本公開(kāi)涉及表達(dá)高水平血管生成素-1(Ang1)的干細(xì)胞和其抑制TNF-α和/或IL-6釋放以及治療例如糖尿病等發(fā)炎性疾病的用途。

發(fā)明背景

血管生成素屬于血管生長(zhǎng)因子家族，血管生長(zhǎng)因子在胚胎和出生后血管生成中起作用。Ang1促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞和一些非內(nèi)皮細(xì)胞(例如平滑肌細(xì)胞)的遷移。Ang1還誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞萌發(fā)和重新組織到小管中。Ang1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮有效的消炎作用，遏制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)誘發(fā)的E-選擇素、ICAM-1和VCAM-1上調(diào)，并抑制回應(yīng)于VEGF和TNF-α的白細(xì)胞附著和遷移(Kim等人Circ Res.,89(6),477-479,2001)。

當(dāng)前大部分1型糖尿病患者的療法是基于定期皮下注射短效和長(zhǎng)效胰島素制劑的混合物。施用給與中效和長(zhǎng)效組分與更持續(xù)作用型態(tài)的不同尺寸的可溶性胰島素粒子的懸浮液以實(shí)現(xiàn)激素的恒定基線水平(Heine等人Br Med J(Clin Res編輯)290:204-205,1985)。

此當(dāng)前療法的一個(gè)缺點(diǎn)是遲效制劑一般不產(chǎn)生平穩(wěn)的胰島素背景水平，引起高血糖或者低血糖。高血糖的問(wèn)題在于其可能引起糖尿病患者中進(jìn)一步的并發(fā)癥。舉例來(lái)說(shuō)，慢性高血糖引起嚴(yán)重小血管(視網(wǎng)膜病和腎病)、大血管(中風(fēng)、心肌梗塞)和神經(jīng)病并發(fā)癥。這些破壞性并發(fā)癥可以通過(guò)血糖水平的標(biāo)準(zhǔn)化來(lái)預(yù)防。

近年來(lái)，基于干細(xì)胞的技術(shù)已經(jīng)顯現(xiàn)為一種治療糖尿病的可能方法。然而，除與可能需要終身免疫抑制的根本自體免疫疾病相關(guān)的問(wèn)題外，這些技術(shù)尚有待顯現(xiàn)為一種有前途的治療選擇。

因此，在糖尿病和/或其相關(guān)病狀或癥狀的患者中治療需求仍未滿足，需要新的治療選擇。

本申請(qǐng)中任何文獻(xiàn)的引用或鑒別并非許可此類文獻(xiàn)可作為本公開(kāi)的現(xiàn)有技術(shù)使用。

發(fā)明概要

本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其能夠使用表達(dá)高水平Ang1的未遺傳修飾的干細(xì)胞增加人類受試者中消炎細(xì)胞的產(chǎn)生，不需要用表達(dá)Ang1的核酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)其能夠在人類受試者中降低TNF-α水平、降低IL-6水平和/或增加IL-10水平。這些發(fā)現(xiàn)表明此類表達(dá)升高水平的Ang1的未遺傳修飾的干細(xì)胞適于治療發(fā)炎性病癥，例如糖尿病和其相關(guān)病狀和癥狀。

實(shí)際上，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其能夠使用表達(dá)高水平Ang1的未遺傳修飾的干細(xì)胞在患有糖尿病的人類受試者中降低HbA1c、降低空腹胰島素水平和/或增加脂肪細(xì)胞因子水平，不需要用表達(dá)Ang1的核酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

在其它實(shí)例中，本發(fā)明人還展示其能夠使用表達(dá)高水平Ang1的未遺傳修飾的干細(xì)胞改善人類受試者中類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和糖尿病性腎病的癥狀，不需要用表達(dá)Ang1的核酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

因此，在一個(gè)實(shí)例中，本公開(kāi)提供了一種增加有需要的受試者中消炎細(xì)胞的產(chǎn)生和/或功能的方法，所述方法包括向所述受試者施用包含未遺傳修飾的干細(xì)胞的組合物，其中所述未遺傳修飾的干細(xì)胞表達(dá)至少0.1μg/10⁶個(gè)細(xì)胞的量的血管生成素-1(Ang1)。

在一個(gè)實(shí)例中，消炎細(xì)胞是Th2細(xì)胞、TReg細(xì)胞或M2型巨噬細(xì)胞。

在另一實(shí)例中，所述方法增加受試者中M2型巨噬細(xì)胞的數(shù)目。

在另一實(shí)例中，所述方法增加受試者中M2型巨噬細(xì)胞的數(shù)目至總單核細(xì)胞群體的至少10％。

在另一實(shí)例中，所述方法增加受試者中M2型巨噬細(xì)胞的數(shù)目至總單核細(xì)胞群體的至少20％。

在另一實(shí)例中，所述方法增加受試者中M2型巨噬細(xì)胞的數(shù)目至總單核細(xì)胞群體的至少40％。

在另一實(shí)例中，所述方法增加受試者中M2型巨噬細(xì)胞的數(shù)目至總單核細(xì)胞群體的至少80％。

在另一實(shí)例中，所述方法增加受試者中M2型巨噬細(xì)胞的數(shù)目至總單核細(xì)胞群體的至少90％。

在另一實(shí)例中，M2型巨噬細(xì)胞是CD14+CD16+。

在另一實(shí)例中，M2型巨噬細(xì)胞是CD14+CD16+CD163+。

在另一實(shí)例中，M2型巨噬細(xì)胞是CD14+CD16+CD206+。

在另一實(shí)例中，M2型巨噬細(xì)胞是CD14+CD16+CD163+CD206+。

在另一實(shí)例中，M2型巨噬細(xì)胞是CD14++CD16+。

在另一實(shí)例中，M2型巨噬細(xì)胞是CD14++CD16+CD163+。

在另一實(shí)例中，M2型巨噬細(xì)胞是CD14++CD16+CD206+。

在另一實(shí)例中，M2型巨噬細(xì)胞是CD14++CD16+CD163+CD206+。

在另一實(shí)例中，所述方法促進(jìn)巨噬細(xì)胞從M1極化成M2表型。

在另一實(shí)例中，所述方法促進(jìn)促炎性T輔助細(xì)胞分化成Th2或TReg細(xì)胞。

在一個(gè)實(shí)例中，促炎性T輔助細(xì)胞是Th17細(xì)胞。

在一個(gè)實(shí)例中，增加受試者中消炎細(xì)胞的產(chǎn)生和/或功能引起：

-受試者中IL-6水平降低；

-受試者中TNF-α水平降低；和/或

-受試者中IL-10水平增加。

在一個(gè)實(shí)例中，所述方法增加受試者中消炎細(xì)胞因子的水平。

在一個(gè)實(shí)例中，所述方法增加受試者中IL-10的水平。

在一個(gè)實(shí)例中，所述方法降低受試者中促炎性細(xì)胞因子的水平。

在一個(gè)實(shí)例中，所述方法降低受試者中IL-6、TNF-α和/或IL-17中任一者的水平。

在一個(gè)實(shí)例中，所述方法還抑制促炎性細(xì)胞的產(chǎn)生和/或功能。

在一個(gè)實(shí)例中，促炎性細(xì)胞是Th17細(xì)胞或M1型巨噬細(xì)胞。

在另一實(shí)例中，本公開(kāi)提供了一種方法，其中所述方法抑制M1型巨噬細(xì)胞極化。

在另一實(shí)例中，本公開(kāi)提供了一種方法，其中所述方法促進(jìn)巨噬細(xì)胞從M1極化成M2表型。

在另一實(shí)例中，本公開(kāi)提供了一種方法，其中所述方法抑制M1型巨噬細(xì)胞衍生細(xì)胞因子釋放。

在另一實(shí)例中，本公開(kāi)提供了一種方法，其中所抑制的M1型巨噬細(xì)胞衍生細(xì)胞因子是TNF-α和/或IL-6。

在另一實(shí)例中，本公開(kāi)提供了一種治療發(fā)炎性疾病的方法，所述方法包括向所述受試者施用包含未遺傳修飾的干細(xì)胞的組合物，其中所述未遺傳修飾的干細(xì)胞表達(dá)至少0.1μg/10⁶個(gè)細(xì)胞的量的血管生成素-1(Ang1)。

