能誘導(dǎo)CD11b+單核細(xì)胞的有效募集。
19.如段落15的方法，其中，所述APC是激活的。
20.如段落4的方法，其中，所述抗原是非傳染性抗原，而所述RNAMHC I類-限制的T細(xì)胞是通過(guò)聚腺嘌呤和聚尿嘧啶RNA組合物交叉激發(fā)的。
21.如段落4-7的方法，其中，所述RNA組合物是通過(guò)粘膜施用的。
22.一種防止對(duì)非傳染性抗原的高區(qū)耐受的方法，包括一起施用所述非傳染性抗原和含有聚腺嘌呤和聚尿嘧啶或聚肌苷和聚胞嘧啶的雙鏈RNA組合物。
23.如段落22的方法，其中，所述非傳染性抗原是以大劑量施用的或已經(jīng)存在于體內(nèi)。
24.如段落22的方法，其中，所述劑量是耐受量的抗原。
25.如段落22的方法，其中，所述方法能防止B細(xì)胞無(wú)反應(yīng)性。
26.如段落1，2和22的方法，其中，所述組合物和抗原是通過(guò)下列途徑之一施用的粘膜施用；呼吸道施用；靜脈內(nèi)施用；皮下施用；和肌內(nèi)施用，與或不與各種載體復(fù)合。
27.一種免疫方法，包括通過(guò)使用與Ig主鏈連接的抗原的至少一個(gè)肽表位加載抗原呈遞細(xì)胞，以便形成Ig-肽分子，并且體內(nèi)施用與dsRNA基序聯(lián)合的Ig-肽分子，其中，所述表位是通過(guò)MHC I途徑有效加工和呈遞的，導(dǎo)致了MHC I類分子的有效加載，并且在體內(nèi)暴露于抗原之后，導(dǎo)致了MHC I類-限制的T細(xì)胞的有效的二次擴(kuò)增。
28.如段落27的方法，其中，所述抗原是病毒。
29.如段落28的方法，其中，所述病毒是流感病毒。
30.如段落27的方法，其中，所述肽-表位是重組IgG-NP(Kd)。
31.如段落27的方法，其中，所述dsRNA是pA:pU。
32.如段落27的方法，其中，所述T細(xì)胞是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。
33.如段落27的方法，其中，在體內(nèi)暴露于所述抗原之后，導(dǎo)致的MHC I類-限制的T細(xì)胞的二次擴(kuò)增，強(qiáng)于僅施用無(wú)菌鹽水中的重組抗原。
34.一種在臨床診斷之后控制和治療腫瘤的方法，包括通過(guò)使用與Ig主鏈連接的至少一個(gè)腫瘤相關(guān)的T細(xì)胞表位加載抗原呈遞細(xì)胞，以便形成IgG-肽分子，并且體內(nèi)施用與dsRNA聯(lián)合的Ig-肽分子。
35.如段落34的方法，其中，所述腫瘤相關(guān)的T細(xì)胞表位是通過(guò)MHC I途徑有效加工和呈遞的，導(dǎo)致了MHC I類分子的有效加載，并因此產(chǎn)生了MHC I類-肽復(fù)合物。
36.如段落34的方法，其中，所述方法導(dǎo)致了對(duì)所述腫瘤相關(guān)的T細(xì)胞表位的免疫應(yīng)答和腫瘤排斥。
37.如段落34的方法，其中，所述dsRNA是pA:pU。
38.如段落34的方法，其中，所述IgG-肽復(fù)合物和dsRNA是作為抗-腫瘤治療反復(fù)施用的。
39.如段落34和35的方法，其中，在腫瘤排斥時(shí)，產(chǎn)生了針對(duì)腫瘤相關(guān)表位的Tc1免疫。
40.如段落34的方法，其中，在施用IgG-肽和dsRNA時(shí)，產(chǎn)生了針對(duì)腫瘤相關(guān)表位的Tc2免疫。
41.如段落34的方法，其中，所述方法還包括誘導(dǎo)對(duì)相同腫瘤相關(guān)表位的有效的記憶應(yīng)答。
42.如段落34的方法，其中，所述方法導(dǎo)致了對(duì)腫瘤細(xì)胞變體的連續(xù)的免疫。
43.一種增強(qiáng)對(duì)抗原的抗體應(yīng)答的方法，包括給人或非人哺乳動(dòng)物施用與選自下組的dsRNA聯(lián)合的所述抗原pA:pU，pI:pC和pC:pG或它們的混合物。
44.一種增強(qiáng)對(duì)抗原的抗體應(yīng)答的方法，包括給人或非人哺乳動(dòng)物施用與選自下組的單鏈RNA種類的混合物聯(lián)合的所述抗原pA，pC，pI，pU，p(G，U)，p(C，U)，p(A，C)，p(I，U)，p(C，I)，p(A，U)，p(A，G)，p(A，C，G)，p(A，C，U)和p(A，G，U)。
45.一種用于增強(qiáng)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的組合物，包括由聚腺嘌呤和聚尿嘧啶組成的dsRNA序列。
46.如段落45的組合物，其中，所述組合物還包括抗原。
47.如段落45的組合物，其中，所述抗原已經(jīng)存在于體內(nèi)。
48.如段落45的組合物，其中，所述抗原是在可以藥用的載體中施用的。
49.如段落45的組合物，其中，所述抗原是在免疫球蛋白中施用的。
50.如段落48的組合物，其中，所述可以藥用的是IgG。
51.如段落45-47的組合物，其中，所述抗原是腫瘤相關(guān)表位。
52.如段落45-47的組合物，其中，所述抗原是病毒。
53.如段落51的組合物，其中，所述抗原是腫瘤相關(guān)的T細(xì)胞表位。
54.如段落45-53的組合物，其中，所述dsRNA是與所述抗原一起施用的。
55.如段落45-53的組合物，其中，所述dsRNA是與所述抗原分開(kāi)施用的。
56.一種用于增強(qiáng)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的組合物，包括由聚肌苷和聚胞嘧啶組成的dsRNA序列。
57.如段落56的組合物，其中，所述組合物還包括所述抗原。
58.如段落56的組合物，其中，所述抗原已經(jīng)存在于體內(nèi)。
59.如段落56的組合物，其中，所述抗原是在可以藥用的載體中施用的。
60.如段落56的組合物，其中，所述抗原是在免疫球蛋白中施用的。
61.如段落59的組合物，其中，所述可以藥用的載體是IgG。
62.如段落56-58的組合物，其中，所述抗原是腫瘤相關(guān)表位。
63.如段落56-58的組合物，其中，所述抗原是病毒。
64.如段落62的組合物，其中，所述抗原是腫瘤相關(guān)的T細(xì)胞表位。
65.如段落56-64的組合物，其中，所述dsRNA是與所述抗原一起施用的。
66.如段落56-64的組合物，其中，所述dsRNA是與所述抗原分開(kāi)施用的。
67.雙鏈(″dsRNA″)在生產(chǎn)用來(lái)增強(qiáng)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的藥物中的用途，包括給患者施用與所述抗原聯(lián)合的所述dsRNA。
68.雙鏈(″dsRNA″)在生產(chǎn)用來(lái)增強(qiáng)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的藥物中的用途，包括當(dāng)所述抗原已經(jīng)存在于患者體內(nèi)時(shí)，給所述患者施用所述dsRNA。
69.如段落67或68的用途，其中，所述dsRNA是非編碼RNA。
70.如段落67或68的用途，其中，所述雙鏈RNA由聚腺嘌呤和聚尿嘧啶組成。
71.如段落67或68的用途，其中，所述雙鏈RNA由聚肌苷和聚胞嘧啶或聚鳥(niǎo)嘌呤和聚胞嘧啶組成。
72.如段落67或68的用途，其中，所述雙鏈RNA由腺嘌呤和尿嘧啶組成。
73.如段落67或68的用途，其中，所述雙鏈RNA由鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶或肌苷和胞嘧啶組成。
74.如段落67-73的用途，其中，所述用途能增強(qiáng)Th1和/或Tc1細(xì)胞應(yīng)答。
75.如段落67-73的用途，其中，所述用途能誘導(dǎo)對(duì)抗原的Tc1細(xì)胞應(yīng)答。
76.如段落67-73的用途，其中，所述方法能增強(qiáng)對(duì)抗原的B細(xì)胞應(yīng)答。
77.如段落67或68的用途，其中，所述抗原是與其他抗原共同施用的。
78.如段落67或68的用途，其中，所述方法能誘導(dǎo)CXC和CC趨化因子。
79.如段落67或68的用途，其中，所述方法能誘導(dǎo)MIP-1α，MIP-1β，MIP-3α和IP-10。
80.如段落67-71的用途，其中，所述dsRNA的施用能通過(guò)募集和激活CD11b+單核細(xì)胞或CD11c+樹(shù)突細(xì)胞而增強(qiáng)T和B細(xì)胞應(yīng)答。
81.如段落67-71的用途，其中，雙鏈RNA組合物能通過(guò)募集抗原呈遞細(xì)胞而增強(qiáng)免疫應(yīng)答。
82.如段落81的用途，其中，所述抗原呈遞細(xì)胞是專門(mén)的APC。
83.如段落71的用途，其中，所述雙鏈RNA組合物包括肌苷和胞嘧啶，并且能誘導(dǎo)CD11c+樹(shù)突細(xì)胞的有效募集。
84.如段落67或68的用途，其中，所述雙鏈選自含有肌苷和胞嘧啶的RNA組合物和含有腺嘌呤和尿嘧啶的RNA組合物，并且，所述方法能誘導(dǎo)CD11b+單核細(xì)胞的有效募集。
85.如段落67-70的用途，其中，所述抗原是非傳染性抗原，并且所述RNA MHC I類-限制的T細(xì)胞是通過(guò)聚腺嘌呤和聚尿嘧啶RNA組合物交叉激發(fā)的。
86.如段落67-70的用途，其中，所述組合物和抗原是通過(guò)下列途徑之一施用的粘膜施用；呼吸道施用；靜脈內(nèi)施用；皮下施用；和肌內(nèi)施用，與或不與各種載體復(fù)合。
87.dsRNA在生產(chǎn)用來(lái)防止對(duì)非傳染性抗原的高區(qū)耐受的藥物中的用途，包括一起施用所述非傳染性抗原和含有聚腺嘌呤和聚尿嘧啶或聚肌苷和聚胞嘧啶的雙鏈RNA組合物。
88.如段落87的用途，其中，所述非傳染性抗原是大劑量施用的或已經(jīng)存在于體內(nèi)。
89.如段落87的用途，其中，所述劑量是耐受量的抗原。
90.如段落87的用途，其中，所述方法能防止B細(xì)胞無(wú)反應(yīng)性。
91.dsRNA在生產(chǎn)藥物中的用途，包括通過(guò)使用與Ig主鏈連接的抗原的至少一個(gè)肽表位加載抗原呈遞細(xì)胞，以便形成Ig-肽分子，并且體內(nèi)施用與dsRNA基序聯(lián)合的Ig-肽分子，其中，所述表位是通過(guò)MHC I途徑有效加工和呈遞的，導(dǎo)致了MHC I類分子的有效加載，并且在體內(nèi)暴露于抗原之后，導(dǎo)致了MHC I類-限制的T細(xì)胞的有效的二次擴(kuò)增。
92.如段落91的用途，其中，所述抗原是病毒。
93.如段落91的用途，其中，所述病毒是流感病毒。
94.如段落91的用途，其中，所述肽-表位是重組IgG-NP(Kd)。
95.如段落91的用途，其中，所述dsRNA是pA:pU。
96.如段落91的用途，其中，所述T細(xì)胞是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。
97.dsRNA在生產(chǎn)用于在臨床診斷之后控制和治療腫瘤的藥物中的用途，包括通過(guò)使用與Ig主鏈連接的至少一個(gè)腫瘤相關(guān)的T細(xì)胞表位加載抗原呈遞細(xì)胞，以便形成IgG-肽分子，并且體內(nèi)施用與dsRNA聯(lián)合的Ig-肽分子。
98.如段落97的用途，其中，所述腫瘤相關(guān)的T細(xì)胞表位是通過(guò)MHC I途徑有效加工和呈遞的，導(dǎo)致了MHC I類分子的有效加載，并因此產(chǎn)生了MHC I類-肽復(fù)合物。
99.如段落97的用途，其中，所述方法導(dǎo)致了對(duì)所述腫瘤相關(guān)的T細(xì)胞表位的免疫應(yīng)答和腫瘤排斥。
100.如段落97的用途，其中，所述dsRNA是pA:pU.