在另一實(shí)例中，發(fā)炎性疾病是糖尿病或選自由以下組成的組的糖尿病相關(guān)病狀或癥狀：異常傷口愈合、心臟病發(fā)作癥狀、中風(fēng)癥狀、周圍血管疾病癥狀、截肢、腎病癥狀、腎衰竭、失明、神經(jīng)病、腎病、視網(wǎng)膜病、發(fā)炎、性交不能或非酒精性脂肪肝炎(NASH)。

舉例來(lái)說(shuō)，本公開(kāi)提供了一種治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法。

舉例來(lái)說(shuō)，本公開(kāi)提供了一種治療糖尿病性視網(wǎng)膜病的方法。

在另一實(shí)例中，本公開(kāi)的方法包括向所述受試者施用包含未遺傳修飾的干細(xì)胞的組合物，其中所述未遺傳修飾的干細(xì)胞表達(dá)至少0.1μg/10⁶個(gè)細(xì)胞的量的血管生成素-1(Ang1)。在另一實(shí)例中，干細(xì)胞表達(dá)至少0.5μg/10⁶個(gè)細(xì)胞的量的Ang1。在另一實(shí)例中，干細(xì)胞表達(dá)至少0.7μg/10⁶個(gè)細(xì)胞的量的Ang1。在另一實(shí)例中，干細(xì)胞表達(dá)至少1μg/10⁶個(gè)細(xì)胞的量的Ang1。

在另一實(shí)例中，干細(xì)胞表達(dá)少于約0.1μg/10⁶個(gè)細(xì)胞的量的VEGF。在另一實(shí)例中，干細(xì)胞表達(dá)少于約0.05μg/10⁶個(gè)細(xì)胞的量的VEGF。在另一實(shí)例中，干細(xì)胞表達(dá)少于約0.04μg/10⁶個(gè)細(xì)胞的量的VEGF。在另一實(shí)例中，干細(xì)胞表達(dá)少于約0.03μg/10⁶個(gè)細(xì)胞的量的VEGF。在另一實(shí)例中，干細(xì)胞表達(dá)少于約0.02μg/10⁶個(gè)細(xì)胞的量的VEGF。在另一實(shí)例中，干細(xì)胞表達(dá)少于約0.01μg/10⁶個(gè)細(xì)胞的量的VEGF。

在另一實(shí)例中，干細(xì)胞表達(dá)至少約2:1比率的Ang1:VEGF。在另一實(shí)例中，干細(xì)胞表達(dá)至少約10:1比率的Ang1:VEGF。在另一實(shí)例中，干細(xì)胞表達(dá)至少約20:1比率的Ang1:VEGF。在另一實(shí)例中，干細(xì)胞表達(dá)至少約30:1比率的Ang1:VEGF。在另一實(shí)例中，干細(xì)胞表達(dá)至少約50:1比率的Ang1:VEGF。

在另一實(shí)例中，干細(xì)胞為間質(zhì)干細(xì)胞。在另一實(shí)例中，干細(xì)胞為間質(zhì)前驅(qū)細(xì)胞。在另一實(shí)例中，干細(xì)胞是誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)。

在另一實(shí)例中，組合物進(jìn)一步包含可接受的藥物載劑。

在另一實(shí)例中，通過(guò)根據(jù)下述體外方法培養(yǎng)未遺傳修飾的干細(xì)胞，產(chǎn)生組合物。

在一個(gè)實(shí)例中，干細(xì)胞可以從任何哺乳動(dòng)物獲得。舉例來(lái)說(shuō)，干細(xì)胞可以來(lái)源于靈長(zhǎng)類動(dòng)物、奶牛、綿羊、馬、犬、貓或山羊。在另一實(shí)例中，干細(xì)胞為人類干細(xì)胞。

在另一實(shí)例中，發(fā)炎性疾病是II型糖尿病。

在一個(gè)實(shí)例中，治療II型糖尿病的方法可包括向受試者施用每公斤約0.1×10⁶至約3×10⁶個(gè)干細(xì)胞。

在一個(gè)實(shí)例中，治療II型糖尿病的方法可包括向受試者施用每公斤約0.3×10⁶至約2×10⁶個(gè)干細(xì)胞。

在一個(gè)實(shí)例中，治療II型糖尿病的方法可包括向受試者施用每公斤約1×10⁶至約2×10⁶個(gè)干細(xì)胞。

在一個(gè)實(shí)例中，治療II型糖尿病的方法可包括向受試者施用每公斤約2×10⁶個(gè)干細(xì)胞。

在一個(gè)實(shí)例中，以下任一者指示所述受試者中糖尿病或糖尿病相關(guān)病狀或癥狀已得到治療：

-HbA1c值(總血紅蛋白％)減少；

-空腹胰島素水平降低；

-IL-6水平降低；

-TNF-α水平降低；和/或

-脂肪細(xì)胞因子水平增加。

在一個(gè)實(shí)例中，受試者具有II型糖尿病，其中受試者的葡萄糖水平的控制不足。

在一個(gè)實(shí)例中，二甲雙胍(metformin)對(duì)受試者的葡萄糖水平的控制不足。

在一個(gè)實(shí)例中，受試者具有超過(guò)7.5％的基線HbA1c值。

在一個(gè)實(shí)例中，受試者具有大于或等于8％的基線HbA1c值。

在一個(gè)實(shí)例中，發(fā)炎性疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。

在一個(gè)實(shí)例中，治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法可包括向受試者施用每公斤約0.5×10⁶至約3.0×10⁶個(gè)干細(xì)胞。

在一個(gè)實(shí)例中，治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法可包括向受試者施用每公斤約1.0×10⁶至約2.0×10⁶個(gè)干細(xì)胞。

在一個(gè)實(shí)例中，以下任一者指示類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎已得到治療：

-ACR20；

-ACR50；

-ACR70；

-IL-6水平降低；和/或

-疾病活性評(píng)分降低。

在另一實(shí)例中，發(fā)炎性疾病是糖尿病性神經(jīng)病。

在一個(gè)實(shí)例中，治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法可包括向受試者施用約1.0×10⁸至約4.0×10⁸個(gè)干細(xì)胞。

在一個(gè)實(shí)例中，治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法可包括向受試者施用約1.5×10⁸至約3.0×10⁸個(gè)干細(xì)胞。