101.如段落97的用途，其中，所述Ig-G肽復(fù)合物和dsRNA是作為抗-腫瘤治療反復(fù)施用的。
102.如段落97的用途，其中，在腫瘤排斥時(shí)，產(chǎn)生了針對(duì)腫瘤相關(guān)表位的Tc1免疫。
103.如段落97的用途，其中，在施用IgG-肽和dsRNA時(shí)，產(chǎn)生了針對(duì)腫瘤相關(guān)表位的Tc2免疫。
104.如段落97的用途，其中，所述方法還包括誘導(dǎo)對(duì)相同腫瘤相關(guān)表位的有效的記憶應(yīng)答。
105.如段落97的用途，其中，所述方法導(dǎo)致了對(duì)腫瘤細(xì)胞變體的連續(xù)的免疫。
106.dsRNA在生產(chǎn)用來(lái)增強(qiáng)對(duì)抗原的抗體應(yīng)答的藥物中的用途，包括給人或非人哺乳動(dòng)物施用與選自下組的dsRNA聯(lián)合的所述抗原pA:pU，pI:pC和pC:pG。
107.dsRNA在生產(chǎn)用來(lái)增強(qiáng)對(duì)抗原的抗體應(yīng)答的藥物中的用途，包括給人或非人哺乳動(dòng)物施用與選自下組的單鏈RNA種類的混合物聯(lián)合的所述抗原pA，pC，pI，pU，p(G，U)，p(C，U)，p(A，C)，p(I，U)，p(C，I)，p(A，U)，p(A，G)，p(A，C，G)，p(A，C，U)和p(A，G，U)。
108.dsRNA在生產(chǎn)用于增強(qiáng)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的藥物中的用途，包括由聚腺嘌呤和聚尿嘧啶組成的dsRNA序列。
109.如段落108的用途，其中，所述組合物還包括抗原。
110.如段落108的用途，其中，所述抗原已經(jīng)存在于體內(nèi)。
111.如段落108的用途，其中，所述抗原是在可以藥用的載體中施用的。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1表示各種合成RNA基序?qū)μ禺愋钥贵w和T細(xì)胞免疫的影響；圖2表示通過(guò)特定dsRNA基序?qū)Σ《究乖拿庖邞?yīng)答的增強(qiáng)；圖3表示確定的dsRNA基序?qū)ο忍烀庖吆涂乖蔬f細(xì)胞的影響；圖4表示特定dsRNA基序的“危險(xiǎn)信號(hào)”質(zhì)量；圖5表示將選定的dsRNA基序用作有效的疫苗佐劑；圖6是表示dsRNA基序?qū)γ庖邞?yīng)答的影響的流程圖。
圖7表示在流感病毒感染期間產(chǎn)生的天然，非傳染性雙鏈RNA對(duì)于針對(duì)蛋白抗原的特異性免疫應(yīng)答具有顯著作用；圖8A表示合成RNA基序的各種文庫(kù)；
圖8B表示不同的合成RNAs對(duì)針對(duì)原型蛋白抗原的B和T細(xì)胞應(yīng)答具有增強(qiáng)作用；圖9表示選定的RNA基序?qū)λ鱿忍烀庖邞?yīng)答的影響；圖10與抗原呈遞細(xì)胞上的不同受體結(jié)合的獨(dú)特的RNA基序；圖11表示獨(dú)特的RNA基序能誘導(dǎo)趨化因子的不同的上調(diào)；圖12表示可以通過(guò)使用選定的合成RNA基序控制流感病毒的復(fù)制；圖13表示選定的合成RNA基序pI:pC和pA:pU明顯防止高區(qū)耐受，所述高區(qū)耐受通常與施用大量的純化蛋白相關(guān)；圖14表示選定的合成RNA基序?qū)θ藛魏思?xì)胞的影響；圖15A-15B表示未標(biāo)記過(guò)的pA:pU，而不是未標(biāo)記過(guò)的pI:pC，能夠競(jìng)爭(zhēng)標(biāo)記過(guò)的pA:pU與人THP-1單核細(xì)胞的結(jié)合；圖16表示dsRNA的純化和分級(jí)分離步驟；圖17表示選定的合成RNA化合物的較小分子量的級(jí)份具有較高的生物學(xué)活性；圖18表示是pI:pC而不是pA:pU能誘導(dǎo)針對(duì)它自身的抗體應(yīng)答，具有針對(duì)另外一種RNA基序的交叉反應(yīng)成分；圖19表示在IgG介導(dǎo)的MHC I類-限制的表位送遞之后，共同使用選定的合成RNAs促進(jìn)IL-2和IFN-γ的有效誘導(dǎo)；圖20表示與使用所述肽本身相比，通過(guò)重組IgG的離體APC加載，在形成MHC I類-肽復(fù)合物和產(chǎn)生Tc應(yīng)答方面更有效；圖21表示在共同施用選定的合成RNA時(shí)，由IgG介導(dǎo)的I類限制的表位的送遞在激發(fā)I類限制的Tc1應(yīng)答方面最有效；圖22表示抗-病毒細(xì)胞毒性T細(xì)胞的有效激發(fā)同時(shí)需要用通過(guò)IgG送遞的I類限制的表位體內(nèi)加載APC，和通過(guò)選定的合成RNA基序進(jìn)行合適的指導(dǎo)；圖23表示具有病毒I類限制的表位的重組IgG和選定的合成dsRNA一起進(jìn)行免疫，導(dǎo)致了能夠限制在感染侵襲之后的病毒復(fù)制的免疫應(yīng)答的激發(fā)；圖24表示用于測(cè)試基于Ig-肽的分子的效力的腫瘤模型；圖25表示用腫瘤相關(guān)的抗原對(duì)APC進(jìn)行有效的體內(nèi)加載，同時(shí)通過(guò)選定的合成RNA基序激活，足以有效控制腫瘤生長(zhǎng)和誘導(dǎo)腫瘤排斥，并且是實(shí)現(xiàn)這一目的所必須的；圖26表示用腫瘤相關(guān)的抗原對(duì)APC進(jìn)行有效的體內(nèi)加載，同時(shí)通過(guò)選定的合成RNA基序激活，能夠啟動(dòng)針對(duì)腫瘤相關(guān)抗原的有效免疫應(yīng)答；圖27表示在用具有腫瘤相關(guān)表位的重組免疫球蛋白，和選定的合成dsRNA基序一起治療時(shí)，具有T細(xì)胞受體標(biāo)記TCRβ的腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞獲得了激活標(biāo)記CD25的表達(dá)；圖28表示成功地排斥腫瘤的治療過(guò)的小鼠產(chǎn)生了針對(duì)治療性Ig上的腫瘤相關(guān)的表位的Tc1應(yīng)答，以及Tc2免疫；圖29表示通過(guò)所標(biāo)明的治療誘導(dǎo)的成功的腫瘤排斥，隨后能夠有效防止相同腫瘤的后續(xù)侵襲，表明了有效免疫記憶的形成；圖30A-30B表示在能導(dǎo)致腫瘤排斥的所標(biāo)明的治療之后出現(xiàn)的免疫，能防止抗原變體的侵襲，并且與細(xì)胞因子生產(chǎn)細(xì)胞的總體擴(kuò)增相關(guān)；圖31A表示(a)天然IgG(輕鏈-重鏈異二聚體)的示意圖；(B)插入CDR(互補(bǔ)決定區(qū))3，2，1或構(gòu)架區(qū)的抗原(Ag)衍生肽；(C)用抗原或片段取代的VH片段；和(D)用抗原或抗原片段取代的VH和CH1片段；圖31B圖示了IgG-肽和Fc肽；圖31C表示選定的人IgG主鏈的特性；和圖31D表示所述重鏈恒定區(qū)的序列，以及預(yù)期的構(gòu)建體的示意圖。
本發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明隨著對(duì)先天免疫的可能作用的理解的發(fā)展，在微生物感染期間免疫應(yīng)答的機(jī)制，成了研究的主要領(lǐng)域。很快就了解到，所述先天免疫細(xì)胞具有多種類型的能區(qū)別各種微生物相關(guān)的基序或″外源″危險(xiǎn)信號(hào)的受體。在所述形式的識(shí)別事件之后，先天和適應(yīng)性免疫之間的聯(lián)系，決定性地影響到T和B細(xì)胞應(yīng)答的強(qiáng)度和特征。所述先天免疫迅速，但是辨別力較低，不過(guò)能指導(dǎo)發(fā)展較慢的適應(yīng)性免疫，并且包括更有效的效應(yīng)物，通過(guò)體細(xì)胞突變獲得了大量組成成分。共同采用先天和適應(yīng)性免疫的這種多模式的識(shí)別策略，將免疫辨別方式從自主/非自主轉(zhuǎn)變成危險(xiǎn)的/非危險(xiǎn)的識(shí)別。純化蛋白的較差的免疫原性，通過(guò)微生物基序進(jìn)行的免疫介質(zhì)的誘導(dǎo)，和所述介質(zhì)(細(xì)胞因子，趨化因子和共刺激分子)對(duì)適應(yīng)性免疫的活性的表征都支持這種觀點(diǎn)。
正如在本申請(qǐng)中所披露的，采用了合理的方法來(lái)說(shuō)明非編碼RNA基序作為信號(hào)的作用，具有用于理解它們?cè)诓《靖腥酒陂g控制適應(yīng)性免疫的作用的直接含義。另外，探究了它們作為佐劑用于免疫接種的用途。
采用了合成RNAs文庫(kù)和雙重策略，采用對(duì)適應(yīng)性免疫，而不是先天免疫的影響作為結(jié)果。通過(guò)這種方法，驚奇地發(fā)現(xiàn)了除了RNA的雙鏈性質(zhì)之外，寡核苷酸組成在這方面起著作用。業(yè)已證實(shí)基于A∶U的基序具有啟動(dòng)Th1免疫，同種型轉(zhuǎn)變成IgG2a(圖1A-1C)和交叉激發(fā)(圖3A-3E)至比基于I∶C的基序更高程度的能力。前面所限定的I∶C基序，導(dǎo)致了增強(qiáng)的T2和B細(xì)胞免疫(圖1A-1C)。與dsRNA相關(guān)的C∶G-基序，或混雜的ssRNA基序，對(duì)適應(yīng)性免疫具有較弱的影響，除非使用由互補(bǔ)的堿基組成的ssRNAs的混合物。由于所述發(fā)現(xiàn)在缺乏功能性TLR4的條件下得到了再現(xiàn)，在這里可以排除與內(nèi)毒素識(shí)別所共有的途徑。
最近，業(yè)已證實(shí)了TLR3在pI:pC識(shí)別方面起作用，不過(guò)，與pA:pU的共同識(shí)別途徑似乎不是因?yàn)橥ㄟ^(guò)這兩種基序誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的顯著不同的特征造成的(圖1A-1C)。更有可能的是，在原始的免疫組成成分的記憶過(guò)程中，不同的TLR同種型和/或共同受體參與了根據(jù)核苷酸的性質(zhì)辨別RNA基序的過(guò)程。一種可能性是，被證實(shí)能識(shí)別回文未甲基化的CpG寡脫氧核苷酸基序的TLR9或TLR的同種型，可能參與了dsRNA-基序辨別。但是，最新的證據(jù)沒(méi)有證實(shí)TLR9的參與，因?yàn)榕c未甲基化的CpG基序相比，dsRNA誘導(dǎo)了不同范圍的轉(zhuǎn)錄因子和共刺激分子。由于pI:pC和pA:pU都能誘導(dǎo)CXC趨化因子(圖3A)，諸如CC的趨化因子的具有選擇性地結(jié)合Th2細(xì)胞的能力的其他介質(zhì)，有可能負(fù)責(zé)通過(guò)所述基序誘導(dǎo)的不同的Th特征。
根據(jù)以上資料，可以得出這樣的結(jié)論所述新鑒定的pA:pU-相關(guān)基序能夠誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的大量特征，這些特征通常僅在病毒感染之后出現(xiàn)。T1應(yīng)答(包括Th1和Tc1)的誘導(dǎo)用蛋白抗原(OVA和gp140)和滅活的流感病毒(圖1-3)得到了記錄。對(duì)蛋白抗原的I類MHC-限制的應(yīng)答的誘導(dǎo)(圖3D，E)，表明該RNA基序足以將APC激活到與該加工和呈遞機(jī)制相的水平，增加了支持交叉激發(fā)作為病毒感染的主要機(jī)制的新的信息。這表明，可能是RNA-相關(guān)的危險(xiǎn)基序，而不是APC的直接感染在諸如流感病毒的RNA病毒感染期間，決定細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的誘導(dǎo)。所述免疫應(yīng)答的增強(qiáng)了的強(qiáng)度，可以解釋為APC的迅速募集和激活(圖3A-3E)。通過(guò)pA:pU促進(jìn)的T1免疫性的誘導(dǎo)，伴隨著同種型轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致了IgG2a抗體的產(chǎn)生(圖1B)。不過(guò)，dsRNA不能誘導(dǎo)向IgA類的同種型轉(zhuǎn)變。這和TGF-β的抑制相關(guān)(未示出)，表明dsRNA危險(xiǎn)基序是通過(guò)促炎介質(zhì)的誘導(dǎo)和抗炎介質(zhì)的下調(diào)起作用的。以上結(jié)果與大量的，但不是排他性的，在諸如流感病毒感染期間dsRNA基序在形成適應(yīng)性免疫方面的作用吻合。
由于有效的危險(xiǎn)基序會(huì)影響免疫應(yīng)答性與耐受性方面的結(jié)果，研究了dsRNAs是否能抑制對(duì)人IgG的高區(qū)耐受，它是一種業(yè)已充分表征的免疫無(wú)反應(yīng)性模型。業(yè)已證實(shí)了pA:pU和pI:pC都是免疫耐受的有效抑制劑(圖4A-4B)，而不僅是適應(yīng)性應(yīng)答的調(diào)節(jié)劑。這一發(fā)現(xiàn)豐富了dsRNAs所擁有的特征的范圍，并且揭示了危險(xiǎn)基序的佐劑作用的可能，一般至少部分是由防止免疫無(wú)反應(yīng)性抑制所導(dǎo)致的可能性。最后，由于A和U，而不是I(肌苷)堿基，出現(xiàn)在天然RNA種類中，所述結(jié)果表明，在病毒感染期間dsRNA基序與免疫應(yīng)答具有潛在的相關(guān)性。
pA:pU作為危險(xiǎn)基序的效力，是通過(guò)它的控制流感病毒的原發(fā)性感染的能力說(shuō)明的(圖4A-4B)。這一特征可以通過(guò)先天和適應(yīng)性應(yīng)答的迅速動(dòng)員，在原發(fā)性感染期間未甲基化的CpG寡DNA基序能改善免疫防御方面的能力是高度記憶的來(lái)解釋。通過(guò)外推可以得出這樣的結(jié)論先天免疫具有識(shí)別外源或內(nèi)源產(chǎn)生的與感染相關(guān)的多核苷酸基序，并且相應(yīng)地調(diào)控所述適應(yīng)性免疫的卓越能力。因此，當(dāng)系統(tǒng)中存在抗原時(shí)，再次暴露于dsRNA可能只會(huì)更有效動(dòng)員所述免疫應(yīng)答，直接提示抗原的清除。
根據(jù)本文所提供的結(jié)果，dsRNA基序是與亞基，重組或滅活的疫苗組合的佐劑的合理的候選物。具體地講，在缺少載體復(fù)制的情況下，pA:pU似乎有可能提供活疫苗的某些優(yōu)點(diǎn)。本申請(qǐng)描述了用于粘膜和系統(tǒng)接種的免疫復(fù)合物，它允許進(jìn)行抗原和dsRNA的共同配制。如圖5A-5D所示，用所述復(fù)合物進(jìn)行的肺接種和癌癥免疫治療，導(dǎo)致了由抗體，T輔助細(xì)胞和MHCI類-限制的T細(xì)胞組成的強(qiáng)免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)。
總之，通過(guò)使用選擇能影響適應(yīng)性免疫應(yīng)答的RNA基序的合理方法，確定了出乎意料的異質(zhì)性和新的RNA相關(guān)的危險(xiǎn)基序。對(duì)所述適應(yīng)性免疫應(yīng)答的系統(tǒng)性研究表明，選定的RNA基序能夠協(xié)調(diào)多種特征，這些特征是天然感染的記憶。最后，本申請(qǐng)確定了含有所述RNA基序的新的制劑，它具有用于粘膜或系統(tǒng)免疫的潛在用途，以及通過(guò)消除免疫無(wú)反應(yīng)性或耐受性進(jìn)行免疫治療的潛力。
A)材料和方法1)抗原和免疫調(diào)節(jié)劑將購(gòu)自Sigma的一組18種單鏈和雙鏈合成RNAs(參見(jiàn)表1)溶解在無(wú)菌PBS中。所述RNAs作為合并物使用或單獨(dú)使用。卵白蛋白(OVA，低內(nèi)毒素)購(gòu)自Sigma(A7641)?；魜y毒素B亞基(CTB)購(gòu)自Calbiochem(目錄號(hào)227039)，完全弗氏佐劑(CFA)購(gòu)自DIFCO(目錄號(hào)263810)，人IgG(hIgG)購(gòu)自Sigma(目錄號(hào)I4506)。保留了構(gòu)象表位并且具有三聚化能力的重組gp140HIV抗原，是通過(guò)導(dǎo)入終止突變由菌株IIIB的gp160包膜蛋白衍生的。抗原是用Bernard Moss博士(N.I.H.)饋贈(zèng)的痘苗病毒載體，在BS-C-1(ATCC)細(xì)胞中表達(dá)的，并且通過(guò)扁豆凝集素瓊脂糖凝膠層析(Pharmacia，Piscataway，NJ)純化。使用購(gòu)自Fitzgerald(目錄號(hào)20-HG81)的HIV包膜特異性抗體通過(guò)Western印跡分析證實(shí)gp140抗原的身份。流感病毒(菌株A/WSN/32H1N1)在MDBK細(xì)胞上生長(zhǎng)，并且通過(guò)蔗糖梯度離心從上清液中純化。為了滅活病毒，在攪拌狀態(tài)下，讓所述毒粒暴露于短波紫外線15分鐘。通過(guò)在允許的MDCK細(xì)胞上進(jìn)行病毒滴定證實(shí)所述滅活作用。獲得了在可變區(qū)內(nèi)具有I-Ed-限制的血凝素-衍生肽SFERFEIFPKE(IgHA)[Seq.I.D.No.1]的重組小鼠IgG2b，并且按照前面的方法進(jìn)行純化。