在一個(gè)實(shí)例中，以下任一者指示糖尿病性腎病已得到治療：

-抑制eGFR和/或mGFR下降；

-改善eGFR和/或mGFR；和/或

-IL-6水平降低。

在一個(gè)實(shí)例中，受試者基線eGFR超過(guò)約35ml/min/1.73m²。

在一個(gè)實(shí)例中，受試者基線eGFR超過(guò)30ml/min/1.73m²。

在一個(gè)實(shí)例中，受試者基線eGFR超過(guò)28ml/min/1.73m²。

在一個(gè)實(shí)例中，受試者基線eGFR超過(guò)25ml/min/1.73m²。

在一個(gè)實(shí)例中，干細(xì)胞全身施用。

在一個(gè)實(shí)例中，干細(xì)胞靜脈內(nèi)施用。

在另一實(shí)例中，本公開(kāi)涉及包含未遺傳修飾的干細(xì)胞的組合物的用途，其中所述未遺傳修飾的干細(xì)胞表達(dá)升高水平的血管生成素-1(Ang1)，所述組合物用于制造供治療發(fā)炎性疾病用的藥物。

在另一實(shí)例中，本公開(kāi)涉及一種包含未遺傳修飾的干細(xì)胞的組合物，其中所述未遺傳修飾的干細(xì)胞表達(dá)升高水平的血管生成素-1(Ang1)，所述組合物用于治療發(fā)炎性疾病。

在另一實(shí)例中，本公開(kāi)涉及一種包含未遺傳修飾的干細(xì)胞的組合物，其中當(dāng)用于治療發(fā)炎性疾病時(shí)所述未遺傳修飾的干細(xì)胞表達(dá)升高水平的血管生成素-1(Ang1)。

圖示簡(jiǎn)單說(shuō)明

圖1：使用當(dāng)前(方法A)和重新調(diào)配的培養(yǎng)基(方法B)的MPC生長(zhǎng)。Y軸指示細(xì)胞數(shù)；X軸為時(shí)間，以天為單位。對(duì)照培養(yǎng)基為用于方法A的培養(yǎng)基，且重新調(diào)配的培養(yǎng)基為用于方法B的培養(yǎng)基。

圖2：在當(dāng)前(方法A)和重新調(diào)配的培養(yǎng)基(方法B)中的MPC倍增時(shí)間。MPC在當(dāng)前αMEM培養(yǎng)物中生長(zhǎng)(方法A)或在改良的αMEM中重新調(diào)配(方法B)。細(xì)胞從P3傳代到P5。

圖3：MPC群體倍增時(shí)間(PDL)。MPC在當(dāng)前αMEM培養(yǎng)基(方法A)對(duì)比重新調(diào)配的αMEM(方法B)中從P3生長(zhǎng)至P5。在當(dāng)前(方法A)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的MPC進(jìn)行8個(gè)PDL，且在重新調(diào)配的培養(yǎng)基(方法B)中生長(zhǎng)的MPC進(jìn)行7.33個(gè)PDL。

圖4：CD14+免疫選擇的單核細(xì)胞與MPC共培養(yǎng)產(chǎn)生展現(xiàn)M2巨噬細(xì)胞的表型特性的CD14+16+巨噬細(xì)胞。

圖5：與MPC共培養(yǎng)預(yù)防巨噬細(xì)胞在發(fā)炎驅(qū)動(dòng)下(LPS)分泌TNFα。

圖6：通過(guò)與MPC在LPS存在下共培養(yǎng)，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生消炎細(xì)胞因子IL-10。

圖7：MPC在調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化中的作用。

圖8：分泌PGE2：IL-1β和TNFα的累加效應(yīng)。

圖9：施用MPC后促炎性和消炎細(xì)胞因子的水平的變化。

圖10：在建立疾病后期(第42天)時(shí)施用MPC引起關(guān)節(jié)中發(fā)炎細(xì)胞因子的水平降低。

圖11：組1-3的MPC給藥

圖12：第12周脂肪細(xì)胞因子水平(自基線的變化)。

圖13：第12周TNF-α水平(自基線的變化)。

圖14：第12周IL-6水平(自基線的變化)。

圖15：基線HbA1c<8％或≥8％的子群的HbA1c改變

圖16：第12周處于目標(biāo)HbA1c(<7.0％)下的受試者

圖17：隨著時(shí)間推移的中位IL-6改變

圖18：生物制劑難治性RA的ACR 20反應(yīng)：1M MPC/kg

圖19：生物制劑難治性RA的ACR 50反應(yīng)：1M MPC/kg

圖20：生物制劑難治性RA的ACR 70反應(yīng)：1M MPC/kg

圖21：隨著時(shí)間推移組分的ACR反應(yīng)；以周計(jì)，觸痛(TJC；左)和腫脹(SJC；右)關(guān)節(jié)數(shù)

圖22：隨著時(shí)間推移組分的ACR反應(yīng)；以周計(jì)，受試者疾病活性總評(píng)估(SGADA)(左)；以周計(jì)，研究者疾病活性總評(píng)估(IGADA)(右)。

圖23：第12周DASCRP反應(yīng)者分析。

圖24：健康評(píng)估問(wèn)卷疾病指數(shù)(HAQ-DI)：到達(dá)MCID的比例(-0.22)

圖25：第12周mGFR[⁹⁹Tc DTPA]和eGFR[MDRD]，自基線的變化(ml/min/1.73m²)。

圖26：第12周IL-6自基線的中位變化

圖27：MPC治療的患者中基線IL-6與第12周血清肌酸酐提高相關(guān)。

圖28：在基線eGFR>30ml/min/1.73m²的mGFR和eGFR受試者中第12周自基線的變化。

發(fā)明詳述

通用技術(shù)和定義

本說(shuō)明書(shū)通篇中，除非以其它方式特別陳述或上下文另外要求，否則對(duì)單個(gè)步驟、目標(biāo)組合物、步驟組或目標(biāo)組合物組的提及應(yīng)涵蓋那些步驟、目標(biāo)組合物、步驟組或目標(biāo)組合物組的一個(gè)和多個(gè)(即一個(gè)或多個(gè))。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解本文中描述的公開(kāi)內(nèi)容可以進(jìn)行除特別描述內(nèi)容以外的變化和修改。應(yīng)了解本公開(kāi)包括所有這類變化和修改。本公開(kāi)還包括所有在本說(shuō)明書(shū)中個(gè)別或共同提及或指示的步驟、特征、組合物和化合物，以及所述步驟或特征的任何和所有組合或任兩個(gè)或超過(guò)兩個(gè)所述步驟或特征。

本公開(kāi)在范圍上不受本文所述的特定實(shí)施方案限制，這些實(shí)施方案僅僅是為了例示而已。功能同等的產(chǎn)物、組合物和方法清楚地在如本文中描述的公開(kāi)內(nèi)容的范圍內(nèi)。

除非另外特別陳述，否則本文公開(kāi)的任何實(shí)例作必要修改后應(yīng)適用于任何其它實(shí)例。

除非另外特別定義，否則本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)名詞都應(yīng)具有與本領(lǐng)域(例如細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、干細(xì)胞分化、免疫學(xué)、免疫組織化學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)和生物化學(xué)中)技術(shù)人員通常所了解相同的含義。

除非另外指明，否則本公開(kāi)中利用的干細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)和免疫技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)程序。此類技術(shù)在例如以下等來(lái)源中文獻(xiàn)通篇中加以描述和解釋：J.Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning,John Wiley and Sons(1984),J.Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989)；T.A.Brown(編輯),Essential Molecular Biology:A Practical Approach,第1和2卷,IRL Press(1991),D.M.Glover和B.D.Hames(編輯)；以及F.M.Ausubel等人(編輯),Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988，包括所有更新，直至現(xiàn)在)；Ed Harlow和David Lane(編輯)Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory,(1988)；以及J.E.Coligan等人(編輯)Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons(包括所有更新，直至現(xiàn)在)。