表1
*p＝″聚″2)動(dòng)物C57BL/6，BALB/c和TLR4-/-C3H/HeJ雌性小鼠，6-8周齡，購(gòu)自Jackson Laboratories(Bar Harbor，MA)，并且在AlliancePharmaceutical Corp，在特定病原體條件下圈養(yǎng)。在C57BL/6和BALB/c小鼠中的重要發(fā)現(xiàn)，在對(duì)內(nèi)毒素有缺陷型反應(yīng)的C3H/HeJ小鼠中得到了再現(xiàn)。雌性Sprague Dawley大鼠(250-330克)購(gòu)自Taconic農(nóng)場(chǎng)，并且在類似條件下圈養(yǎng)。
3)免疫接種，侵襲和病毒滴度測(cè)定如上文所述，分別通過(guò)氣管內(nèi)滴注或氣霧化對(duì)小鼠和大鼠進(jìn)行激發(fā)，而對(duì)于小鼠來(lái)說(shuō)，以2周為間隔進(jìn)行2次鼻內(nèi)加強(qiáng)免疫。為了誘導(dǎo)高區(qū)耐受，通過(guò)靜脈注射對(duì)小鼠進(jìn)行激發(fā)。最后，為了誘導(dǎo)強(qiáng)免疫應(yīng)答，用在CFA中乳化的抗原對(duì)小鼠進(jìn)行皮下免疫。用于激發(fā)、加強(qiáng)或誘導(dǎo)耐受性的抗原用量為OVA-100μg；HIV gp140-10μg；hIgG-200μg；以及蔗糖純化的UV-WSN-20μg。所使用的合成RNA的量為40-50μg/劑，有或沒(méi)有抗原，摻入或不摻入在短鏈脂類(SCL)復(fù)合物中。CTB的量/劑為10μg。所述抗原或者在鹽水中送遞，或者在配制時(shí)在全氟化碳(perflubron[純?nèi)粱寤颹，Liquivent，Alliance Pharmaceutical Corp.)中送遞，它是與SCL基質(zhì)相容的惰性載體(滴注或氣霧化的總體積為40-45μl)。
為了進(jìn)行病毒侵襲，通過(guò)鼻途徑，用亞致死劑量(104組織培養(yǎng)物感染劑量50％-CD50)的活的WSN病毒感染用Metofane麻醉的C57BL/6和TLR4-/-C3H/HeJ小鼠。在感染之后第五天，處死所述小鼠，取出肺，勻漿并且在-70℃下保存。通過(guò)將系列稀釋的樣品與允許性MDCK細(xì)胞一起溫育48小時(shí)，然后用雞紅細(xì)胞(購(gòu)自Animal Technologies)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)血細(xì)胞凝集，測(cè)定病毒滴度。終點(diǎn)滴度是用內(nèi)推法通過(guò)三次測(cè)定估算的，并且表示為T(mén)CID50/器官。
4)免疫復(fù)合物獲得用磷脂作為主要賦形劑的短鏈脂類(SCL)復(fù)合物(或″免疫復(fù)合物″)的技術(shù)方法是噴霧干燥。在這里采用了該方法的一種更簡(jiǎn)單的形式。簡(jiǎn)單地講，在水中對(duì)磷脂進(jìn)行勻漿(以便形成脂質(zhì)體或微團(tuán))并且與所述賦形劑和活性成分混合，然后進(jìn)行噴霧干燥，更具體地講在即將進(jìn)行噴霧干燥之前，通過(guò)混合兩種制劑A和B，制備含水制劑。制劑A包括微團(tuán)制劑，其中，0.14g二辛酰磷脂酰膽堿(AvantiPolar Lipids)溶解在23mL熱DI水中。將0.0357g CaCl2·2H2O和0.714g乳糖溶解在所述磷脂微團(tuán)制劑中。制劑B包括20mg卵白蛋白(Sigma)和4mg的pA:pU(無(wú)內(nèi)毒素)，它們?nèi)芙庠?mL的PBS中。用標(biāo)準(zhǔn)的B-191小型噴霧干燥器，在以下條件下對(duì)組合的輸入制劑(2mL制劑A和制劑B)進(jìn)行噴霧干燥入口溫度＝70℃，出口溫度＝43℃，抽吸器＝90％，泵＝2.2mL/分鐘，氮?dú)饬鳎?400L/h。所得到的復(fù)合物的PL∶OVA∶pApU∶CaCl2·2H2O∶乳糖重量比為12∶20∶4∶3∶61。
5)測(cè)定抗體和T細(xì)胞應(yīng)答通過(guò)ELISA測(cè)定抗體應(yīng)答。簡(jiǎn)單地講，用抗原(分別是2μg/ml的gp140，8μg/ml的蔗糖純化的病毒，10μg/ml的hIgG或OVA)對(duì)孔進(jìn)行包被，并且用SeaBlock(Pierce，Rockford，IL，目錄號(hào)37527)封閉。在室溫下，將血清和支氣管肺泡灌洗液的系列稀釋液溫育至少2小時(shí)。在洗滌之后，用堿性磷酸酶(Sigma，目錄號(hào)A7434)偶聯(lián)的抗-小鼠IgG抗體對(duì)分析進(jìn)行顯影，然后添加底物(pNPP，Sigma，目錄號(hào)N2765)，并且通過(guò)使用裝有SoftMax軟件的自動(dòng)化ELISA讀數(shù)儀(Molecular Devices，ThermoMax)進(jìn)行測(cè)定。
為了測(cè)定細(xì)胞應(yīng)答，通過(guò)讓器官通過(guò)70μm的尼龍F(tuán)alcon濾網(wǎng)(Becton Dickinson，目錄號(hào)352350)，然后，用紅細(xì)胞裂解緩沖液(Sigma，目錄號(hào)R7757)裂解紅細(xì)胞，獲得了脾細(xì)胞懸浮液。通過(guò)用膠原酶(Sigma，目錄號(hào)C9891)消化肺組織，然后通過(guò)Ficoll-Paque(Amersham Pharmacia，目錄號(hào)17-1440-02)梯度離心，從肺相關(guān)的淋巴組織中分離淋巴細(xì)胞。通過(guò)ELISPOT分析測(cè)定T細(xì)胞應(yīng)答用4μg/ml的大鼠抗-小鼠抗-IFNγ，IL-2或IL-4單克隆抗體(分別為BD-PharMingen，目錄號(hào)554430，目錄號(hào)18161D，目錄號(hào)554387)對(duì)96-孔45微米混合的纖維素酯平板(Millipore，目錄號(hào)MAHA S4510)進(jìn)行包被。在37℃下，在無(wú)菌鹽水中用10％FCS封閉1小時(shí)之后，以5×105細(xì)胞/孔添加脾細(xì)胞懸浮液，其中有或沒(méi)有抗原或肽。對(duì)于肺淋巴細(xì)胞而言，在刺激之前以1∶1的比例將效應(yīng)細(xì)胞與絲裂霉素-處理過(guò)的脾刺激細(xì)胞混合。為了進(jìn)行刺激，使用梯度量的抗原(OVA，gp140，hIgG或蔗糖純化的WSN病毒)或肽II類-限制的HA SFERFEIFPKE[Seq.I.D.No.1]；或I類-限制的SIINFEKL[Seq.I.D.No.2]和以前所披露的HIV V3-衍生的R10K肽。在刺激72小時(shí)之后，用生物素化的大鼠抗-小鼠細(xì)胞因子抗體(BD-PharMingen)進(jìn)行測(cè)定，然后用鏈霉抗生物素-HRP(BioSource Int.，Camarillo，CA)和不可溶的AEC底物對(duì)測(cè)定進(jìn)行顯影。利用裝有多參數(shù)分析軟件(Image Pro，MediaCybernetics)的自動(dòng)化成像系統(tǒng)(Navitar/Micromate)測(cè)定所述結(jié)果。
6)趨化因子基因表達(dá)的測(cè)定通過(guò)以下DNA陣列技術(shù)，測(cè)定以前用合成RNA或?qū)φ仗幚?天的小鼠肺中趨化因子的表達(dá)水平用RNeasy試劑盒(Qiagen，Valencia，CA)從肺中分離總RNA。通過(guò)用無(wú)RNase的DNase I(Stratagene，SanDiego，CA)處理，進(jìn)一步純化RNAs。通過(guò)使用購(gòu)自SuperArray Inc.(Bethesda，MD)的Nonrad-GEArray試劑盒進(jìn)行DNA陣列。簡(jiǎn)單地講，利用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶，使用含有生物素-16-dUTP的dNTP混合物合成cDNA探針。在68℃下讓所述GEArray膜預(yù)雜交1-2小時(shí)。雜交是通過(guò)將所述膜與生物素-標(biāo)記過(guò)的cDNA一起溫育進(jìn)行的。雜交過(guò)的膜在2xSSC-1％SDS中洗滌2次，并且在0.1xSSC-0.5％SDS中洗滌2次。進(jìn)一步用堿性磷酸酶-偶聯(lián)的鏈霉抗生物素(BioSource Int.，Camarillo，CA)溫育所述膜，并最終用CDP-Star化學(xué)發(fā)光底物顯影。用裝有Gel-Pro軟件(Media Cybernetics，Silver Springs，MD)的Image-Pro分析系統(tǒng)測(cè)定信號(hào)強(qiáng)度。
7)流式細(xì)胞術(shù)通過(guò)按上述方法進(jìn)行膠原酶消化和Ficoll梯度離心，制備事先用合成RNA或鹽水處理1天的小鼠的肺細(xì)胞懸浮液。將所述細(xì)胞重新懸浮在含有1％(v∶v)小鼠血清(Sigma.目錄號(hào)M5905)和1％(w∶v)牛血清白蛋白，級(jí)份V(Sigma，目錄號(hào)A3059)的磷酸緩沖的鹽水中，并且用PE-標(biāo)記過(guò)的大鼠抗-小鼠CD11b(PharMingen，目錄號(hào)01715A)，PE-標(biāo)記過(guò)的倉(cāng)鼠抗-小鼠CD11c(PharMingen，目錄號(hào)09705A)或合適的PE-標(biāo)記過(guò)的同種型對(duì)照(PharMingen，目錄號(hào)11125A或11185A)，以1μg抗體/106細(xì)胞的濃度，在冰上染色40分鐘。用Becton Dickinson FacsCalibur儀器進(jìn)行所述分析。用碘化丙錠排除未存活的細(xì)胞。
8)磁力分離和過(guò)繼轉(zhuǎn)移通過(guò)利用與大鼠抗-小鼠抗-CD11c抗體(Miltenyi Biotech)偶聯(lián)的磁珠，從BALB/c小鼠的脾中分離諸如CD11c+樹(shù)突細(xì)胞的專門(mén)的APC。簡(jiǎn)單地講，以107細(xì)胞/ml的密度將單細(xì)胞懸浮液重新懸浮在MACS緩沖液(BSA和EDTA)中，在冰上與磁珠一起溫育15′，洗滌并且通過(guò)磁柱。在洗脫之前，洗滌所述柱三次，隨后連續(xù)進(jìn)行2次洗滌，并且，在有或沒(méi)有50μg/ml RNA基序，或5ng/ml rIL-12(BiosourceInt.，Camarillo，CA)的條件下，用100μg/ml的IgHA體外脈沖過(guò)夜。另外，在事先用大鼠抗-小鼠CD40單克隆抗體(BD-PharMingen)包被的孔上，將所述細(xì)胞與IgHA一起溫育過(guò)夜。洗滌所述細(xì)胞，重新懸浮在平衡的無(wú)菌鹽水中，并且通過(guò)皮下注射過(guò)繼轉(zhuǎn)移到未接觸過(guò)抗原的BALB/c小鼠(2.5×105APC/小鼠)體內(nèi)。在第14天，通過(guò)IL-2ELISPOT分析測(cè)定所述T細(xì)胞應(yīng)答，然后按照上述方法用II類HA-限制的肽刺激。
9)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析利用t-試驗(yàn)比較免疫應(yīng)答的強(qiáng)度，假定所述值的正態(tài)分布和相等的方差。
B.結(jié)果1)調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的RNA基序的系統(tǒng)定義在病毒感染期間，產(chǎn)生了瞬時(shí)的，異常的RNA種類，并且起著“危險(xiǎn)”信號(hào)的作用。因此，推測(cè)多種不同的RNA基序是由先天免疫細(xì)胞識(shí)別的，并且深遠(yuǎn)地調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。為了在系統(tǒng)基礎(chǔ)上解釋這種假說(shuō)，篩選了合成的單鏈和雙鏈RNA基序文庫(kù)調(diào)節(jié)對(duì)通過(guò)呼吸道施用的蛋白抗原(OVA)的特異性IgG應(yīng)答的能力。
為了簡(jiǎn)化這一過(guò)程，將所述篩選組織成兩輪(1)第一輪涉及RNA種類的合并物(表1)；和，(2)第二輪剖析對(duì)所述免疫應(yīng)答具有最大影響的合并物中的成分。
本發(fā)明的雙鏈RNA(dsRNA)或單鏈RNA(ssRNA)是由Sigma公司按照以下方法制備的ssRNA多核苷酸(polyA，polyU)是利用核苷酸和多核苷酸-磷酸化酶，通過(guò)酶促方法制備的，沒(méi)有源于動(dòng)物的材料進(jìn)入其制備過(guò)程。dsRNA讓聚腺苷酸(polyA，pA)與聚尿苷酸(polyU，pU)退火。一般，對(duì)于dsRNA來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的dsRNA和ssRNA是均聚物，由單獨(dú)一種堿基或核苷酸(例如，腺嘌呤)一致地構(gòu)成一條鏈，由他的互補(bǔ)體一致地構(gòu)成另一條鏈。對(duì)于ssRNA來(lái)說(shuō)，所述單鏈?zhǔn)怯上嗤暮塑账峋鶆虻貥?gòu)成的。不過(guò)，使用由混合的核苷酸(對(duì)于dsRNA來(lái)說(shuō)，及其互補(bǔ)體)組成的dsRNA或ssRNA組合物屬于本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的dsRNA和ssRNA組合物由堿基/核苷酸腺嘌呤(A)，鳥(niǎo)嘌呤(G)，胞嘧啶(C)，尿嘧啶(U)和肌苷(1)組成。表I和圖8A所示的RNA組合物說(shuō)明了用于這些實(shí)施例的各種RNA組合物。本發(fā)明的RNA組合物是按照例27的方法制備和純化的。
用于本發(fā)明的各種RNA鏈的長(zhǎng)度一般為100-2000個(gè)堿基對(duì)，不過(guò)，其長(zhǎng)度可以為1-20，20-40，40-60，60-80，80-100，1-100，100-200，200-300，300-400，400-500，500-600，600-700，800-900，1000-1100，1100-1200，1200-1300，1300-1400，1400-1500，1500-1600，1600-1700，1700-1800，1800-1900，1900-2000，2000-2100，2100-2200，2300-2400，2400-2500，2500-3000，3000-4000，4000-5000，5000-10,000個(gè)堿基對(duì)，以及超過(guò)10,000個(gè)堿基對(duì)，和/或它們的混合物。
實(shí)施例1RNA基序的各種合并物對(duì)針對(duì)標(biāo)準(zhǔn)抗原(OVA)的抗體應(yīng)答的影響在通過(guò)呼吸道用OVA進(jìn)行共同免疫的C57B1/6小鼠測(cè)定各種RNA合并物(表1)對(duì)適應(yīng)性免疫的影響。正如在″材料和方法″部分所描述的，所述抗體應(yīng)答是以IgG終點(diǎn)滴度的平均值±SEM形式表示的(n＝4/組)。作為對(duì)照，分別使用了無(wú)菌PBS中的OVA，帶有霍亂毒素亞基B的OVA(CTB)和單獨(dú)的PBS。如圖1A所示，相當(dāng)于對(duì)抗體應(yīng)答具有最大影響的dsRNA的合并物，具有明顯增強(qiáng)的特異性免疫。另外，彼此互補(bǔ)的單鏈種類的合并物再現(xiàn)了這種增強(qiáng)作用。
這表明RNA的殘基性質(zhì)和二級(jí)結(jié)構(gòu)都決定著它們起著″危險(xiǎn)″基序作用的能力，對(duì)特異性B細(xì)胞應(yīng)答產(chǎn)生影響。
實(shí)施例2各種單個(gè)的dsRNA基序?qū)φT導(dǎo)針對(duì)OVA的抗體應(yīng)答的影響按照在前面的例子和″材料和方法″部分中所披露的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，不過(guò)，我們沒(méi)有使用RNAs合并物，而是使用單個(gè)的dsRNAs。結(jié)果以與圖1A相同的方式在圖1B中示出。所述結(jié)果表示兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。插圖平均IgG2a和IgG1滴度與OVA的比例。從左到右的順序與主圖類似PBS OVA，CTB OVA，pC:pG OVA，pI:pC OVA和pA:pU OVA。在圖1B所示的第二輪篩選中，證實(shí)了兩種類型的基序組成雙鏈RNA，即pA:pU和pI:pC，它們對(duì)C57BL/6小鼠體內(nèi)針對(duì)特殊抗原的IgG應(yīng)答的產(chǎn)生具有明顯影響。在對(duì)內(nèi)毒素的應(yīng)答受損的TLR4-/-C3H/HeJ小鼠中獲得了類似結(jié)果(未示出)。