應(yīng)了解術(shù)語(yǔ)“和/或”，例如“X和/或Y”意指“X和Y”或“X或Y”，且應(yīng)清楚證明兩種含義或者任一含義。

如本文所用，除非相反陳述，否則術(shù)語(yǔ)“約”是指指定值+/-10％，更優(yōu)選地+/-5％。

體積百分比(v/v％)定義[(溶質(zhì)體積)/(溶液體積)]×100％。體積百分比是相對(duì)于溶液體積。舉例來(lái)說(shuō)，補(bǔ)充5％v/v FCS的細(xì)胞培養(yǎng)基意指每100ml細(xì)胞培養(yǎng)基存在約5ml FCS。

本說(shuō)明書(shū)通篇中，應(yīng)了解詞語(yǔ)“包含(comprise)”或例如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”意味包括所述要素、整數(shù)或步驟，或者要素、整數(shù)或步驟組，但不排除任何其它要素、整數(shù)或步驟，或要素、整數(shù)或步驟組。

干細(xì)胞

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“干細(xì)胞”是指能夠產(chǎn)生表型和基因型一致的子代以及至少一種其它最終細(xì)胞類型(例如終末分化的細(xì)胞)的自我更新細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“干細(xì)胞”包括全能細(xì)胞、多能細(xì)胞和多潛能細(xì)胞以及來(lái)源于其分化的祖細(xì)胞和/或前驅(qū)細(xì)胞。干細(xì)胞可以是成年或胚胎干細(xì)胞。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“全能細(xì)胞(totipotent cell)”或“全能細(xì)胞(totipotential cell)”是指能夠形成完整胚胎的細(xì)胞(例如胚泡)。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“多能細(xì)胞(pluripotent cell)”或“多能細(xì)胞(pluripotential cell)”是指具有完整的分化多樣性，即能夠生長(zhǎng)成哺乳動(dòng)物身體大約260種細(xì)胞類型任一者的細(xì)胞。多能細(xì)胞可以自我更新，且可保持在組織內(nèi)休眠或靜止。

“多潛能細(xì)胞(multipotential cell)”或“多潛能細(xì)胞(multipotent cell)”意指能夠產(chǎn)生若干成熟細(xì)胞類型任一者的細(xì)胞。如本文所用，此短語(yǔ)涵蓋成年祖細(xì)胞和這些細(xì)胞的多潛能子代。不同于多能細(xì)胞，多潛能細(xì)胞不能夠形成所有細(xì)胞類型。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“間質(zhì)譜系前驅(qū)細(xì)胞或干細(xì)胞”是指可以分化成間質(zhì)細(xì)胞類型的細(xì)胞。舉例來(lái)說(shuō)，間質(zhì)譜系前驅(qū)細(xì)胞和間質(zhì)前驅(qū)細(xì)胞可以分化成骨骼、軟骨、肌肉和脂肪細(xì)胞以及纖維結(jié)締組織。

在一個(gè)實(shí)例中，表達(dá)升高水平Ang1的干細(xì)胞是STRO-1+間質(zhì)前驅(qū)細(xì)胞。

STRO-1+多潛能細(xì)胞是在骨髓、血液、牙髓、脂肪組織、皮膚、脾、胰腺、腦、腎、肝、心臟、視網(wǎng)膜、腦、毛囊、腸、肺、淋巴結(jié)、胸腺、骨骼、韌帶、腱、骨骼肌、真皮和骨膜中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞。因此，STRO-1+多潛能細(xì)胞能夠分化成大量細(xì)胞類型，包括(但不限于)脂肪、骨、軟骨、彈性和纖維結(jié)締組織。這些細(xì)胞進(jìn)入的特定譜系定型和分化途徑取決于來(lái)自機(jī)械影響的多種影響和/或內(nèi)源性生物活性因子，例如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和/或宿主組織建立的局部微環(huán)境條件。在一個(gè)實(shí)施方案中，STRO-1+多潛能細(xì)胞是非造血祖細(xì)胞，其分裂產(chǎn)生子細(xì)胞，這些子細(xì)胞是干細(xì)胞或者是將按期不可逆地分化產(chǎn)生表型細(xì)胞的前驅(qū)細(xì)胞。

在一個(gè)實(shí)例中，STRO-1+細(xì)胞從獲自受試者(例如有待治療的受試者或相關(guān)受試者或無(wú)關(guān)受試者(無(wú)論是相同物種還是不同)的樣品富集。術(shù)語(yǔ)“富集(enriched)”、“富集(enrichment)”或其變化形式在本文中用以描述當(dāng)與未處理的細(xì)胞群體(例如天然環(huán)境中的細(xì)胞)比較時(shí)，一種特定細(xì)胞類型的比例或大量特定細(xì)胞類型的比例增加的細(xì)胞群體。在一個(gè)實(shí)例中，STRO-1+細(xì)胞富集的群體包含至少約0.1％或0.5％或1％或2％或5％或10％或15％或20％或25％或30％或50％或75％或85％或95％或99％STRO-1+細(xì)胞。關(guān)于此，術(shù)語(yǔ)“STRO-1+細(xì)胞富集的細(xì)胞群體”將清楚地證明術(shù)語(yǔ)“包含X％STRO-1+細(xì)胞的細(xì)胞群體”，其中X％是如本文中敘述的百分比。在一些實(shí)例中，STRO-1+細(xì)胞可以形成克隆源性群落，例如CFU-F(成纖維細(xì)胞)或其子集(例如50％或60％或70％或80％或90％或95％)可以具有此活性。

在一個(gè)實(shí)例中，表達(dá)升高水平Ang1的干細(xì)胞從包含STRO-1+細(xì)胞的細(xì)胞制劑以可選擇形式富集。關(guān)于此，應(yīng)了解術(shù)語(yǔ)“可選擇形式”意指細(xì)胞表達(dá)標(biāo)記物(例如細(xì)胞表面標(biāo)記物)，從而允許選擇STRO-1+細(xì)胞。標(biāo)記物可以是STRO-1，但無(wú)須是STRO-1。舉例來(lái)說(shuō)，如本文中描述和/或例示，表達(dá)STRO-2和/或STRO-3(TNAP)和/或STRO-4和/或VCAM-1和/或CD146和/或3G5的細(xì)胞(例如MPC)還表達(dá)STRO-1(且可以是STRO-1^亮)。因此，指示細(xì)胞是STRO-1+并不意指通過(guò)STRO-1表達(dá)選擇細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)例中，基于至少STRO-3表達(dá)，例如其是STRO-3+(TNAP+)，來(lái)選擇細(xì)胞。在另一實(shí)例中，基于至少STRO-4表達(dá)，例如其是STRO-4+，來(lái)選擇細(xì)胞。

提及細(xì)胞或其群體的選擇不一定要求從特定的組織來(lái)源選擇。如本文所述，STRO-1+細(xì)胞可以從各種來(lái)源選擇或分離或富集。也就是說(shuō)，在一些實(shí)例中，這些術(shù)語(yǔ)支持從包含STRO-1+細(xì)胞的任何組織(例如MPC)或血管化組織或包含外膜細(xì)胞(例如STRO-1+外膜細(xì)胞)的組織或本文中敘述的任一種或多種組織選擇。

在一個(gè)實(shí)例中，表達(dá)升高水平Ang1的干細(xì)胞表達(dá)一種或多種個(gè)別或共同選自由以下組成的組的標(biāo)記物：STRO-1+、TNAP+、VCAM-1+、THY-1+、STRO-2+、STRO-4+(HSP-90β)、CD45+、CD146+、3G5+、CC9或其任何組合。

“個(gè)別”意指本公開(kāi)分別涵蓋敘述的標(biāo)記物或標(biāo)記物組，且盡管個(gè)別標(biāo)記物或標(biāo)記物組可能在本文中未分別列出，但隨附權(quán)利要求書(shū)可分別且彼此區(qū)別地定義此類標(biāo)記物或標(biāo)記物組。

“共同”意指本公開(kāi)涵蓋任何數(shù)目的敘述的標(biāo)記物或肽組或其組合，且盡管此類數(shù)目的標(biāo)記物或標(biāo)記物組或其組合可能在本文中未特別列出，但隨附權(quán)利要求書(shū)可分別且與標(biāo)記物或標(biāo)記物組的任何其它組合相區(qū)別地定義此類組合或亞組合。

在一個(gè)實(shí)例中，STRO-1+細(xì)胞是STRO-1^亮(同義詞STRO-1^bri)。在一個(gè)實(shí)例中，STRO-1^bri細(xì)胞相對(duì)于STRO-1^暗或STRO-1^中間細(xì)胞優(yōu)先富集。

在一個(gè)實(shí)例中，STRO-1^亮細(xì)胞另外是TNAP+、VCAM-1+、THY-1+、STRO-2+、STRO-4+(HSP-90β)和/或CD146+中的一個(gè)或多個(gè)。舉例來(lái)說(shuō)，針對(duì)上述標(biāo)記物的一個(gè)或多個(gè)，選擇細(xì)胞，和/或選擇展示表達(dá)上述標(biāo)記物中的一個(gè)或多個(gè)的細(xì)胞。關(guān)于此，展示表達(dá)標(biāo)記物的細(xì)胞無(wú)須特別測(cè)試，而是可以測(cè)試以前富集或分離的細(xì)胞，且隨后使用、分離或富集的細(xì)胞可以合理地假設(shè)成也表達(dá)相同的標(biāo)記物。

在一個(gè)實(shí)例中，STRO-1^亮通過(guò)免疫選擇來(lái)分離。在一個(gè)實(shí)例中，STRO-1^亮細(xì)胞通過(guò)表達(dá)TNAP的細(xì)胞的免疫選擇來(lái)分離。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“TNAP”意圖涵蓋組織非特異性堿性磷酸酶的所有同功異型物。舉例來(lái)說(shuō)，該術(shù)語(yǔ)涵蓋肝同功異型物(LAP)、骨骼同功異型物(BAP)和腎同功異型物(KAP)。在一個(gè)實(shí)例中，TNAP是BAP。在一個(gè)實(shí)例中，如本文所用，TNAP是指可以結(jié)合由融合瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的STRO-3抗體的分子，STRO-3抗體依據(jù)布達(dá)佩斯條約(the Budapest Treaty)的條款以寄存編號(hào)PTA-7282于2005年12月19日寄存在ATCC。

在一個(gè)實(shí)例中，間質(zhì)前驅(qū)細(xì)胞或干細(xì)胞是CD29+、CD54+、CD73+、CD90+、CD102+、CD105+、CD106+、CD166+、MHC1+間質(zhì)干細(xì)胞(例如remestemcel-L)。

在一個(gè)實(shí)例中，間質(zhì)前驅(qū)細(xì)胞是如WO 2004/85630中定義的血管周間質(zhì)前驅(qū)細(xì)胞。舉例來(lái)說(shuō)，間質(zhì)前驅(qū)細(xì)胞表達(dá)血管周細(xì)胞的標(biāo)記物，例如細(xì)胞是STRO-1+或STRO-1^亮和/或3G5+。在一個(gè)實(shí)例中，細(xì)胞是或以前是從血管化組織或器官或其部分分離的細(xì)胞或其子代。

稱為對(duì)既定標(biāo)記物呈“陽(yáng)性”的細(xì)胞可以表達(dá)低(lo或暗)或高(亮、bri)水平的該標(biāo)記物，取決于細(xì)胞表面上標(biāo)記物存在的程度，其中所述術(shù)語(yǔ)涉及熒光強(qiáng)度或者用于細(xì)胞分類過(guò)程中的其它標(biāo)記物。在所分類的特定細(xì)胞群體上使用的標(biāo)記物的上下文中將了解lo(或暗或暗淡)與bri的區(qū)別。稱為對(duì)既定標(biāo)記物呈“陰性”的細(xì)胞不一定完全缺乏該細(xì)胞。此術(shù)語(yǔ)意指該細(xì)胞表達(dá)相對(duì)極低水平的所述標(biāo)記物，且當(dāng)可檢測(cè)地標(biāo)記或超過(guò)背景水平，例如使用同型對(duì)照抗體檢測(cè)的水平而不可檢測(cè)時(shí)，其產(chǎn)生極低信號(hào)。

當(dāng)本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“亮”是指細(xì)胞表面上在可檢測(cè)地標(biāo)記時(shí)產(chǎn)生相對(duì)高信號(hào)的標(biāo)記物。雖然不希望受理論限制，但提出“亮”細(xì)胞表達(dá)的目標(biāo)標(biāo)記物蛋白質(zhì)(例如由STRO-1識(shí)別的抗原)比樣品中其它細(xì)胞多。舉例來(lái)說(shuō)，當(dāng)用FITC結(jié)合的STRO-1抗體標(biāo)記時(shí)，如熒光活化細(xì)胞分類(FACS)分析所測(cè)定，STRO-1^bri細(xì)胞產(chǎn)生的熒光信號(hào)比非亮細(xì)胞(STRO-1^暗淡/暗)大。在一個(gè)實(shí)例中，“亮”細(xì)胞構(gòu)成起始樣品中所含的最亮標(biāo)記的骨髓單核細(xì)胞的至少約0.1％。在其它實(shí)例中，“亮”細(xì)胞構(gòu)成起始樣品中所含的最亮標(biāo)記的骨髓單核細(xì)胞的至少約0.1％、至少約0.5％、至少約1％、至少約1.5％或至少約2％。在一個(gè)實(shí)例中，STRO-1^亮細(xì)胞相對(duì)于“背景”，即STRO-1-細(xì)胞，具有2log量值更高的STRO-1表面表達(dá)。比較起來(lái)，STRO-1^暗淡和/或STRO-1^中間細(xì)胞相對(duì)于“背景”具有少于2log量值更高的STRO-1表面表達(dá)，通常約1log或更少。