因此，單個(gè)的RNA基序在強(qiáng)度和特征方面顯示對(duì)抗體應(yīng)答的影響具有不同的能力。
實(shí)施例3由OVA和各種單個(gè)的dsRNA基序誘導(dǎo)的T細(xì)胞應(yīng)答的強(qiáng)度和特征通過(guò)ELISPOT分析獲得的結(jié)果表示為每個(gè)脾臟的IFN-γ和IL-4斑點(diǎn)形成集落(SFC)數(shù)量的平均值±SEM(n＝4/組)。如圖1C所示，pA:pU和pI:pC(40μg，參見(jiàn)“材料和方法”)都對(duì)特異性T細(xì)胞應(yīng)答具有增強(qiáng)作用。令人吃驚的是，對(duì)特定抗原的T細(xì)胞應(yīng)答的特征取決于RNA殘基的性質(zhì)，這表明免疫系統(tǒng)能夠分辯RNA相關(guān)的危險(xiǎn)基序。含有A和U殘基，而不是I和C的RNA基序，在C57BL/6小鼠體內(nèi)能夠指導(dǎo)產(chǎn)生IFN-γ-的Th1細(xì)胞(圖1C)的分化。這一結(jié)果體現(xiàn)了IgG同種型的不同的誘導(dǎo)作用，與所述Th特征吻合(圖1B-INSET)。
總之，不同的dsRNA基序?qū)輔助細(xì)胞應(yīng)答的強(qiáng)度和特征具有不同的影響。
實(shí)施例4確定的dsRNA基序?qū)︶槍?duì)病毒抗原HIV重組gp140蛋白的抗體應(yīng)答的影響如圖2A所示，用通過(guò)呼吸道單用抗原或用抗原與pA:pU(40μg，參見(jiàn)“材料和方法”)免疫的C57BL/6小鼠測(cè)定對(duì)HIVgp140(10μg，材料和方法”)片段的抗體應(yīng)答的影響。結(jié)果表示為IgG終點(diǎn)滴度的平均值±SEM(n＝3/組)。
因此，通過(guò)使用新的dsRNA基序增強(qiáng)了對(duì)具有潛在實(shí)用價(jià)值的病毒抗原的抗體應(yīng)答。
實(shí)施例5確定的dsRNA基序?qū)︶槍?duì)完整的UV-滅活的流感病毒，病毒株A/WSN/32H1N1(UV-WSN)的抗體應(yīng)答的影響與實(shí)施例4一樣，在用UV-滅活的WSN病毒(UV-WSN)(20μg，參見(jiàn)“材料和方法”)自身或與dsRNA基序(50μg)一起進(jìn)行粘膜免疫接種之后，測(cè)定流感病毒-特異性IgG抗體。作為對(duì)照，使用了用相同的流感病毒株感染之后的抗體應(yīng)答(n＝4/組)。結(jié)果在圖2B中以IgG終點(diǎn)滴度的平均值±SEM形式表示。
因此，通過(guò)使用新的dsRNA基序增強(qiáng)了對(duì)完整的滅活的微生物形式的病毒抗原的抗體應(yīng)答。
實(shí)施例6通過(guò)共同施用確定的dsRNA基序增強(qiáng)對(duì)完整的-滅活的流感病毒的T細(xì)胞應(yīng)答通過(guò)對(duì)脾細(xì)胞進(jìn)行ELISPOT分析研究了對(duì)完整的流感病毒的T細(xì)胞應(yīng)答，并且，在扣除本底之后表示為IFN-γ，IL-4和IL-2 SFC(平均值±SEM，n＝4/組)。將針對(duì)抗原和pA:pU的T細(xì)胞應(yīng)答與用抗原自身免疫接種或流感病毒感染之后的應(yīng)答進(jìn)行比較(參見(jiàn)圖2C)。
因此，正如在實(shí)施例4-6中所證實(shí)的，dsRNA對(duì)抗體應(yīng)答的影響用外源抗原，即HIV包膜蛋白(重組gp140)和完整的-滅活的流感病毒分別得到了證實(shí)(圖2A，B)。事實(shí)上，是pA:pU，而不是pI:pC，將特異性抗體對(duì)流感病毒的滴度恢復(fù)到與通過(guò)感染誘導(dǎo)的類似水平(圖2B)。此外，并且很明顯的是，在用滅活的病毒進(jìn)行免疫接種時(shí)，pA:pU將T細(xì)胞應(yīng)答恢復(fù)到由天然感染所達(dá)到的水平(圖2C)。因此，不同的RNA基序?qū)和B細(xì)胞應(yīng)答產(chǎn)生了以前未知的廣泛的影響。
2)與dsRNA相關(guān)的基序能調(diào)節(jié)專門(mén)的抗原呈遞細(xì)胞的募集和激活有人假設(shè)與dsRNA相關(guān)的危險(xiǎn)基序，如pA:pU和pI:pC能通過(guò)先天免疫的成分間接影響T細(xì)胞應(yīng)答。為了驗(yàn)證這種假設(shè)，在施用RNAs之后，在肺淋巴組織中測(cè)定了趨化因子基因的表達(dá)。
實(shí)施例7dsRNA基序?qū)吇蜃踊虮磉_(dá)的局部上調(diào)在通過(guò)呼吸道治療之后1天，通過(guò)DNA陣列技術(shù)(參見(jiàn)材料和方法″趨化因子基因表達(dá)的測(cè)定″)測(cè)定了dsRNA基序?qū)吇蜃踊虮磉_(dá)的局部上調(diào)。結(jié)果表示為相對(duì)在未處理過(guò)的小鼠的肺組織內(nèi)測(cè)定的表達(dá)水平的增加倍數(shù)。通過(guò)dsRNA誘導(dǎo)的趨化因子表達(dá)模式與通過(guò)LPS誘導(dǎo)的表達(dá)模式不同。分別能選擇性地結(jié)合Th1和Th2細(xì)胞上的受體的趨化因子，用連續(xù)的和間斷的輪廓表示(圖3A)。
所述DNA陣列技術(shù)表明，IP-10，MIG，MIP-1α，MIP-1β和MCP-1受到了pA:pU和pI:pC的強(qiáng)誘導(dǎo)(參見(jiàn)圖3A)。不過(guò)，只有pI:pC能誘導(dǎo)具有結(jié)合由Th2細(xì)胞選擇性地表達(dá)的受體的能力的RANTES，MCP-3和CC趨化因子的表達(dá)。LPS誘導(dǎo)了不同的趨化因子表達(dá)上調(diào)CXC趨化因子MIG和NIP-1α，以及CC趨化因子TCA-3(參見(jiàn)圖3A)。因此，正如以前沒(méi)有預(yù)料到的，趨化因子的復(fù)雜特征是通過(guò)確定的dsRNA基序誘導(dǎo)的。
實(shí)施例8在用dsRNA處理的小鼠肺中募集專門(mén)的APC在處理之后1天，通過(guò)FACS分析評(píng)估在用dsRNA處理的小鼠肺中專門(mén)的APC的募集。在圖3B中，所述結(jié)果表示為CD11c+和CD11b+細(xì)胞占肺間質(zhì)組織中總的細(xì)胞群體的百分比(n＝4/組)。CD11b+(單核細(xì)胞)是通過(guò)pA:pU和pI:pC募集的，與趨化因子表達(dá)的上調(diào)一致(參見(jiàn)實(shí)施例7)。相反，只有pI:pC能有效誘導(dǎo)CD11c+樹(shù)突細(xì)胞的募集?？傊?，dsRNA基序能在施用部位募集APC。
實(shí)施例9通過(guò)dsRNA基序激活專門(mén)的APC(樹(shù)突細(xì)胞)通過(guò)以下方法證實(shí)dsRNA基序?qū)ｉT(mén)的APC的激活用抗原和dsRNA離體脈沖CD11c+細(xì)胞，然后通過(guò)過(guò)繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)進(jìn)入未接觸過(guò)抗原的BALB/c小鼠，并且測(cè)定T細(xì)胞應(yīng)答(圖3C)。作為對(duì)照，分別使用了抗原脈沖的APC，或用rIL-12和抗-CD40mAb共刺激的抗原加載的細(xì)胞。在圖3C中示出的結(jié)果，表示為通過(guò)ELISPOT分析估算的脾臟中的IL-2 SFC數(shù)量。
因此，除了所述募集作用之外，dsRNA基序能激活A(yù)PC。
實(shí)施例10在BALB/c小鼠中通過(guò)dsRNA基序刺激，交叉激發(fā)抗病毒抗原的MHC I類-限制的T細(xì)胞。
通過(guò)ELISPOT分析，在用重組-工程生產(chǎn)的HIVgp140抗原(10μg)和pA:pU一起處理過(guò)的BALB/c小鼠體內(nèi)，研究了通過(guò)dsRNA基序刺激的交叉激發(fā)(是指特定場(chǎng)合，此時(shí)，在沒(méi)有感染的情況下，APC獲得了激發(fā)I類限制的T細(xì)胞的能力)，利用通過(guò)MHC I類-限制的相關(guān)肽進(jìn)行的體外刺激(參見(jiàn)“材料和方法”)。作為對(duì)照，使用了劑量匹配的gp140抗原。在圖3D中，所述結(jié)果表示為IFN-γ和IL-4 SFC數(shù)量/脾的平均值±SEM(n＝4/組)。
總之，dsRNA基序有利于對(duì)具有潛在實(shí)際用途的非傳染性抗原的MHC I類-限制的誘導(dǎo)。
實(shí)施例11在C57BL/6小鼠中，通過(guò)dsRNA基序刺激，交叉激發(fā)針對(duì)OVA的MHC I類-限制的T細(xì)胞。
通過(guò)ELISPOT分析，在用完整的OVA和pA:pU一起處理過(guò)的C57BL/6小鼠體內(nèi)，研究了通過(guò)dsRNA基序刺激的交叉激發(fā)，利用通過(guò)MHC I類-限制的肽進(jìn)行的體外刺激(參見(jiàn)”材料和方法”)。作為對(duì)照，使用了劑量匹配的OVA抗原或無(wú)菌PBS。在圖3E中，所述結(jié)果表示為IFN-γ和IL-4 SFC數(shù)量/脾的平均值±SEM(n＝4/組)。
總之，dsRNA基序有利于對(duì)具有潛在實(shí)際用途的非傳染性抗原的MHC I類-限制的誘導(dǎo)。
在通過(guò)粘膜施用pA:pU和pI:pC之后，對(duì)肺間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行的FACS分析，表明促進(jìn)了CD11b+單核細(xì)胞的募集，并且在第二種情況下，促進(jìn)了CD11c+樹(shù)突細(xì)胞募集(圖3B)。另外，體外溫育來(lái)自未接觸過(guò)抗原的小鼠的CD11c+DC以及抗原和pA:pU，并且在較小程度上與pI:pC一起溫涌，導(dǎo)致了它們的激活，因?yàn)殡S后將抗原脈沖的細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移到BALB/c受體中，誘導(dǎo)了增強(qiáng)的II類-限制的T細(xì)胞免疫(圖3C)。通過(guò)用抗-CD40抗體或IL-12進(jìn)行的APC溫育測(cè)定了類似的增強(qiáng)作用。最后，在用重組HIV包膜蛋白(gp140)或OVA進(jìn)行粘膜接種時(shí)，pA:pU具有強(qiáng)的CD8+T細(xì)胞-促進(jìn)作用(圖3D-E)，正如分別用來(lái)自HIV包膜蛋白和OVA的表征過(guò)的MHC I類-限制的肽進(jìn)行的ELISPOT分析所表明的。因此，dsRNA具有將專門(mén)的APC的分化誘導(dǎo)到與MHC I類-限制的T細(xì)胞的交叉激發(fā)相容的階段的能力。這種類型的免疫應(yīng)答，通常只會(huì)在病毒感染的場(chǎng)合遇到。使用確定的dsRNA基序，可以消除對(duì)活疫苗載體的需要，它與因?yàn)檩d體復(fù)制而產(chǎn)生的副作用相關(guān)?？傊?，以上結(jié)果表明了RNA基序?qū)ο忍烀庖叩囊蛩氐娘@著影響，后者具有調(diào)控適應(yīng)性免疫應(yīng)答的能力。
3)dsRNA基序能阻斷高區(qū)耐受的誘導(dǎo)并且誘導(dǎo)預(yù)防性抗-病毒免疫危險(xiǎn)分子參與分辨無(wú)害抗原和與感染過(guò)程相關(guān)的抗原。在大劑量情況下，非傳染性純化蛋白抗原能誘導(dǎo)無(wú)反應(yīng)性或免疫耐受。獲得對(duì)自身或無(wú)害抗原的耐受性的主要途徑是″免疫忽略″和″免疫耐受″。在第一種場(chǎng)合下，由于空間隔離，抗原不能接觸APC。在第二種場(chǎng)合下，接觸APC的抗原被內(nèi)化，加工，并且所得到的表位在共刺激較弱的情況下被呈遞。凈結(jié)果是在T細(xì)胞水平上誘導(dǎo)了免疫無(wú)反應(yīng)或耐受。在感染或免疫刺激場(chǎng)合下，存在抑制″免疫忽略″和″耐受″的機(jī)制。所述機(jī)制是通過(guò)誘導(dǎo)APC的新遷移模式，和激活共刺激分子和促炎趨化因子和細(xì)胞因子的表達(dá)進(jìn)行的。其結(jié)果是強(qiáng)免疫應(yīng)答，而不是對(duì)免疫系統(tǒng)在通過(guò)″危險(xiǎn)分子″的存在限定的場(chǎng)合下所暴露的任何抗原的忽略或耐受。作為一種例子，腫瘤相關(guān)抗原通常被免疫效應(yīng)物忽略或以耐受性形式出現(xiàn)。恢復(fù)對(duì)所述抗原的免疫感受態(tài)的方式，在抗癌治療中具有實(shí)際意義。為了檢驗(yàn)pA:pU和pI:pC基序的危險(xiǎn)信號(hào)感受態(tài)，使用了通過(guò)靜脈接種hIgG獲得的耐受模型。
實(shí)施例12在用人IgG注射過(guò)的小鼠體內(nèi)，dsRNA基序能預(yù)防高區(qū)耐受。
首先，用標(biāo)準(zhǔn)耐受劑量(200μg)的hIgG自身(實(shí)心符號(hào))或與pI:pC或pA:pU(40-50μg)一起(空心的符號(hào)；參見(jiàn)圖4A)對(duì)小鼠進(jìn)行靜脈注射，隨后用免疫劑量(50μg)的乳化在CFA中的hIgG進(jìn)行皮下加強(qiáng)免疫。在加強(qiáng)免疫之后，通過(guò)ELISA以各種間隔測(cè)定抗hIgG的抗體滴度。作為對(duì)照，使用存在于CFA中的hIgG對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，并且表示最大滴度(不連續(xù)的線條)。在圖4A中，所述結(jié)果表示為終點(diǎn)滴度的平均值±SEM(n＝5/組)。
以上結(jié)果表明，共同接種pA:pU或pI:pC與存在于鹽水中的hIgG，能抑制B細(xì)胞無(wú)反應(yīng)性的誘導(dǎo)，正如在用存在于CFA中的hIgG進(jìn)行加強(qiáng)免疫之后的抗體滴度所證實(shí)的(圖4A)。所述dsRNA相關(guān)的基序能夠誘導(dǎo)較強(qiáng)的初級(jí)應(yīng)答，并且恢復(fù)對(duì)它的原型抗原的次級(jí)反應(yīng)答。類似地，T細(xì)胞特征的評(píng)估表明，通過(guò)共同施用dsRNA，部分恢復(fù)了IL-4和IL-2的產(chǎn)生。
實(shí)施例13dsRNA基序具有動(dòng)員針對(duì)流感病毒感染的免疫防御的不同的能力據(jù)推測(cè)，危險(xiǎn)基序具有迅速動(dòng)員免疫防御的預(yù)防機(jī)制的能力。因此，試驗(yàn)了pA:pU和pI:pC是否對(duì)流感病毒的原發(fā)感染有任何影響。
在用亞致死劑量的流感病毒感染肺部之前和之后1天，通過(guò)呼吸道用pI:pC，pA:pU或鹽水處理小鼠。在第五天，估算了肺組織中的病毒滴度，并且表示為總的感染單位/器官(平均值±SEM；n＝6/組；結(jié)果表示在C3H/HeJ TLR-4-/-和感受態(tài)鼠中進(jìn)行的兩次獨(dú)立研究)。
如圖4B所示，結(jié)果表明，通過(guò)呼吸道用RNA基序處理的小鼠受到了亞致死劑量的流感病毒的感染。在感染5天之后，對(duì)肺的病毒滴度進(jìn)行定量。用C57BL/6和TLR4-/-C3H/HeJ小鼠獲得了類似結(jié)果(未示出)。顯然，所述dsRNAs能夠有效協(xié)調(diào)肺病毒滴度的有效降低。令人吃驚的是，在控制肺病毒滴度方面，pA:pU明顯比pI:pC更有效，這進(jìn)一步突出了所述免疫系統(tǒng)分辨dsRNA相關(guān)的危險(xiǎn)基序的能力。因此，在缺乏免疫記憶的情況下，dsRNA基序能夠動(dòng)員針對(duì)病毒感染的有效的初級(jí)應(yīng)答。
4)通過(guò)與RNA危險(xiǎn)基序一起共同包封而增強(qiáng)對(duì)蛋白抗原的免疫由于對(duì)未配制的亞單位疫苗的免疫應(yīng)答，以及一般來(lái)說(shuō)，對(duì)純化蛋白抗原的免疫應(yīng)答很弱，檢驗(yàn)了在體內(nèi)，在相同的微結(jié)構(gòu)中，讓APC同時(shí)暴露于抗原和dsRNA危險(xiǎn)基序是否會(huì)導(dǎo)致更有利的結(jié)果。為此，將原型抗原(OVA)與短鏈脂類復(fù)合物(″SCL″)中的pA:pU或pI:pC(參見(jiàn)”材料和方法”)與生物相容性和免疫學(xué)惰性磷脂(例如，二辛酰磷脂酰膽堿)及作為賦形劑的乳糖共同配制。在與OVA+配制于短鏈脂類復(fù)合物中的pA:pU或pI:pC一起送遞到C57BL/6小鼠呼吸道中之后，測(cè)定抗體應(yīng)答，這種應(yīng)答明顯比用鹽水中的未配制的抗原或在缺乏dsRNA基序的SCL復(fù)合物中配制的抗原接種的小鼠的抗體應(yīng)答強(qiáng)(圖5A)。
實(shí)施例14模型抗原(OVA)自身或與dsRNA基序一起加載的短鏈脂類復(fù)合物。