在一個(gè)實(shí)例中，顯著比例的STRO-1+多潛能細(xì)胞能夠分化成至少兩種不同的生殖系。多潛能細(xì)胞可以定型的譜系的非限制性實(shí)例包括骨骼前驅(qū)細(xì)胞；對(duì)膽管上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞是多潛能的肝細(xì)胞祖細(xì)胞；神經(jīng)限制細(xì)胞，其可以產(chǎn)生進(jìn)展成少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和星形細(xì)胞的膠質(zhì)細(xì)胞前驅(qū)物；進(jìn)展成神經(jīng)元的神經(jīng)元前驅(qū)物；心肌和心肌細(xì)胞的前驅(qū)物，葡萄糖反應(yīng)性分泌胰島素的胰腺β-細(xì)胞系。其它譜系包括(但不限于)成牙質(zhì)細(xì)胞、產(chǎn)生牙質(zhì)的細(xì)胞和軟骨細(xì)胞以及以下前驅(qū)細(xì)胞：視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、例如角化細(xì)胞等皮膚細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、毛囊細(xì)胞、輸尿管上皮細(xì)胞、平滑肌和骨骼肌細(xì)胞、睪丸祖細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、腱、韌帶、軟骨、脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、骨髓基質(zhì)、心肌、平滑肌、骨骼肌、外膜細(xì)胞、血管細(xì)胞、上皮細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、星形細(xì)胞和少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。

在另一實(shí)例中，STRO-1+細(xì)胞不能在培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生造血細(xì)胞。

在一個(gè)實(shí)例中，目前描述的干細(xì)胞是間質(zhì)干細(xì)胞。間質(zhì)干細(xì)胞(MSC)可以是均質(zhì)組合物或可以是MSC富集的混合細(xì)胞群體。均質(zhì)間質(zhì)干細(xì)胞組合物可以通過(guò)培養(yǎng)附著骨髓或骨膜細(xì)胞來(lái)獲得，且間質(zhì)干細(xì)胞可以通過(guò)用獨(dú)特的單克隆抗體鑒別的特定細(xì)胞表面標(biāo)記物來(lái)鑒別。用于獲得間質(zhì)干細(xì)胞富集的細(xì)胞群體的方法描述于例如美國(guó)專利No 5,486,359中。間質(zhì)干細(xì)胞的替代來(lái)源包括(但不限于)血液、皮膚、臍帶血、肌肉、脂肪、骨骼和軟骨膜。

可以通過(guò)大量不同的方法實(shí)現(xiàn)攜帶上述細(xì)胞表面標(biāo)記物的干細(xì)胞的識(shí)別、選擇和純化。舉例來(lái)說(shuō)，結(jié)合劑施加于相關(guān)標(biāo)記物，接著分離展現(xiàn)結(jié)合，高水平結(jié)合或低水平結(jié)合或無(wú)結(jié)合的那些細(xì)胞。

舉例來(lái)說(shuō)，結(jié)合劑可以包括抗體，例如單克隆抗體或基于抗體的分子。

抗體和其它結(jié)合分子可以用于多種技術(shù)中，以選擇和純化表達(dá)特定細(xì)胞表面標(biāo)記物的干細(xì)胞。

用于選擇和純化的技術(shù)可包括(但不限于)使用抗體涂布的磁珠進(jìn)行磁力分離、親和層析法和用附接于固體基質(zhì)的抗體“淘洗”、熒光活化細(xì)胞分類(FACS)。

表達(dá)特定標(biāo)記物的表達(dá)升高水平Ang1的干細(xì)胞可以經(jīng)由陽(yáng)性免疫選擇從細(xì)胞群體選擇或純化。舉例來(lái)說(shuō)，間質(zhì)前驅(qū)細(xì)胞可以基于STRO-1抗體的細(xì)胞表面表達(dá)，從細(xì)胞群體分離和富集(參見(jiàn)例如Gronthos和Simmons 1995)。

根據(jù)本公開(kāi)的分離的干細(xì)胞可以通過(guò)培養(yǎng)而體外擴(kuò)增。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解，干細(xì)胞可以低溫保存，解凍，并隨后通過(guò)培養(yǎng)而體外擴(kuò)增。在一個(gè)實(shí)例中，將干細(xì)胞接種在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，并使其附著培養(yǎng)容器，在37℃、20％O₂下過(guò)夜。隨后替換生長(zhǎng)培養(yǎng)基并將細(xì)胞在37℃、5％O₂下再培養(yǎng)68至72小時(shí)。

在一個(gè)實(shí)例中，將分離的干細(xì)胞以50,000個(gè)細(xì)胞/平方厘米接種在補(bǔ)充血清的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，并使其附著培養(yǎng)容器，在37℃、20％O₂下過(guò)夜。隨后用補(bǔ)充有0.5％牛血清白蛋白(BSA)的軟骨形成基礎(chǔ)培養(yǎng)基(CBM；Lonza,Walkersville,MD)替換生長(zhǎng)培養(yǎng)基并將細(xì)胞在37℃、5％O₂下再培養(yǎng)68至72小時(shí)。

本領(lǐng)域中已知初級(jí)干細(xì)胞培養(yǎng)的多種其它方法。舉例來(lái)說(shuō)，可以使用Gronthos和Simmons 1995中描述的方法進(jìn)行初級(jí)干細(xì)胞培養(yǎng)。

培養(yǎng)的干細(xì)胞表型上不同于體內(nèi)細(xì)胞。其可以表達(dá)例如CD44。

在一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)的干細(xì)胞在生物學(xué)上不同于體內(nèi)細(xì)胞，具有較高的再生速率。

培養(yǎng)的干細(xì)胞可以在施用于受試者前低溫保存。舉例來(lái)說(shuō)，表達(dá)升高水平Ang1的干細(xì)胞可以在施用于受試者前低溫保存。

未遺傳修飾的細(xì)胞

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“未遺傳修飾”是指沒(méi)有通過(guò)用表達(dá)或編碼Ang1的核酸轉(zhuǎn)染而修飾的細(xì)胞。為了避免引起懷疑，在本公開(kāi)的上下文中，用編碼Ang1的核酸轉(zhuǎn)染的干細(xì)胞將視為經(jīng)遺傳修飾。在本公開(kāi)的上下文中，“未遺傳修飾”的細(xì)胞在某種程度上天然地表達(dá)Ang1。

Ang1和/或VEGF的表達(dá)

表達(dá)升高水平Ang1的干細(xì)胞未經(jīng)遺傳修飾并表達(dá)至少0.1μg/10⁶個(gè)細(xì)胞的量的Ang1。然而，在不同的實(shí)施方案中，設(shè)想表達(dá)升高水平Ang1的干細(xì)胞可以表達(dá)至少0.2μg/10⁶個(gè)細(xì)胞、0.3μg/10⁶個(gè)細(xì)胞、0.4μg/10⁶個(gè)細(xì)胞、0.5μg/10⁶個(gè)細(xì)胞、0.6μg/10⁶個(gè)細(xì)胞、0.7μg/10⁶個(gè)細(xì)胞、0.8μg/10⁶個(gè)細(xì)胞、0.9μg/10⁶個(gè)細(xì)胞、1μg/10⁶個(gè)細(xì)胞、1.1μg/10⁶個(gè)細(xì)胞、1.2μg/10⁶個(gè)細(xì)胞、1.3μg/10⁶個(gè)細(xì)胞、1.4μg/10⁶個(gè)細(xì)胞、1.5μg/10⁶個(gè)細(xì)胞的量的Ang1。

在一個(gè)實(shí)例中，表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞表達(dá)至少0.2μg/10⁶個(gè)細(xì)胞至約1.5μg/10⁶個(gè)細(xì)胞的量的Ang1。

在一個(gè)實(shí)例中，表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞表達(dá)至少0.3μg/10⁶個(gè)細(xì)胞至約1.4μg/10⁶個(gè)細(xì)胞的量的Ang1。

在一個(gè)實(shí)例中，表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞表達(dá)至少0.4μg/10⁶個(gè)細(xì)胞至約1.3μg/10⁶個(gè)細(xì)胞的量的Ang1。

在一個(gè)實(shí)例中，表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞表達(dá)至少0.5μg/10⁶個(gè)細(xì)胞至約1.2μg/10⁶個(gè)細(xì)胞的量的Ang1。

在一個(gè)實(shí)例中，表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞表達(dá)至少0.55μg/10⁶個(gè)細(xì)胞至約1.1μg/10⁶個(gè)細(xì)胞的量的Ang1。

在一個(gè)實(shí)例中，表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞表達(dá)至少0.6μg/10⁶個(gè)細(xì)胞至約1.0μg/10⁶個(gè)細(xì)胞的量的Ang1。

在一個(gè)實(shí)例中，表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞表達(dá)至少0.65μg/10⁶個(gè)細(xì)胞至約0.9μg/10⁶個(gè)細(xì)胞的量的Ang1。

在一個(gè)實(shí)例中，表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞表達(dá)至少0.7μg/10⁶個(gè)細(xì)胞至約0.8μg/10⁶個(gè)細(xì)胞的量的Ang1。

在另一方面，表達(dá)升高水平的Ang1的未遺傳修飾的干細(xì)胞表達(dá)少于約0.01μg/10⁶個(gè)細(xì)胞的量的VEGF。

在另一方面，表達(dá)升高水平Ang1的未遺傳修飾的干細(xì)胞表達(dá)少于約0.05μg/10⁶個(gè)細(xì)胞的量的VEGF。然而，在不同的實(shí)施方案中，設(shè)想表達(dá)升高水平Ang1的干細(xì)胞可以表達(dá)少于約0.05μg/10⁶個(gè)細(xì)胞、0.04μg/10⁶個(gè)細(xì)胞、0.03μg/10⁶個(gè)細(xì)胞、0.02μg/10⁶個(gè)細(xì)胞、0.01μg/10⁶個(gè)細(xì)胞、0.009μg/10⁶個(gè)細(xì)胞、0.008μg/10⁶個(gè)細(xì)胞、0.007μg/10⁶個(gè)細(xì)胞、0.006μg/10⁶個(gè)細(xì)胞、0.005μg/10⁶個(gè)細(xì)胞、0.004μg/10⁶個(gè)細(xì)胞、0.003μg/10⁶個(gè)細(xì)胞、0.002μg/10⁶個(gè)細(xì)胞、0.001μg/10⁶個(gè)細(xì)胞的量的VEGF。

在一個(gè)實(shí)例中，表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞表達(dá)至少0.001μg/10⁶個(gè)細(xì)胞至約0.1μg/10⁶個(gè)細(xì)胞的量的VEGF。

在一個(gè)實(shí)例中，表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞表達(dá)至少0.0025μg/10⁶個(gè)細(xì)胞至約0.09μg/10⁶個(gè)細(xì)胞的量的VEGF。

在一個(gè)實(shí)例中，表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞表達(dá)至少0.0075μg/10⁶個(gè)細(xì)胞至約0.08μg/10⁶個(gè)細(xì)胞的量的VEGF。

在一個(gè)實(shí)例中，表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞表達(dá)至少0.01μg/10⁶個(gè)細(xì)胞至約0.07μg/10⁶個(gè)細(xì)胞的量的VEGF。

在一個(gè)實(shí)例中，表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞表達(dá)至少0.02μg/10⁶個(gè)細(xì)胞至約0.06μg/10⁶個(gè)細(xì)胞的量的VEGF。

在一個(gè)實(shí)例中，表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞表達(dá)至少0.02μg/10⁶個(gè)細(xì)胞至約0.05μg/10⁶個(gè)細(xì)胞的量的VEGF。

在干細(xì)胞的組合物或培養(yǎng)物中表達(dá)的細(xì)胞Ang1和/或VEGF的量可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法測(cè)定。此類方法包括(但不限于)定量分析法，例如定量ELISA分析法。然而，應(yīng)了解本公開(kāi)的范圍不限于用于測(cè)定在表達(dá)升高水平Ang1的干細(xì)胞中表達(dá)的Ang1或VEGF的量或水平的任何特定方法。

在一個(gè)實(shí)例中，干細(xì)胞的組合物或培養(yǎng)物表達(dá)的Ang1或VEGF的水平由ELISA分析法測(cè)定。在此類分析法中，將來(lái)自干細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞溶解產(chǎn)物添加到ELISA板的孔中?？卓梢杂冕槍?duì)Ang1或VEGF的初級(jí)抗體(單克隆或多克隆抗體)涂布。接著洗滌孔，接著與針對(duì)初級(jí)抗體的二級(jí)抗體(單克隆或多克隆抗體)接觸。二級(jí)抗體結(jié)合于適當(dāng)?shù)拿?，例如辣根過(guò)氧化酶。接著可以培育孔，接著在培育期后洗滌。接著孔與結(jié)合于二級(jí)抗體的酶的適當(dāng)?shù)孜?例如一種或多種色原)接觸。可以采用的色原包括(但不限于)過(guò)氧化氫和四甲基聯(lián)苯胺。添加底物后，將孔培育適當(dāng)時(shí)間。培育結(jié)束后，將“中止”溶液添加到孔中以中止酶與底物的反應(yīng)。接著測(cè)量樣品的光密度(OD)。樣品的光密度與含有已知量的Ang1或VEGF的樣品的光密度相關(guān)，以確定測(cè)試的干細(xì)胞培養(yǎng)物表達(dá)的Ang1或VEGF的量。

在另一方面，表達(dá)升高水平Ang1的未遺傳修飾的干細(xì)胞表達(dá)至少約2:1比率的Ang1:VEGF。然而，在不同的實(shí)施方案中，設(shè)想表達(dá)升高水平Ang1的干細(xì)胞可以表達(dá)至少約10:1、15:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、50:1比率的Ang1:VEGF。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將顯而易見(jiàn)用于確定Ang1:VEGF表達(dá)比率的方法。在確定Ang1與VEGF表達(dá)比率的方法的一個(gè)實(shí)例中，Ang1和VEGF表達(dá)水平經(jīng)由如以上所討論的定量ELISA定量。在此類實(shí)例中，在定量Ang1和VEGF的水平后，基于Ang1和VEGF的定量水平的比率可以表示為：(Ang1水平/VEGF水平)＝Ang1:VEGF比率。

細(xì)胞組合物

在本公開(kāi)的一個(gè)實(shí)例中，干細(xì)胞呈組合物形式施用。在一個(gè)實(shí)例中，此類組合物包含藥學(xué)上可接受的載劑和/或賦形劑。

術(shù)語(yǔ)“載劑”和“賦形劑”是指通常用于本領(lǐng)域中，以促進(jìn)活性化合物的存儲(chǔ)、施用和/或生物活性的物質(zhì)組合物(參見(jiàn)例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版,Mac Publishing Company(1980))。載劑也可以減少活性化合物的任何不合需要的副作用。適合的載劑是例如穩(wěn)定的，例如不能與載劑中其它成分反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)例中，在治療采用的劑量和濃度下載劑在接受者中不會(huì)產(chǎn)生顯著的局部或全身副作用。