制備了由短鏈磷脂組成的并且用模型抗原(OVA)自身或與dsRNA基序一起加載的短鏈脂類復(fù)合物，并且在C57BL/6小鼠中進(jìn)行了試驗(yàn)，如圖5A所示。通過(guò)ELISA測(cè)定所述抗體應(yīng)答，并且表示為氣管內(nèi)免疫接種之后2周IgG終點(diǎn)滴度的平均值±SEM(n＝4/組；數(shù)據(jù)表示兩次獨(dú)立的測(cè)定)。作為對(duì)照，使用了存在于PBS中的OVA和與存在于短鏈脂類復(fù)合物(二辛酰磷脂酰膽堿)中的CTB(霍亂毒素B)共同配制的OVA。所述結(jié)果表明，能夠制備保留了所述RNA基序的免疫學(xué)特性的包括抗原和dsRNA的分子復(fù)合物，并且具有實(shí)用價(jià)值。
實(shí)施例15在用與dsRNA基序共同配制的OVA免疫接種之后，在C57BL/6小鼠體內(nèi)對(duì)完整的OVA抗原或I類-限制的顯性O(shè)VA肽的局部(肺)和系統(tǒng)(脾)T細(xì)胞應(yīng)答。
圖5B表示在C57BL/6小鼠中對(duì)完整的OVA抗原或I類-限制的顯性O(shè)VA肽的局部(肺)和系統(tǒng)(脾)T細(xì)胞應(yīng)答，它是在用有或沒(méi)有pA:pU的存在于短鏈脂類復(fù)合物(二辛酰磷脂酰膽堿)中的OVA免疫的小鼠測(cè)定的。所述分析是通過(guò)ELISPOT進(jìn)行的，結(jié)果表示為IFN-γSFC/器官(平均值±SEM；n＝4/組)。
有趣的是，在短鏈脂類復(fù)合物共同配制的情況下，CTB僅具有有限的佐劑作用。與以前的結(jié)果吻合，如圖5B所示，T1免疫的誘導(dǎo)僅僅是由pA:pU顆粒測(cè)定的，而不是由pI:pC測(cè)定的，后者僅僅表現(xiàn)出T2免疫的增強(qiáng)(未示出)。另外，對(duì)pA:pU共同配制抗原的T細(xì)胞應(yīng)答(參見(jiàn)“材料和方法”)表現(xiàn)出重要的局部成分(圖5B)。最后，利用業(yè)已明確的I類-限制的SIINFEKL[Seq.I.D.No.2]肽，證實(shí)pA:pU保留了與SCL復(fù)合物聯(lián)合促進(jìn)交叉激發(fā)的能力(圖5B)。
實(shí)施例16Sprague-Dawley大鼠對(duì)用通過(guò)與dsRNA基序共同配制的模型抗原(OVA)加載的SC-脂類復(fù)合物進(jìn)行粘膜接種的系統(tǒng)和局部抗體應(yīng)答。
用與OVA和dsRNA共同配制的脂類復(fù)合物對(duì)大鼠進(jìn)行接種。作為對(duì)照，分別使用了缺少抗原的SCL復(fù)合物，用OVA加載的但缺少dsRNA基序的SCL復(fù)合物和存在于鹽水中的劑量匹配量的OVA。所述結(jié)果表示為在第35天通過(guò)ELISA分別在血清(圖5C)和支氣管灌洗液(圖5D)中測(cè)定的OVA-特異性抗體終點(diǎn)滴度(平均值±SEM；n＝4/組)。
對(duì)于Sprague-Dawley大鼠，用加載了OVA和pA:pU或pI:pC的SCL復(fù)合物進(jìn)行氣霧化，測(cè)定了抗體應(yīng)答的類似的增強(qiáng)(圖5C)。用缺少dsRNAs的SC-脂類復(fù)合物或存在于鹽水中的OVA，獲得了較低的滴度。粘膜抗體滴度的分析(圖5D)發(fā)現(xiàn)了類似特征。
因此，通過(guò)使用新的噴霧干燥技術(shù)共同配制RNA相關(guān)的危險(xiǎn)基序和蛋白抗原，保存了RNA基序的免疫調(diào)節(jié)特性，并且導(dǎo)致了局部和系統(tǒng)特異性免疫應(yīng)答的顯著增強(qiáng)。
實(shí)施例17非復(fù)制dsRNA基序起著適應(yīng)性(B和T細(xì)胞)免疫應(yīng)答的總開(kāi)關(guān)的作用。
諸如dsRNA的缺少危險(xiǎn)基序的抗原是弱免疫原性的，或者如果大劑量提供的話，可能誘導(dǎo)免疫耐受。不過(guò)，dsRNA基序能改變免疫系統(tǒng)察覺(jué)所述抗原的方式取代弱反應(yīng)性或耐受的是，所述基序指示適應(yīng)性(T和B細(xì)胞)免疫對(duì)同時(shí)存在的抗原產(chǎn)生強(qiáng)的反應(yīng)，并且防止或阻斷免疫耐受。因此，利用dsRNA基序識(shí)別的先天免疫起著適應(yīng)性B和T細(xì)胞免疫的總開(kāi)關(guān)的作用(圖7)。
實(shí)施例18.天然存在的dsRNA能聯(lián)系先天與適應(yīng)性免疫應(yīng)答。實(shí)施例18表示在流感病毒感染期間產(chǎn)生的天然的，非傳染性雙鏈RNA，對(duì)針對(duì)蛋白抗原的特異性免疫應(yīng)答具有顯著影響。
用WSN流感病毒(108TCID50/1×109細(xì)胞)感染允許性MDCK細(xì)胞，并且在24小時(shí)之后，收獲所述細(xì)胞，洗滌，并且用RNA分離試劑盒(Qiagen，Valencia，CA)提取總RNA。通過(guò)用無(wú)RNAse的DNAseI(Stratagene，San Diego，CA)處理，進(jìn)一步純化所述RNA。然后，通過(guò)在37℃下，用5μ的S1核酸酶(Ambion，Inc.，Austin，TX)/μg RNA溫育30分鐘除掉樣品中的單鏈RNA。在所述消化之前和之后，通過(guò)凝膠電泳分析所述RNA。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)流感病毒滴定證實(shí)純化的dsRNA的感染特性的存在。作為對(duì)照，使用了來(lái)自109個(gè)未感染過(guò)的MDCK細(xì)胞的，以類似方法純化和處理的材料。通過(guò)分光光度測(cè)定法(A260nm)測(cè)定核酸濃度，并且通過(guò)Limulus分析證實(shí)內(nèi)毒素的缺乏。分別使用了純化的dsRNA和對(duì)照RNA，或者作為與gp140重組抗原的混合物(25μg的RNA和2μg的抗原，存在于25ml無(wú)菌PBS中)。
在證實(shí)缺乏感染性之后，將40μg的dsRNA或?qū)φ誖NA與40μg的重組截短的抗原(gp140HIV包膜)混合，并且通過(guò)鼻腔滴注給BALB/c小鼠施用(n＝3/組)。其他對(duì)照是用存在于鹽水中的40μg gp140蛋白(n＝3/組)接種的動(dòng)物。在激發(fā)2周之后，對(duì)小鼠進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫。在加強(qiáng)免疫2周之后采集血液，制備血清，并且通過(guò)ELISA測(cè)定針對(duì)gp140的抗體應(yīng)答。簡(jiǎn)單地講，用抗原(2μg/ml gp140)對(duì)孔進(jìn)行包被，并且用SeaBlock(Pierce，Rockford，IL，目錄號(hào)37527)封閉。在室溫下，將血清和支氣管灌洗液的系列稀釋液溫育至少2小時(shí)。洗滌之后，用與堿性磷酸酶(Sigma，目錄號(hào)A7434)偶聯(lián)的抗-小鼠IgG抗體對(duì)所述測(cè)定進(jìn)行顯影，然后添加底物(pNPP，Sigma，目錄號(hào)N2765)，并且利用裝有SoftMax軟件的自動(dòng)化微量滴定板讀數(shù)儀(Molecular Devices，ThermoMax)測(cè)定。
在圖7的圖片A中，示出了所述實(shí)驗(yàn)的一般原理。在圖7中，圖片B示出了對(duì)于完整的IgG，在測(cè)定顯影之后的吸收，相當(dāng)于各種血清稀釋。在圖7中，圖片B表示對(duì)于IgG2a和IgG1抗體同種型，以1/50的比例進(jìn)行血清稀釋的吸收。
總體上，圖7中的圖片A-B的數(shù)據(jù)，表示來(lái)自流感病毒-感染的MDCK細(xì)胞的天然的、非傳染性dsRNA對(duì)于針對(duì)原型抗原的適應(yīng)性應(yīng)答具有出乎意料的增強(qiáng)作用。IgG1和IgG2a抗體應(yīng)答都得到增強(qiáng)，表明誘導(dǎo)了強(qiáng)的T輔助1和2反應(yīng)。
實(shí)施例19.選定的RNA基序?qū)ο忍烀庖邞?yīng)答的影響異源基序。
本實(shí)施例出乎意料地表明，不同的合成RNA基序?qū)︶槍?duì)蛋白抗原的適應(yīng)性特異性免疫應(yīng)答具有不同的影響。
圖8A表示合成RNA基序的廣泛的文庫(kù)，將這些文庫(kù)分成各種合并物，并且用于以下雙滴度篩選過(guò)程(A)用RNA合并物對(duì)所述小鼠進(jìn)行氣管內(nèi)免疫，隨后間隔2周，通過(guò)鼻腔內(nèi)滴注進(jìn)行2次加強(qiáng)免疫。通過(guò)ELISA測(cè)定的抗體應(yīng)答(圖8B)表示為IgG終點(diǎn)滴度的平均值±SEM(n＝4/組)。作為對(duì)照，分別使用存在于無(wú)菌PBS中的劑量匹配的OVA，OVA與霍亂毒素亞單位B(CTB)和單獨(dú)的PBS。簡(jiǎn)單地講，用抗原(10μg/ml的OVA)對(duì)孔進(jìn)行包被，并且用SeaBlock(Pierce，Rockford，IL，目錄號(hào)37527)封閉。在室溫下，將血清和支氣管灌洗液的系列稀釋液溫育至少2小時(shí)。在洗滌之后，用與堿性磷酸酶(Sigma，目錄號(hào)A7434)結(jié)合的抗-小鼠IgG抗體對(duì)所述測(cè)定進(jìn)行顯影，然后添加底物(pNPP，Sigma，目錄號(hào)N2765)，并且利用裝有SoftMax軟件的自動(dòng)化微量滴定板讀數(shù)儀(Molecular Devices，ThermoMax)測(cè)定。
(B)各種dsRNA基序?qū)φT導(dǎo)針對(duì)OVA的抗體應(yīng)答的影響結(jié)果如圖8C所示。結(jié)果表示兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。插圖平均IgG2a和IgG1滴度與OVA的比例。為此，使用了生物素-偶聯(lián)的抗-小鼠IgG1和IgG2a抗體，然后用鏈霉抗生物素-AKP偶聯(lián)物培養(yǎng)。從左到右的順序與圖8C中的主圖片類似PBS OVA，CTB OVA，pC:pG OVA，pI:pC OVA和pA:pU OVA。
(C)在雌性C57BL/6小鼠中，通過(guò)OVA和各種dsRNA基序誘導(dǎo)的T細(xì)胞應(yīng)答的強(qiáng)度和特征。為了測(cè)定細(xì)胞應(yīng)答，通過(guò)讓器官通過(guò)70微米的尼龍F(tuán)alcon濾網(wǎng)(Becton Dickinson，目錄號(hào)352350)，然后用紅細(xì)胞裂解緩沖液(Sigma，目錄號(hào)R7757)裂解紅細(xì)胞，獲得了脾細(xì)胞懸浮液。通過(guò)用膠原酶(Sigma，目錄號(hào)C9891)消化肺組織，然后進(jìn)行Ficoll-Paque(Amersham Pharmacia，目錄號(hào)17-1440-02)梯度離心，從肺相關(guān)的淋巴組織中分離了淋巴細(xì)胞。通過(guò)ELISPOT分析，按照以下方法測(cè)定T細(xì)胞應(yīng)答用4μg/ml的大鼠抗-小鼠抗-IFNγ，IL-2或IL-4單克隆抗體(分別為BD-PharMingen，目錄號(hào)554430，目錄號(hào)18161D，目錄號(hào)554387)對(duì)96-孔45微米混合的纖維素酯平板(Millipore，目錄號(hào)MAHA S4510)進(jìn)行包被。在37℃下，用存在于無(wú)菌鹽水中的10％FCS封閉1小時(shí)之后，以5×105細(xì)胞/孔的密度添加脾細(xì)胞懸浮液，有或沒(méi)有抗原/肽。為了刺激，使用了梯度量的抗原(OVA)。在刺激72小時(shí)之后，用生物素化的大鼠抗-小鼠細(xì)胞因子抗體(BD-PharMingen)，然后使用鏈霉抗生物素-HRP(BioSourceInt.，Camarillo，CA)和不可溶的AEC底物對(duì)所述測(cè)定進(jìn)行顯影。利用裝有多參數(shù)-分析軟件(Image Pro，Media Cybernetics)的自動(dòng)化成像系統(tǒng)(Navitar/Micromate)測(cè)定所述結(jié)果。在圖8D中，所述結(jié)果表示為每個(gè)脾臟的IFN-γ和IL-4斑點(diǎn)形成集落(SFC)數(shù)量的平均值±SEM(n＝4/組)。所述結(jié)果代表兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。
圖8B-D中的結(jié)果，表示不同的合成RNAs對(duì)于針對(duì)原型蛋白抗原的B和T細(xì)胞應(yīng)答具有增強(qiáng)作用。另外，包括特定核苷酸組合的不同的基序，在T1和T2誘導(dǎo)方面具有特殊影響，并且隨后發(fā)生免疫球蛋白同種型轉(zhuǎn)換。
實(shí)施例20.使用選定的合成RNA基序能促進(jìn)產(chǎn)生IFN-γ的MHC I類-限制的Tc1細(xì)胞的誘導(dǎo)。
(A)在用10μg重組-工程產(chǎn)生的HIVgp140抗原與pA:pU一起處理(激發(fā)加2次加強(qiáng)免疫)的BALB/c小鼠中，研究了通過(guò)dsRNA基序刺激的交叉激發(fā)。通過(guò)實(shí)施例19所披露的ELISPOT分析測(cè)定應(yīng)答，用源于V3結(jié)構(gòu)域的MHC I類-限制的相關(guān)肽R10K進(jìn)行體外刺激。作為對(duì)照，使用了劑量匹配的gp140抗原。在圖9A中，結(jié)果表示為每個(gè)脾臟的IFN-γ和IL-4 SFC數(shù)量的平均值±SEM(n＝4/組)。
(B)在用100μg完整的OV與pA:pU一起處理(激發(fā)加2次加強(qiáng)免疫)的C57BL/6小鼠中，通過(guò)實(shí)施例19所披露的ELISPOT分析，利用MHC I類-限制的肽SUNFEKL[SEQ.I.D.No.2]進(jìn)行體外刺激，研究了通過(guò)dsRNA基序刺激的交叉激發(fā)。作為對(duì)照，使用了存在于鹽水中的OVA抗原或無(wú)菌PBS。在圖9B中，結(jié)果表示為每個(gè)脾臟的IFN-γ和IL-4 SFC數(shù)量的平均值±SEM(n＝4/組)。
圖9A-B中的結(jié)果表示，選定的合成RNA基序能夠促進(jìn)針對(duì)較大抗原(多肽)中所包含的不同MHC I類-限制的肽的增強(qiáng)的T細(xì)胞免疫。該免疫應(yīng)答包括Tc1成分，它由能生產(chǎn)IFN-γ的MHC I類-限制的T細(xì)胞組成。
實(shí)施例21表示不同的合成RNA基序出乎意料地結(jié)合不同的細(xì)胞受體；換句話說(shuō)，存在多種能分辨RNA基序的受體。
通過(guò)FACS分析，通過(guò)熒光-標(biāo)記的pA:pU測(cè)定CD11b+APC的體外結(jié)合。在4℃下，將MACS-分離的APC與10μg/ml標(biāo)記過(guò)的pA:pU([pA:pU]-F)一起溫育30分鐘，洗滌，并且分析。另外，將APC分別與20或100μg/ml未標(biāo)記過(guò)的pA:pU，pA或pI:pC一起預(yù)溫育10分鐘，然后，用標(biāo)記過(guò)的pA:pU染色，并且進(jìn)行FACS分析。在每一個(gè)圖片中，分別表示染色的(空心區(qū)域)，未染色的(實(shí)心區(qū)域)細(xì)胞和強(qiáng)染色的APC的百分比的曲線，X軸取對(duì)數(shù)。所述結(jié)果表示兩次獨(dú)立的測(cè)定，每一個(gè)樣品獲得了10,000個(gè)事件。
材料小鼠CD11b，CD11c磁力分離珠分別為Miltenyi Biotec，目錄號(hào)130-049-601，目錄號(hào)130-052-001；ULYSIS核酸標(biāo)記試劑盒Alexa 488，Molecular Probes目錄號(hào)U21650；RNA基序·pA:pU，(Sigma，批號(hào)22K4068)；·pI:pC，(Sigma，批號(hào)52K4047)；·pA，(Sigma，批號(hào)22K4022)；FACS緩沖液PBS，1％FCS，0.1％疊氮化鈉；MACs緩沖液PBS，2mM EDTA，0.5％BSA；膠原酶緩沖液0.225mg BSA，0.0062mg膠原酶，存在于50ml RPMI中；和，70μm細(xì)胞過(guò)濾器(Falcon/Becton Dickinson，目錄號(hào)352350。
方法I RNA基序的標(biāo)記1.在以下方法中，用ULYSIS Alexa 488標(biāo)記物標(biāo)記每種RNA基序。
II 脾細(xì)胞制備1.從4只雌性C57BL/6小鼠中分離脾細(xì)胞和肺細(xì)胞；·與脾細(xì)胞不同，必須切碎肺細(xì)胞，并且在37℃下，在膠原酶緩沖液中溫育30分鐘，然后進(jìn)行以下步驟；·通過(guò)70μm falcon細(xì)胞過(guò)濾器；·洗滌并且重新懸浮在MACS緩沖液中2.按照推薦的方法，用CD11b或CD11c特異性MACS珠進(jìn)行標(biāo)記；3.然后，用以下物質(zhì)處理細(xì)胞·未標(biāo)記過(guò)的pA，pA:pU，或pI:pC(20或100μg/ml)，在室溫下標(biāo)記10分鐘；·分別以1.5μg/管和10μg/管ULYSIS標(biāo)記過(guò)的pA或pA:pU的用量添加，以便與每種基序的染料dsRNA比例匹配。
混合，并且在冰上溫育30分鐘。
洗滌一次，并且重新懸浮在FACS緩沖液中。
III 流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，以便測(cè)定/比較標(biāo)記過(guò)的和未標(biāo)記過(guò)的RNA基序的競(jìng)爭(zhēng)抑制和細(xì)胞受體結(jié)合。
圖10中的結(jié)果表示pA:pU和pI:pC結(jié)合不同的細(xì)胞受體。由于pI:pC結(jié)合TLR3，業(yè)已證實(shí)，與TLR3不同的其他受體參與了RNA識(shí)別免疫功能。
實(shí)施例22表示選定的合成RNA基序能誘導(dǎo)對(duì)免疫活性重要的趨化因子基因的體內(nèi)表達(dá)。
使用在通過(guò)呼吸道施用之后1天從肺組織中提取的RNA，通過(guò)DNA陣列技術(shù)測(cè)定dsRNA基序?qū)吇蜃踊虮磉_(dá)的局部上調(diào)。利用RNeasy試劑盒(Qiagen，Valencia，CA)從肺中分離總RNA。通過(guò)用無(wú)RNase的DNase I(Stratagene，San Diego，CA)處理進(jìn)一步純化所述RNAs。通過(guò)使用購(gòu)自SuperArray Inc.(Bethesda，MD)的Nonrad-GEArray試劑盒進(jìn)行DNA陣列。簡(jiǎn)單地講，利用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶和含有生物素-16-dUTP的dNTP混合物合成cDNA探針。在68℃下，將GEArray膜預(yù)雜交1-2小時(shí)。通過(guò)將所述膜與生物素-標(biāo)記過(guò)的cDNA一起溫育而進(jìn)行雜交。雜交過(guò)的膜用2xSSC-1％SDS洗滌兩次，并且用0.1xSSC-0.5％SDS洗滌兩次。所述膜進(jìn)一步與堿性磷酸酶-偶聯(lián)的鏈霉抗生物素(BioSource Int.，Camarillo，CA)一起溫育，并且最終用CDP-Star化學(xué)發(fā)光底物顯影。利用裝有Gel-Pro軟件的Image-Pro分析系統(tǒng)(Media Cybernetics，Silver Springs，MD)測(cè)定信號(hào)強(qiáng)度。
結(jié)果(圖11)表示為相對(duì)在未處理過(guò)的小鼠肺組織中測(cè)定的基因表達(dá)水平增加的倍數(shù)。比較了通過(guò)dsRNAs(分別是50μg的pA:pU和pI:pC)誘導(dǎo)的趨化因子表達(dá)模式，和通過(guò)1μg的LPS誘導(dǎo)的趨化因子表達(dá)模式。選擇性地結(jié)合Th1和Th2細(xì)胞上的受體的趨化因子分別用連續(xù)的和不連續(xù)的輪廓表示。
圖11中的結(jié)果表示pA:pU和pI:pC能誘導(dǎo)多種趨化因子的表達(dá)，并且其表達(dá)模式是基序-依賴型的，并且與LPS(內(nèi)毒素)誘導(dǎo)的表達(dá)不同。
實(shí)施例23表示特定的合成RNA基序能動(dòng)員能夠控制肺病毒感染的棉衣防御。
dsRNA基序具有動(dòng)員針對(duì)流感病毒感染的免疫防御的不同能力。在用亞致死劑量的流感病毒感染肺部之前和之后1天，通過(guò)呼吸道，用50μg的pI:pC，pA:pU或50μl鹽水處理C3H/HeJ小鼠。為了進(jìn)行病毒侵襲，通過(guò)呼吸道用亞致死劑量(104組織培養(yǎng)物感染劑量50％-TCID50)的活的WSN(A/WSN/H1n1)病毒感染用Metofane麻醉的C57BL/6和TLR4-/-C3H/HeJ小鼠。在感染之后第五天，處死所述小鼠，取出肺，勻漿，并且在-70℃下保存。通過(guò)將樣品的系列稀釋液與允許性MDCK細(xì)胞一起溫育48小時(shí)，然后用雞紅細(xì)胞(購(gòu)自AnimalTechnologies)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)血細(xì)胞凝集，測(cè)定病毒滴度。通過(guò)內(nèi)推法進(jìn)行三次測(cè)定評(píng)估終點(diǎn)滴度，并且表示為T(mén)CID50/器官(平均值±SEM；n＝6/組；結(jié)果代表用C3H/HeJ TLR-4-/-和感受態(tài)小鼠進(jìn)行的兩個(gè)獨(dú)立研究)。用TLR4感受態(tài)，C57BL/6小鼠獲得了類似結(jié)果。
因此，在圖12中示出的結(jié)果表示通過(guò)使用選定的合成RNA基序能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)流感病毒復(fù)制的控制。
實(shí)施例24表示共同施用選定的合成RNA基序能破壞對(duì)高劑量標(biāo)準(zhǔn)抗原的耐受。
在用IgG注射的小鼠中，dsRNA基序能防止高區(qū)耐受。首先用耐受劑量的200μg的hIgG自身(實(shí)心的符號(hào))或與100μg的pI:pC或pA:pU(空心的符號(hào))一起對(duì)小鼠(C57BL/6)進(jìn)行靜脈注射，然后用乳化于CFA(完全弗氏佐劑)中的免疫原性劑量的100μg的hIgG通過(guò)皮下注射進(jìn)行加強(qiáng)免疫。通過(guò)ELISA(如在實(shí)施例19中所披露的)測(cè)定對(duì)hIgG的抗體滴度，其不同之處在于，在首次注射之后，以不同的間隔，用10μg/ml的hIgG進(jìn)行包被。作為對(duì)照，包括用乳化于CFA中的100μg的hIgG免疫的小鼠，并且在曲線上代表最大滴度(間斷的線條)。
圖13中的結(jié)果表示為終點(diǎn)滴度的平均值±SEM(n＝5/組)。用TLR4缺陷型(C3H/HeJ)和LPS反應(yīng)型C3H/SnJ小鼠獲得了類似結(jié)果。因此，圖13中的結(jié)果表示選定的合成RNA基序pI:pC和pA:pU能大大防止通常與施用大量純化蛋白相關(guān)的耐受。
實(shí)施例25表示選定的RNA基序能誘導(dǎo)人APC的不同的細(xì)胞因子產(chǎn)生。
在分化之后，將人THP-1單核細(xì)胞與不同濃度的合成RNA(pA:pU，pI:pC或pA)一起溫育24小時(shí)，并且收集細(xì)胞上清液。通過(guò)ELISA測(cè)定IL-12和TNF-α的濃度。在圖14中，結(jié)果表示為每種細(xì)胞因子和培養(yǎng)條件的pg/ml(濃度)。
圖14中的結(jié)果表示選定的合成RNA基序?qū)θ藛魏思?xì)胞的影響；另外，這種影響是異源的，取決于所述基序(核苷酸組成)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。選定的，而不是所有的合成RNA基序能夠誘導(dǎo)人單核細(xì)胞的IL-12產(chǎn)生，它是一種重要的T1調(diào)控細(xì)胞因子。
材料THP-1人單核細(xì)胞系A(chǔ)TCC，目錄號(hào)TIB-202；IL-12細(xì)胞因子人ELISA，IL-12超敏(US)目錄號(hào)KHC0123；TNFα細(xì)胞因子人ELISA，TNFα目錄號(hào)KHC3012；RNA基序·pA:pU，(Sigma，批號(hào)22K4068)；·pI:pC，(Sigma，批號(hào)52K4047)；和·pA，(Sigma，批號(hào)22K4022)。
方法1.在含有10％FCS的培養(yǎng)基中添加10ng/ml PMA之后，讓THP-1細(xì)胞進(jìn)行分化。
2.輕柔洗滌細(xì)胞，并且添加不含F(xiàn)CS的培養(yǎng)基(HL-1)，以3-100μg/ml的濃度在貼壁THP-1細(xì)胞頂部添加處理劑(RNA基序和對(duì)照)。
3.溫育24小時(shí)之后，收集細(xì)胞上清液，并且通過(guò)ELISA測(cè)定IL-12和TNFα濃度。
實(shí)施例26表示兩種不同的合成RNA基序以表明了與不同受體的相互作用的方式結(jié)合人THP-1單核細(xì)胞。
在室溫下，將THP-1細(xì)胞與不同量的未標(biāo)記過(guò)的合成RNA一起溫育15分鐘。然后，添加標(biāo)記過(guò)的pA:pU，在4℃下溫育30分鐘，洗滌細(xì)胞，并且通過(guò)FACS分析進(jìn)行熒光定量。圖15A-15B中的結(jié)果是以相當(dāng)于的大細(xì)胞亞型(A)和總的細(xì)胞群體(B)形式表示的柱狀圖。在每個(gè)圖上示出了染色的細(xì)胞的百分比。
圖15A-15B中的結(jié)果表示未標(biāo)記過(guò)的pA:pU，而不是未標(biāo)記過(guò)的pI:pC能夠競(jìng)爭(zhēng)標(biāo)記過(guò)的pA:pU與人THP-1單核細(xì)胞的結(jié)合，均在大細(xì)胞亞型和整個(gè)群體的水平上。
材料1.ULYSIS核酸熒光標(biāo)記(Molecular Probes，目錄號(hào)U-21650)。
2.RNA基序·pA:pU，(Sigma，批號(hào)22K4068)；·pI:pC，(Sigma，批號(hào)52K4047)；3.Detoxi-Gel柱(Pierce，目錄號(hào)20344)。
方法聚腺苷酸-聚尿苷酸(pA:pU)的I標(biāo)記在用Detoxi-Gel柱除掉內(nèi)毒素之后，利用ULYSIS核酸標(biāo)記系統(tǒng)，用Alexa Fluor 488熒光染料標(biāo)記pA:pU。
簡(jiǎn)單地講·在-70℃下用乙酸鈉和乙醇沉淀pA:pU；·對(duì)pA:pU進(jìn)行加熱變性，并且在90℃下用Alexa Fluor 488試劑標(biāo)記；和·終止所述反應(yīng)，并且對(duì)標(biāo)記過(guò)的pA:pU進(jìn)行乙醇沉淀。
II細(xì)胞處理以2×106細(xì)胞/ml的密度懸浮THP-1細(xì)胞；將50μl上述懸浮液(5×104細(xì)胞)放入12×75mm試管中；以20或100μg/ml的濃度，將未標(biāo)記過(guò)的pA:pU或pI:pC添加到THP-1細(xì)胞中，并且溫育15分鐘；以100μg/ml的濃度添加ULYSIS標(biāo)記過(guò)的pA:pU，在冰上溫育30分鐘。
洗滌THP-1細(xì)胞一次，并且懸浮在FACS緩沖液中，然后進(jìn)行流式細(xì)胞分析，以便測(cè)定不同處理群體之間的相對(duì)熒光差異。
實(shí)施例27表示在使用之前佐劑合成RNA如何制備和純化，以便發(fā)揮最大效果。
總的合成RNA材料是通過(guò)有機(jī)合成的標(biāo)準(zhǔn)方法獲得的。然后，將所述材料溶解在無(wú)內(nèi)毒素的無(wú)菌鹽水中，通過(guò)除內(nèi)毒素柱，直到LPS的濃度低于0.005EU/μg。LPS的測(cè)定是通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)Limulus測(cè)定進(jìn)行的。隨后，通過(guò)用特定孔度的濾膜實(shí)施一系列離心步驟，分級(jí)分離所述材料(參見(jiàn)圖16)。
有用的級(jí)份包括大小小于20至最大100bp的合成RNA。在純化之后，測(cè)定所述材料，并且通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定確認(rèn)分光光度測(cè)定法(OD260nm)；凝膠電泳；通過(guò)Limulus測(cè)定進(jìn)行內(nèi)毒素定量；在人THP-1細(xì)胞上的生物活性(參見(jiàn)實(shí)施例25)。
實(shí)施例28出人意料地表示選定的合成RNA化合物的不同級(jí)份，根據(jù)大小具有不同的生物學(xué)活性。
將分化的人THP-1單核細(xì)胞與不同濃度的合成RNA(pA:pU，按照實(shí)施例27所述披露的方法分級(jí)分離)一起溫育24小時(shí)，并且收集上清液。使用BioSource International試劑盒(Camarillo，CA)，通過(guò)ELISA測(cè)定TNF-α的濃度。所述結(jié)果在圖17中表示為每種培養(yǎng)條件下的pg/ml(濃度)。
圖17在示出的結(jié)果表明選定的合成RNA化合物的較小分子量的級(jí)份在由人單核THP-1細(xì)胞生產(chǎn)細(xì)胞因子方面具有較高的生物學(xué)活性。
實(shí)施例29.就抗-RNA抗體的產(chǎn)生而言，選定的合成RNA基序出人意料地具有不同的免疫特征。
通過(guò)腹膜內(nèi)和皮下[i.p.+s.c.]途徑，用50μg+50μg的hIgG和合成RNA(pI:pC或pA:pU)免疫BALB/c小鼠，并且在1周之后制備血清樣品。作為對(duì)照，使用了用存在于鹽水中的hIgG注射過(guò)的小鼠。通過(guò)ELISA測(cè)定針對(duì)pA:pU，pI:pC，pA和hIgG的抗-hIgG，和dsRNA IgG抗體滴度。簡(jiǎn)單地講，用抗原(10μg/ml的hIgG或合成RNAs)對(duì)孔進(jìn)行包被，并且用SeaBlock(Pierce，Rockford，IL，目錄號(hào)37527)封閉。在室溫下，將血清和支氣管灌洗液的系列稀釋液溫育至少2小時(shí)。在洗滌之后，用與堿性磷酸酶(Sigma，目錄號(hào)A7434)偶聯(lián)的抗-小鼠IgG抗體對(duì)所述測(cè)定進(jìn)行顯影，然后添加底物(pNPP，Sigma，目錄號(hào)N2765)，并且通過(guò)使用裝有SoftMax軟件的自動(dòng)化微量滴定板讀數(shù)儀(Molecular Devices，ThermoMax)測(cè)定。
圖18中的結(jié)果表示為終點(diǎn)滴度的平均值±SEM(n＝3/組)。圖18中的結(jié)果表示pI:pC，而不是pA:pU誘導(dǎo)了針對(duì)它自身的抗體應(yīng)答，具有針對(duì)其他RNA基序的交叉反應(yīng)成分。
實(shí)施例30.用重組IgG體內(nèi)加載APC，只有在滿足其他條件時(shí)才能導(dǎo)致Tc1型MHC I類應(yīng)答的產(chǎn)生。
通過(guò)皮下途徑，用與50μg選定的合成RNA(pA:pU或pI:pC)混合的50μg的重組IgG-NP(Kd)(參見(jiàn)圖31A-31D)(NP肽是A型流感病毒的受到保護(hù)的和保守的表位)免疫BALB/c小鼠。作為對(duì)照，使用了未接觸過(guò)抗原的小鼠或僅用重組IgG免疫的小鼠。在免疫接種3周之后，通過(guò)ELISPOT分析按照以下方法測(cè)定T細(xì)胞應(yīng)答在4℃下，將ELISPOT平板(Millipore，Molsheim，F(xiàn)rance)與存在于無(wú)菌PBS(50μl/孔)中的純化的抗-細(xì)胞因子Abs(對(duì)于抗-IL4，4μg/ml，對(duì)于抗-IFNγ，8μg/ml，購(gòu)自BD Pharmingen)一起溫育過(guò)夜。次日，用DMEM培養(yǎng)基洗滌平板2次，并且，在37℃下，用200μl/孔的含有FBS的完全DMEM封閉1小時(shí)。用脾臟制備單細(xì)胞懸浮液，裂解紅細(xì)胞，洗滌細(xì)胞，計(jì)數(shù)，并且以5×105/孔的密度與NP 147-155肽或僅僅與培養(yǎng)基一起溫育，以便評(píng)估背景。在37℃下，5％CO2中溫育平板72小時(shí)。3天之后，用PBS-tween20 0.05％(洗滌緩沖液)洗滌平板5次，并且在4℃下以100μl/孔的用量，與存在于PBS-tween200.05％-FBS 0.1％(ELISPOT緩沖液)中的2μg/ml的生物素化的抗-細(xì)胞因子Abs一起溫育過(guò)夜。
次日，用洗滌緩沖液洗滌平板5次，并且用在ELISPOT緩沖液中以1∶1000的比例稀釋的鏈霉抗生物素-HRP溫育1小時(shí)。用3-氨基-9-乙基咔唑底物(Sigma，St.Luis，MO)對(duì)所述反應(yīng)進(jìn)行顯影，并且通過(guò)用自來(lái)水洗滌所述平板兩次，終止反應(yīng)。然后，讓所述平板在室溫下干燥24小時(shí)。
數(shù)據(jù)是使用裝有ImagePro-Plus軟件(Media Cybernetics，SilverSpring，MD)的自動(dòng)化系統(tǒng)(Navitar，Rochester，NY)獲得的。測(cè)定產(chǎn)生細(xì)胞因子的T細(xì)胞與NP肽(NP肽是A型流感病毒的保護(hù)性和保守的表位)反應(yīng)的頻率，并且針對(duì)用于刺激的肽的量表示。圖19中的結(jié)果表示為三次重復(fù)的平均值±SEM(n＝3小鼠/組)。
施用具有NP MHC I類-限制的表位的重組IgG，導(dǎo)致了Tc2免疫的產(chǎn)生，但是沒(méi)有產(chǎn)生Tc1應(yīng)答，這意味著具有特異性共刺激特征的I類-肽復(fù)合物的體內(nèi)形成。圖19中的結(jié)果表示在IgG介導(dǎo)的MHC I類-限制的表位(dsRNA1是pA:pU且dsRNA2是pI:pC)送遞之后，共同使用選定的合成RNAs促進(jìn)了IL-2和IFN-γ的有效誘導(dǎo)。
實(shí)施例31通過(guò)同時(shí)操縱通過(guò)FcγR進(jìn)行的APC加載和通過(guò)RNA受體進(jìn)行的激活，實(shí)現(xiàn)MHC I類肽的有效形成和所得到的T細(xì)胞應(yīng)答的指導(dǎo)。
從未接觸過(guò)抗原的BALBc小鼠體內(nèi)分離脾APC，并且在有或沒(méi)有50μg/ml選定的合成dsRNA(pA:pU)的條件下用1μg NP肽，或50μg重組IgG-NP(Kd)在離體脈沖過(guò)夜。洗滌所述細(xì)胞，并且通過(guò)皮下和腹膜內(nèi)注射，給未接觸過(guò)抗原的BALB/c小鼠施用等量的5×106細(xì)胞。3周之后，按照以下方法，通過(guò)ELISPOT分析測(cè)定所述應(yīng)答在4℃下，將ELISPOT平板(Millipore，Molsheim，F(xiàn)rance)與存在于無(wú)菌PBS(50μl/孔)中的純化的抗-細(xì)胞因子Abs(抗-IL4，4μg/ml，抗-IFNγ，8μg/ml，購(gòu)自BD Pharmingen)一起溫育過(guò)夜。次日，用DMEM培養(yǎng)基洗滌平板2次，并且在37℃下，以200μl/孔的用量用含有FBS的完全DMEM封閉。用脾制備單細(xì)胞懸浮液，裂解紅細(xì)胞，洗滌細(xì)胞，計(jì)數(shù)，并且以5×105/孔的用量與30μg/ml，10μg/ml，或3μg/ml NP肽或僅僅與培養(yǎng)基一起溫育，以便評(píng)估背景水平。在37℃下，在5％CO2中溫育平板72小時(shí)。3天之后，用PBS-tween20 0.05％(洗滌緩沖液)洗滌平板5次，在4℃下，以100μl/孔的用量，用存在于PBS-tween20 0.05％-FBS 0.1％(ELISPOT緩沖液)中的濃度為2μg/ml的生物素化的抗-細(xì)胞因子Abs溫育過(guò)夜。次日，用洗滌緩沖液洗滌平板5次，并且用在ELISPOT緩沖液中以1∶1000的比例稀釋的鏈霉抗生物素-HRP溫育1小時(shí)。用3-氨基-9-乙基咔唑底物(Sigma，St.Luis，MO)對(duì)所述反應(yīng)進(jìn)行顯影，并且通過(guò)用自來(lái)水洗滌所述平板兩次，終止反應(yīng)。然后，讓所述平板在室溫下干燥24小時(shí)。
數(shù)據(jù)是使用裝有ImagePro-Plus軟件(Media Cybernetics，SilverSpring，MD)的自動(dòng)化系統(tǒng)(Navitar，Rochester，NY)獲得的。圖20中的結(jié)果表示為細(xì)胞因子產(chǎn)生針對(duì)用于離體刺激的肽濃度的斑點(diǎn)形成集落的頻率(平均值±SEM，n＝3小鼠/組)。另外，對(duì)于IFN-γ和IL-4(任意單位)來(lái)說(shuō)，將平均面積/集落與用于刺激的肽的濃度進(jìn)行作圖。
圖20中的結(jié)果表明，與使用肽本身相比，通過(guò)重組IgG對(duì)APC進(jìn)行離體加載，在形成MHC I類-肽復(fù)合物和產(chǎn)生Tc應(yīng)答方面更有效。另外，在通過(guò)IgG/FcγR進(jìn)行的表位送遞之后僅有的MHC I類-肽復(fù)合物形成，導(dǎo)致了產(chǎn)生IL-4而不是IFN-γ的Tc2細(xì)胞的形成。用選定的合成RNA同時(shí)處理APC，導(dǎo)致了T細(xì)胞譜拓寬到產(chǎn)生IFN-γ的Tc1細(xì)胞。
實(shí)施例32表示用IgG-肽和選定的共刺激基序共同激發(fā)，在病毒感染之后導(dǎo)致了MHC I類-限制的T細(xì)胞的更有效的二次擴(kuò)增。
用重組IgG-NP(Kd)，pA:pU分別或組合注射BALB/c小鼠(50μg/注射)。作為對(duì)照，使用了未接觸過(guò)抗原的小鼠。在處理3周之后，用104TCID50的A/WSN/32H1N1流感病毒，通過(guò)呼吸道感染所述小鼠。感染之后4天，通過(guò)ELISPOT分析測(cè)定脾臟中的T細(xì)胞特征，然后按照以下方法用NP肽進(jìn)行離體刺激在4℃下，將ELISPOT平板(Millipore，Molsheim，F(xiàn)rance)與存在于無(wú)菌PBS(50μl/孔)中的純化的抗-細(xì)胞因子Abs(抗-IL4，4μg/ml，抗-IFNγ，8μg/ml，購(gòu)自BD Pharmingen)一起溫育過(guò)夜。次日，用DMEM培養(yǎng)基洗滌平板2次，并且在37℃下，以200μl/孔的用量，用含有FBS的完全DMEM封閉。用脾制備單細(xì)胞懸浮液，裂解紅細(xì)胞，洗滌細(xì)胞，計(jì)數(shù)，并且以5×105/孔的用量與20μg/ml NP肽或僅僅與培養(yǎng)基一起溫育，以便評(píng)估背景水平。在37℃下，在5％CO2中溫育平板72小時(shí)。3天之后，用PBS-tween20 0.05％(洗滌緩沖液)洗滌平板5次，在4℃下，100μl/孔的用量，用存在于PBS-tween20 0.05％-FBS 0.1％(ELISPOT緩沖液)中的濃度為2μg/ml的生物素化的抗-細(xì)胞因子Abs溫育過(guò)夜。次日，用洗滌緩沖液洗滌平板5次，并且用在ELISPOT緩沖液中以1∶1000的比例稀釋的鏈霉抗生物素-HRP溫育1小時(shí)。用3-氨基-9-乙基咔唑底物(Sigma，St.Luis，MO)對(duì)所述反應(yīng)進(jìn)行顯影，并且通過(guò)用自來(lái)水洗滌所述平板兩次，終止反應(yīng)。然后，讓所述平板在室溫下干燥24小時(shí)。
數(shù)據(jù)是使用裝有ImagePro-Plus軟件(Media Cybernetics，SilverSpring，MD)的自動(dòng)化系統(tǒng)(Navitar，Rochester，NY)獲得的。圖22中的結(jié)果表示為產(chǎn)生NP-特異性MHC I類-限制的T細(xì)胞形成細(xì)胞因子的集落的頻率(平均值±SEM，n＝4小鼠/組)。
圖21中的結(jié)果表明，在共同施用選定的合成RNA時(shí)，IgG介導(dǎo)的I類限制的表位的送遞在激發(fā)I類限制的Tc1應(yīng)答方面最有效。在流感病毒感染之后，所述受激發(fā)的前體迅速擴(kuò)增。
實(shí)施例33表示共同施用選定的RNA基序和插IgG主鏈內(nèi)的肽表位，能最有效激發(fā)識(shí)別MHC I類-限制的表位的細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞。
按照前面的實(shí)施例披露的方法用重組IgG-NP(Kd)免疫和侵襲BALBc小鼠，并且在流感病毒感染之后4天處死。制備脾細(xì)胞，5百萬(wàn)/ml的密度懸浮在HL-1培養(yǎng)基中，并且，在存在5U/ml重組IL-2的條件下，與10μg/ml的NP 147-155肽共同溫育5天。合并來(lái)自4只小鼠/組的脾細(xì)胞，并且在燒瓶中溫育。
在擴(kuò)增之后，通過(guò)Ficoll梯度離心回收活的細(xì)胞，洗滌，并且在有或沒(méi)有NP肽(20μg/ml)的條件下，以各種數(shù)量與固定數(shù)量的sp20靶細(xì)胞一起在V底平板上溫育5小時(shí)。在對(duì)平板進(jìn)行離心之后，收獲上清液，并且通過(guò)使用Promega試劑盒(目錄號(hào)G1780)測(cè)定LDH的濃度。結(jié)果表示為在不同E∶T比例(效應(yīng)物與靶細(xì)胞比例)下的百分特異性裂解。
圖22表示抗-病毒細(xì)胞毒性T細(xì)胞的有效激發(fā)，需要用通過(guò)IgG送遞的I類限制的表位進(jìn)行APC的有效體內(nèi)加載，以及通過(guò)選定的合成RNA基序，即pA:pU進(jìn)行合適的指導(dǎo)。
實(shí)施例34表示用具有病毒MHC I類-限制的表位的IgG，和選定的合成RNA基序接種，提供了對(duì)用原型病毒感染性侵襲的保護(hù)作用。
通過(guò)皮下注射，用50μg的重組IgG-NP(Kd)和50μg的選定的合成RNA(pA:pU)免疫BALB/c小鼠。免疫之后3周，以104TCID50的標(biāo)準(zhǔn)傳染性WSN流感病毒侵襲小鼠，并且在5天之后處死。通過(guò)MDCK血細(xì)胞凝集測(cè)定，按照以下方法在肺勻漿物中滴定肺病毒第一天，以2×104/孔/200μl的密度將MDCK細(xì)胞鋪板到96孔平板上，并且在37℃下，在5％CO2中溫育24小時(shí)。次日，將25μl的肺勻漿物在DMEM培養(yǎng)基中的10倍稀釋液，放置在短時(shí)胰蛋白酶化的MDCK平板上溫育(1分鐘)，重復(fù)3次，并且在37℃下溫育。1小時(shí)之后，添加1751的DMEM完全培養(yǎng)基，并且在37℃下，在5％CO2中溫育平板48小時(shí)。兩天后，采用雞紅細(xì)胞進(jìn)行血細(xì)胞凝集抑制，所述雞紅細(xì)胞在室溫下與來(lái)自MDCK平板的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液一起溫育30分鐘，結(jié)果表示為肺部病毒總數(shù)的平均值±SEM(n＝4小鼠/組)。作為對(duì)照，使用未免疫的小鼠。
圖23的結(jié)果表明，用具有病毒I類限制的表位的重組IgG和選定的合成RNA基序一起免疫，導(dǎo)致了能夠在感染性侵襲之后限制病毒復(fù)制的免疫應(yīng)答的激發(fā)。
實(shí)施例35.圖24表示用于測(cè)定基于Ig-肽的分子效力的腫瘤模型。
業(yè)已將Balb-c小鼠(Kd限制的)用于建立腫瘤模型。腫瘤細(xì)胞(1百萬(wàn)-1千5百萬(wàn)，存在于100μL中)通常注射在脅腹(參見(jiàn)上部照片中的箭頭)。首先，通過(guò)觸診病變部位檢測(cè)原發(fā)腫瘤(即，在注射部位)，然后通過(guò)用卡尺測(cè)定腫瘤尺寸進(jìn)行定量。在一系列的實(shí)驗(yàn)中，將小鼠骨髓瘤細(xì)胞系(SP2/0)，未轉(zhuǎn)染過(guò)的細(xì)胞或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染過(guò)的能表達(dá)異源蛋白(在重鏈的CDR3區(qū)表達(dá)不同表位肽的重組IgG或完整的NP蛋白)的細(xì)胞，用于在所述小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤。異源蛋白在SP2/0細(xì)胞中的表達(dá)，提供了用于在免疫感受態(tài)小鼠體內(nèi)測(cè)定各種抗腫瘤策略的特異性腫瘤相關(guān)的抗原(TAA)。通常，未處理過(guò)的小鼠在注射1周之后產(chǎn)生了可觸知的原發(fā)性實(shí)體瘤，它在隨后的4周時(shí)間導(dǎo)致了病態(tài)和死亡。對(duì)注射過(guò)的小鼠進(jìn)行的身體檢查發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)移病變(參見(jiàn)圖24)。培養(yǎng)來(lái)自原發(fā)腫瘤組織的Sp2/0細(xì)胞，以及從攜帶腫瘤的小鼠體內(nèi)取出的脾(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。用重組IgG-表達(dá)質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SP2/0細(xì)胞，除了導(dǎo)入重鏈的CDR3區(qū)的特殊表位序列，例如，MHCI限制的NP表位(氨基酸147-155)之外，所述質(zhì)粒都是相同的。SP2/0細(xì)胞還可以用含有受CMV啟動(dòng)子控制的編碼WSN病毒的完整NP蛋白的序列的質(zhì)粒穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染。所有轉(zhuǎn)染過(guò)的細(xì)胞系都在與野生型SP2/0細(xì)胞相同的框架上產(chǎn)生了原發(fā)腫瘤。
該腫瘤模型被擴(kuò)展到包括腺癌細(xì)胞系(4T1，ATCC CRL-2539，Kd限制的)，以前業(yè)已證實(shí)其能在Balb-c小鼠中誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移瘤。所述4T-1細(xì)胞系與上文所述SP/0系類似。將1百萬(wàn)-1千5百萬(wàn)4T-1細(xì)胞注射到Balb-c小鼠脅腹，在類似于注射SP2/0細(xì)胞的時(shí)間框架內(nèi)，產(chǎn)生了可觸知的原發(fā)腫瘤，并最終導(dǎo)致死亡。死后從各種器官中收集的組織表明，可以從脾，肺以及原發(fā)腫瘤中回收4T-1(未示出)。按照上述方法，用NP-表達(dá)質(zhì)粒穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染4T-1細(xì)胞。與SP2/0細(xì)胞一樣，4T-1細(xì)胞的轉(zhuǎn)染不會(huì)影響腫瘤的生長(zhǎng)過(guò)程和疾病的致死性。
實(shí)施例36通過(guò)使用重組IgG內(nèi)的腫瘤相關(guān)的T細(xì)胞表位和選定的共刺激RNA基序證實(shí)了在臨床診斷之后，對(duì)腫瘤的成功控制和治療。
用能穩(wěn)定表達(dá)在重鏈(IgNP)的CDR3區(qū)中具有MHC I(Kd)NP表位肽的重組IgG的SP2/0細(xì)胞(1.5千萬(wàn)，存在于100μL體積中)注射Balb/c小鼠。在注射7天之后，所有小鼠都有可觸知的腫瘤，并且將所述小鼠隨機(jī)分成3組共刺激基序(即，由聚pApU組成的dsRNA)自身；純化的IgTAA蛋白(IgNP)；這兩者。處理時(shí)間用箭頭表示，并且每次注射包括50μg標(biāo)明的化合物。發(fā)生轉(zhuǎn)移疾病并且死亡的小鼠在所述附圖中用″D″表示。
所述數(shù)據(jù)表示dsRNA(共刺激基序)和IgTAA(IgNP)的組合在治療開(kāi)始時(shí)具有原發(fā)性腫瘤的所有小鼠體內(nèi)都產(chǎn)生了明顯的保護(hù)反應(yīng)。盡管用單獨(dú)的任意一種化合物處理的小鼠都會(huì)發(fā)病，100％的用兩種化合物處理的小鼠在處理開(kāi)始3周之后仍然活著，并且，在為了測(cè)定T細(xì)胞應(yīng)答而將它們處死時(shí)，它們處于良好的臨床狀況。以上結(jié)果表明，用TAA體內(nèi)加載APC(通過(guò)由APC的Fc受體攝取IgNP而實(shí)現(xiàn))，不足以有效地產(chǎn)生抗-腫瘤應(yīng)答。由采用與pA:pU dsRNA組合的IgNP處理的小鼠表現(xiàn)的腫瘤排斥和存活，突出了共刺激在用腫瘤相關(guān)抗原治療腫瘤方面發(fā)揮的重要作用。
總之，圖25中的結(jié)果表明，用腫瘤相關(guān)的抗原對(duì)APC進(jìn)行有效的體內(nèi)加載，同時(shí)通過(guò)選定的合成RNA基序激活，是有效控制腫瘤生長(zhǎng)和誘導(dǎo)腫瘤排斥所必須的，并且是足夠的。
實(shí)施例37.本實(shí)施例在腫瘤細(xì)胞的亞致死接種情況下，表明對(duì)腫瘤抗原的次最佳應(yīng)答，可以通過(guò)用IgG主鏈內(nèi)的肽表位和共刺激基序進(jìn)行校正。
用能穩(wěn)定表達(dá)在重鏈的CDR3中包括WSN病毒核蛋白的MHC I(Kd)表位(氨基酸147-155)的重組IgG(IgNP)的SP2/0細(xì)胞注射Balb/c小鼠。所述細(xì)胞接種物是每只小鼠1百萬(wàn)細(xì)胞(存在于100μL體積中)。觀察所述小鼠，直到在注射部位檢測(cè)到可觸知的腫瘤。此時(shí)，測(cè)定所述腫瘤，并且不對(duì)其中的8只小鼠進(jìn)行處理，而其余6只每周用純化的IgTAA(即，純化的IgNP，2mg/kg)和dsRNA(pApU，4mg/kg)進(jìn)行腫瘤內(nèi)注射。每周對(duì)所述腫瘤進(jìn)行測(cè)定。
圖26的圖片A表示在8只小鼠中，有6只中誘導(dǎo)的腫瘤進(jìn)展并最終死亡，這些小鼠中的2只完全自發(fā)地排斥了所述腫瘤。圖41的圖片B表示每周3次用IgNP/dsRNA(通過(guò)箭頭表示)治療，在6只小鼠中的4只中刺激了完全腫瘤排斥，并且在另一只中產(chǎn)生了明顯消退。
在圖26的圖片A和B中的結(jié)果表明，腫瘤相關(guān)的抗原對(duì)APC進(jìn)行有效的體內(nèi)加載，并且通過(guò)選定的合成RNA一起激活，可以誘導(dǎo)針對(duì)腫瘤相關(guān)抗原的有效的免疫應(yīng)答。
實(shí)施例38表明用IgG主鏈中的表位和共刺激性合成RNA一起治療攜帶腫瘤的小鼠，導(dǎo)致了腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞的激活狀態(tài)的恢復(fù)。
用1千萬(wàn)表達(dá)NP-Kd表位的sp20轉(zhuǎn)染瘤，注射2只BALB/c小鼠。在形成腫瘤之后，用存在于鹽水中的50μg選定的dsRNA基序(pApU)和50μg″IgNP″-重組IgG-NP(Kd)對(duì)一只小鼠進(jìn)行腫瘤內(nèi)注射。24小時(shí)之后處死所述小鼠，切除腫瘤，用膠原酶消化，通過(guò)70μm的濾膜過(guò)濾，并且在Ficoll梯度上分離活細(xì)胞。用抗TCR，CD25的mAbs或同種型對(duì)照對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，并且通過(guò)FACS分析進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果以柱形圖形式表示，并且標(biāo)明了染色的細(xì)胞的百分比。
材料SP20細(xì)胞系(ATCC)；2只BALB/c小鼠(Harland Sprague Dawley)；Falcon 70微米濾膜(Becton Dickinson，目錄號(hào)352350)；膠原酶(Sigma，目錄號(hào)C-9891)；BSA，級(jí)份V(Sigma，目錄號(hào)A-4503)；膠原酶緩沖液0.225gm BSA+0.00625gm，存在于50ml RPMI中；Ficoll-hypaque(1.077，Amersham，目錄號(hào)17-1440-02)；FACS緩沖液1％胎牛血清+0.1％疊氮化物，存在于PBS中；抗體均購(gòu)自BD Pharmingen；和，流式細(xì)胞計(jì)FACSCalibur(Becton Dickinson)。
方法腫瘤細(xì)胞分離和FACS分析提前6周按照上述方法進(jìn)行腫瘤誘導(dǎo)；從BALB/c小鼠中分離腫瘤；用無(wú)菌剪刀剪碎腫瘤，并且添加10ml膠原酶緩沖液；在37℃下，溫育40分鐘；用3ml的注射器柱塞強(qiáng)制腫瘤通過(guò)70μm Falcon濾膜進(jìn)入50ml試管中，同時(shí)用RPMI洗滌；洗滌1次，并且重新懸浮在4ml熱RPMI緩沖液中；將等體積的細(xì)胞懸浮液鋪放在Ficoll上，在室溫下，以2000RPM的速度離心15分鐘；分離層，并且用HL-1緩沖液洗滌1次，并且以2×106/ml的密度重新懸浮在FACS緩沖液中，并且進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析；將其余的細(xì)胞用于ELISPOT分析；將細(xì)胞以50μl/管的用量放入12×75mm試管，并且用FITC標(biāo)記過(guò)的抗-小鼠抗體染色，2μg/管加上1μl/管小鼠血清·同種型對(duì)照；
·抗-CD40；·抗-CD8；·抗-CD4；·抗-CD25；·抗-TCRγδ；·抗-TCRβ；在冰上溫育30分鐘；和，用FACS緩沖液洗滌1次，并且重新懸浮在300μl FACS緩沖液中。
圖27中的結(jié)果表示，具有T細(xì)胞受體標(biāo)記TCRβ的腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞，在用具有腫瘤相關(guān)表位的重組免疫球蛋白和選定的合成dsRNA基序一起處理時(shí)，獲得了激活標(biāo)記CD25的表達(dá)。
實(shí)施例39表明用IgG主鏈中的肽表位和選定的共刺激分子成功地治療攜帶腫瘤的小鼠與除了Tc2之外還包括Tc1的Tc的特定分化模式相關(guān)。
處死在如實(shí)施例37所述的用具有腫瘤相關(guān)表位的重組Ig和選定的合成dsRNA基序一起處理之后能夠成功地排斥腫瘤的小鼠，并且通過(guò)ELISPOT分析測(cè)定針對(duì)腫瘤相關(guān)表位的T細(xì)胞應(yīng)答。在4℃下，將ELISPOT平板(Millipore，Molsheim，F(xiàn)rance)與存在于無(wú)菌PBS(50μl/孔)中的純化的抗-細(xì)胞因子Abs(抗-IL2和抗-IL4，4μg/ml，抗-IFNγ，8μg/ml，購(gòu)自BD Pharmingen)一起溫育過(guò)夜。次日，用DMEM培養(yǎng)基洗滌平板2次，并且在37℃下，以200μl/孔的含有FBS的完全DMEM進(jìn)行封閉。
用脾制備單細(xì)胞懸浮液，裂解紅細(xì)胞，洗滌細(xì)胞，計(jì)數(shù)，并且以5×105/孔的用量與各種濃度的NP肽一起溫育。在37℃下，在5％CO2中溫育平板72小時(shí)。3天之后，用PBS-tween20 0.05％(洗滌緩沖液)洗滌平板5次，并且在4℃下，以100μl/孔的用量，用存在于PBS-tween20 0.05％-FBS 0.1％(ELISPOT緩沖液)中的濃度為2βg/ml的生物素化的抗-細(xì)胞因子Abs溫育過(guò)夜。次日，用洗滌緩沖液洗滌平板5次，并且用在ELISPOT緩沖液中以1∶1000的比例稀釋的鏈霉抗生物素-HRP溫育1小時(shí)。用3-氨基-9-乙基咔唑底物(Sigma，St.Luis，MO)對(duì)所述反應(yīng)進(jìn)行顯影，并且通過(guò)用自來(lái)水洗滌所述平板兩次，終止反應(yīng)。然后，讓所述平板在室溫下干燥24小時(shí)。
數(shù)據(jù)是使用裝有ImagePro-Plus軟件(Media Cybernetics，SilverSpring，MD)的自動(dòng)化系統(tǒng)(Navitar，Rochester，NY)獲得的。結(jié)果表示為相當(dāng)于IL-4，IL-2和IFN-γ的斑點(diǎn)形成集落的數(shù)量(平均值±SEM)。作為對(duì)照，我們使用了未處理的小鼠，它們不能排斥腫瘤(n＝4/組)。
圖28中的結(jié)果表明，能成功地排斥腫瘤的治療過(guò)的小鼠產(chǎn)生了針對(duì)治療性Ig上的腫瘤相關(guān)表位的Tc1應(yīng)答，以及Tc2免疫。相反，不能排斥腫瘤的小鼠只產(chǎn)生了Tc2免疫。
實(shí)施例40表明在用IgG主鏈中的T細(xì)胞表位和選定的共刺激基序一起治療攜帶腫瘤的小鼠之后，有效的記憶應(yīng)答的誘導(dǎo)。
按照實(shí)施例37所披露的方法，通過(guò)注射具有TAA的重組Ig和選定的合成RNA基序治療攜帶表達(dá)NP-KdTAA的腫瘤的sp2/0小鼠。在腫瘤排斥之后，通過(guò)對(duì)側(cè)地皮下注射表達(dá)NP-Kd表位的1千5百萬(wàn)個(gè)SP2/0細(xì)胞侵襲所述小鼠。同時(shí)，4只對(duì)照的未接觸過(guò)抗原的小鼠同樣注射致瘤的/致死劑量的相同類型的細(xì)胞。監(jiān)測(cè)所述腫瘤的發(fā)展和大小，并且表示為直徑(mm)與從刺激開(kāi)始的時(shí)間。
圖29中的結(jié)果表明通過(guò)所標(biāo)明的治療成功地誘導(dǎo)了腫瘤排斥，然后能有效預(yù)防相同腫瘤的隨后侵襲，表明產(chǎn)生了有效的免疫記憶。
實(shí)施例41表明令人吃驚的是，通過(guò)具有TAA的IgG和共刺激劑誘導(dǎo)的腫瘤排斥，導(dǎo)致了對(duì)多種缺乏TAA的腫瘤變體或具有TAA的變體的交叉保護(hù)作用。
對(duì)實(shí)施例40所述能避免同源侵襲的小鼠，用1千5百萬(wàn)代表缺乏TAA(缺少抗原變體)的相同腫瘤細(xì)胞或具有缺乏NP-Kd表位的TAA變體的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)刺激。另外，作為對(duì)照，用不同類型的腫瘤細(xì)胞系(4T-1腺癌)侵襲小鼠，在圖30A所附的表中示出。在每一種情況下，都包括未接觸過(guò)抗原的對(duì)照。
通過(guò)ELISPOT分析，使用TAA(NP-Kd肽)，HA(MHC II類-限制的肽)，或來(lái)自細(xì)胞裂解液的蛋白提取物刺激的脾細(xì)胞懸浮液，評(píng)估了免受多種腫瘤變體侵襲的小鼠的T細(xì)胞免疫狀態(tài)。在4℃下，將ELISPOT平板(Millipore，Molsheim，F(xiàn)rance)與存在于無(wú)菌PBS(50μl/孔)中的純化的抗-細(xì)胞因子Abs(抗-IL2和抗-IL4，4μg/ml，抗-IFNγ，8μg/ml，購(gòu)自BD Pharmingen)一起溫育過(guò)夜。次日，用DMEM培養(yǎng)基洗滌平板2次，并且在37℃下，以200μl/孔的用量，用含有FBS的完全DMEM封閉。
用脾制備單細(xì)胞懸浮液，裂解紅細(xì)胞，洗滌細(xì)胞，計(jì)數(shù)，并且以5×105/孔的用量與各種濃度的抗原一起溫育。在37℃下，在5％CO2中培養(yǎng)溫育72小時(shí)。3天之后，用PBS-tween20 0.05％(洗滌緩沖液)洗滌平板5次，并且在4℃下，以100μl/孔的用量，用存在于PBS-tween20 0.05％-FBS 0.1％(ELISPOT緩沖液)中的濃度為2βg/ml的生物素化的抗-細(xì)胞因子Abs溫育過(guò)夜。次日，用洗滌緩沖液洗滌平板5次，并且用在ELISPOT緩沖液中1∶1000的比例稀釋的鏈霉抗生物素-HRP溫育1小時(shí)。用3-氨基-9-乙基咔唑底物(Sigma，St.Luis，MO)對(duì)所述反應(yīng)進(jìn)行顯影，并且通過(guò)用自來(lái)水洗滌所述平板兩次，終止反應(yīng)。然后，讓所述平板在室溫下干燥24小時(shí)。
數(shù)據(jù)是使用裝有ImagePro-Plus軟件(Media Cybernetics，SilverSpring，MD)的自動(dòng)化系統(tǒng)(Navitar，Rochester，NY)獲得的。結(jié)果表示為相當(dāng)于IL-4，IL-2和IFN-γ的斑點(diǎn)形成集落的數(shù)量(平均值±SEM)。作為對(duì)照，使用了不能排斥腫瘤的未處理的小鼠(n＝4/組)。作為對(duì)照，包括未接觸過(guò)抗原的小鼠。結(jié)果是以細(xì)胞因子生產(chǎn)細(xì)胞/器官的數(shù)量(平均值±SEM)形式表示的(n＝3/組)。
圖30A-30B(包括圖30A中的表)中的結(jié)果表明，在導(dǎo)致腫瘤排斥的標(biāo)明的治療之后出現(xiàn)的免疫，導(dǎo)致了對(duì)抗原變體的侵襲的避免，并且與細(xì)胞因子生產(chǎn)細(xì)胞的總體擴(kuò)增相關(guān)。這表明通過(guò)推薦的方法，將抗-腫瘤淋巴細(xì)胞的所有組成成分拓寬到不是由免疫治療分子攜帶的腫瘤相關(guān)的抗原。
權(quán)利要求書(shū)(按照條約第19條的修改)1.一種增強(qiáng)受試者中對(duì)抗原的T細(xì)胞應(yīng)答的方法，包括給所述受試者施用由雙鏈RNA組成的組合物。
2.如權(quán)利要求1的方法，還包括與所述抗原共同施用所述組合物。
3.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述抗原是在給所述受試者施用雙鏈RNA之后施用或接觸的。
4.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述雙鏈RNA由聚腺嘌呤和聚尿嘧啶組成。
5.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述雙鏈RNA由聚鳥(niǎo)嘌呤和聚胞嘧啶組成。
6.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述方法能增強(qiáng)對(duì)所述抗原的Th1應(yīng)答。
7.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述方法能增強(qiáng)對(duì)所述抗原的Tc1應(yīng)答。
8.一種防止對(duì)非傳染性抗原的高區(qū)耐受的方法，包括一起施用所述非傳染性抗原和由聚腺嘌呤和聚尿嘧啶或聚肌苷和聚胞嘧啶組成的雙鏈RNA組合物。
9.如權(quán)利要求8的方法，其中，所述方法能防止T細(xì)胞無(wú)反應(yīng)性。
10.如權(quán)利要求8的方法，其中，所述抗原是病毒。
11.如權(quán)利要求8的方法，其中，所述dsRNA是pA:pU。
12.一種用于增強(qiáng)對(duì)抗原的T細(xì)胞應(yīng)答的組合物，包括由聚腺嘌呤和聚尿嘧啶組成的dsRNA序列。
13.如權(quán)利要求12的組合物，其中，所述組合物還包括抗原。
14.如權(quán)利要求12的組合物，其中，所述抗原是在可以藥用的載體中施用的。
15.如權(quán)利要求12的組合物，其中，所述抗原是在免疫球蛋白中施用的。
16.如權(quán)利要求12的組合物，其中，所述可以藥用的是IgG。
17.如權(quán)利要求12的組合物，其中，所述抗原是腫瘤相關(guān)表位。
18.如權(quán)利要求13的組合物，其中，所述抗原是病毒。
19.如權(quán)利要求12的組合物，其中，所述抗原是腫瘤相關(guān)的T細(xì)胞表位。
20.一種用于在受試者中增強(qiáng)對(duì)抗原的T細(xì)胞應(yīng)答的組合物，包括由聚肌苷和聚-半胞嘧啶組成的dsRNA序列。
21.如權(quán)利要求20的組合物，其中，所述組合物還包括抗原。
權(quán)利要求
1.一種增強(qiáng)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法，包括施用由雙鏈RNA組成的組合物。
2.如權(quán)利要求1的方法，還包括與所述抗原共同施用所述組合物。
3.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述雙鏈RNA由聚腺嘌呤和聚尿嘧啶組成。
4.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述雙鏈RNA由聚鳥(niǎo)嘌呤和聚胞嘧啶組成。
5.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述方法能增強(qiáng)Thl和Tcl細(xì)胞應(yīng)答。
6.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述方法能增強(qiáng)B細(xì)胞對(duì)抗原的應(yīng)答。
7.一種防止對(duì)非傳染性抗原的高區(qū)耐受的方法，包括一起施用所述非傳染性抗原和由聚腺嘌呤和聚尿嘧啶或聚肌苷和聚胞嘧啶組成的雙鏈RNA組合物。
8.如權(quán)利要求7的方法，其中，所述方法能預(yù)防B細(xì)胞無(wú)反應(yīng)性。
9.如權(quán)利要求7的方法，其中，所述抗原是病毒。
10.如權(quán)利要求7的方法，其中，所述dsRNA是pApU。
11.一種用于增強(qiáng)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的組合物，包括由聚腺嘌呤和聚尿嘧啶組成的dsRNA序列。
12.如權(quán)利要求11的組合物，其中，所述組合物還包括抗原。
13.如權(quán)利要求11的組合物，其中，所述抗原是在可以藥用的載體中施用的。
14.如權(quán)利要求11的組合物，其中，所述抗原是在免疫球蛋白中施用的。
15.如權(quán)利要求11的組合物，其中，所述可以藥用的是IgG。
16.如權(quán)利要求11的組合物，其中，所述抗原是腫瘤相關(guān)表位。
17.如權(quán)利要求12的組合物，其中，所述抗原是病毒。
18.如權(quán)利要求11的組合物，其中，所述抗原是腫瘤相關(guān)的T細(xì)胞表位。
19.一種用于增強(qiáng)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的組合物，包括由聚肌苷和聚-半胞嘧啶組成的dsRNA序列。
20.如權(quán)利要求19的組合物，其中，所述組合物還包括抗原。
全文摘要
本申請(qǐng)涉及非編碼RNA基序，它在與抗原組合或不與抗原組合的情況下被用于誘導(dǎo)、增強(qiáng)或調(diào)節(jié)包括B細(xì)胞和T細(xì)胞成分的免疫應(yīng)答。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1780848SQ03810917
公開(kāi)日2006年5月31日 申請(qǐng)日期2003年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月15日
發(fā)明者A·I·博特, 王立林, L·德拉瑪麗, D·史密斯, B·菲利普斯 申請(qǐng)人:阿斯特拉爾公司