適用于本公開(kāi)的載劑包括通常使用的載劑，例如水、生理鹽水、右旋糖水溶液、乳糖、林格氏溶液(Ringer's solution)、緩沖溶液、透明質(zhì)烷和二醇是示例性液體載劑，特別是(等張時(shí))用于溶液。適合的藥物載劑和賦形劑包括淀粉、纖維素、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻谷、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鎂、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、氯化鈉、甘油、丙二醇、水、乙醇等等。

在另一實(shí)例中，載劑是例如其中細(xì)胞生長(zhǎng)或懸浮的培養(yǎng)基組合物。舉例來(lái)說(shuō)，此類培養(yǎng)基組合物不會(huì)在其施用的受試者中誘發(fā)任何副作用。

示例性載劑和賦形劑不會(huì)不利地影響細(xì)胞的存活力和/或細(xì)胞減輕、預(yù)防或延遲代謝綜合癥和/或肥胖癥的能力。

在一個(gè)實(shí)例中，載劑或賦形劑提供緩沖活性以將細(xì)胞和/或可溶性因子維持在適合的pH值下，從而發(fā)揮生物活性，例如載劑或賦形劑是磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)。PBS代表一種有吸引力的載劑或賦形劑，因?yàn)槠渑c細(xì)胞和因子最低限度地相互作用且允許細(xì)胞和因子快速地釋放，在這種情況下，本公開(kāi)的組合物可以呈液體產(chǎn)生，例如通過(guò)注射直接施加到血流或組織或組織周圍或附近的區(qū)域中。

干細(xì)胞和/或其子代細(xì)胞也可以并入或埋入與接受者相容并降解成對(duì)接受者無(wú)害的產(chǎn)物的支架內(nèi)。這些支架為待移植到受試者中的細(xì)胞提供了支持和保護(hù)。天然和/或合成的生物可降解支架是此類支架的實(shí)例。

多種不同的支架可以成功用于本公開(kāi)的實(shí)施中。示例性支架包括(但不限于)生物可降解支架。天然的生物可降解支架包括膠原蛋白、纖維結(jié)合蛋白和層粘連蛋白支架。用于細(xì)胞移植支架的適合合成材料應(yīng)能支持大規(guī)模細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞功能。此類支架也可以是可再吸收的。適合的支架包括聚乙醇酸支架，例如Vacanti等人,J.Ped.Surg.23:3-9 1988；Cima等人,Biotechnol.Bioeng.38:145 1991；Vacanti等人,Plast.Reconstr.Surg.88:753-9 1991所述；或合成聚合物，例如聚酸酐、聚原酸酯和聚乳酸。

在另一實(shí)例中，細(xì)胞可以在凝膠支架(例如來(lái)自Upjohn Company的Gelfoam)中施用。

本文所述的細(xì)胞組合物可以單獨(dú)或呈與其它細(xì)胞的混合物施用。不同類型的細(xì)胞可以在臨施用前或施用后立即與本公開(kāi)的組合物混合，或其可以在施用前一起共培養(yǎng)一段時(shí)間。

在一個(gè)實(shí)例中，組合物包含有效量或治療或預(yù)防有效量的細(xì)胞。舉例來(lái)說(shuō)，組合物包含約1×10⁵個(gè)具有升高Ang1水平的干細(xì)胞至約1×10⁷個(gè)具有升高Ang1水平的干細(xì)胞或約1×10⁶個(gè)具有升高Ang1的干細(xì)胞至約5×10⁶個(gè)具有升高Ang1的干細(xì)胞/公斤。

待施用的干細(xì)胞的確切劑量取決于多種因子，包括(但不限于)患者的年齡、體重和性別，所治療的疾病或病癥以及其程度和嚴(yán)重程度。

在一個(gè)實(shí)例中，低劑量的細(xì)胞施用于受試者。示例性劑量包括約0.1×10⁴至約0.5×10⁶個(gè)細(xì)胞/公斤之間，例如約0.1×10⁵至約0.5×10⁶個(gè)細(xì)胞/公斤之間，例如約0.5×10⁵至約0.5×10⁶個(gè)細(xì)胞/公斤之間，例如約0.1×10⁶至約0.5×10⁶個(gè)細(xì)胞/公斤之間，例如約0.2×10⁶或0.3×10⁶或0.4×10⁶個(gè)細(xì)胞/公斤。

舉例來(lái)說(shuō)，可向受試者施用每公斤約0.1×10⁶、約0.2×10⁶、約0.3×10⁶、約0.4×10⁶、約0.5×10⁶個(gè)細(xì)胞。

在其它實(shí)例中，向受試者施用每公斤約0.6×10⁶、約0.7×10⁶、約0.8×10⁶、約0.9×10⁶、約1.0×10⁶、約1.1×10⁶、約1.2×10⁶、約1.3×10⁶、約1.4×10⁶個(gè)細(xì)胞。

在一個(gè)實(shí)例中，高劑量的細(xì)胞施用于受試者。示例性劑量包括至少約1.5×10⁶個(gè)細(xì)胞/公斤。舉例來(lái)說(shuō)，高劑量包含約1.5×10⁶至約6×10⁶個(gè)細(xì)胞/公斤之間，例如約1.5×10⁶至約5×10⁶個(gè)細(xì)胞/公斤之間，例如約1.5×10⁶至約4×10⁶個(gè)細(xì)胞/公斤之間，例如約1.5×10⁶至約3×10⁶個(gè)細(xì)胞/公斤之間。舉例來(lái)說(shuō)，高劑量包含約1.5×10⁶或約2×10⁶個(gè)細(xì)胞/公斤。舉例來(lái)說(shuō)，高劑量包含約1.5×10⁶個(gè)細(xì)胞/公斤。舉例來(lái)說(shuō)，高劑量包含約2×10⁶個(gè)細(xì)胞/公斤。舉例來(lái)說(shuō)，高劑量包含約3×10⁶個(gè)細(xì)胞/公斤。

在其它實(shí)例中，向受試者施用每公斤約1.5×10⁶、約1.6×10⁶、約1.7×10⁶、約1.8×10⁶、約1.9×10⁶、約2.0×10⁶、約2.1×10⁶、約2.2×10⁶、約2.3×10⁶、約2.4×10⁶、約2.5×10⁶、約2.6×10⁶、約2.7×10⁶、約2.8×10⁶、約2.9×10⁶、約3.0×10⁶、約3.1×10⁶、約3.2×10⁶、約3.3×10⁶、約3.4×10⁶、約3.5×10⁶、約3.6×10⁶、約3.7×10⁶、約3.8×10⁶、約3.9×10⁶、約4.0×10⁶個(gè)細(xì)胞。

在其它實(shí)例中，向受試者施用每公斤約1.0×10⁸、約1.1×10⁸、約1.2×10⁸、約1.3×10⁸、約1.4×10⁸、約1.5×10⁸、約1.6×10⁸、約1.7×10⁸、約1.8×10⁸、約1.9×10⁸、約2.0×10⁸、約2.1×10⁸、約2.2×10⁸、約2.3×10⁸、約2.4×10⁸、約2.5×10⁸、約2.6×10⁸、約2.7×10⁸、約2.8×10⁸、約2.9×10⁸個(gè)細(xì)胞、約3.0×10⁸、約3.1×10⁸、約3.2×10⁸、約3.3×10⁸、約3.4×10⁸、約3.5×10⁸、約3.6×10⁸、約3.7×10⁸、約3.8×10⁸、約3.9×10⁸、約4.0×10⁸個(gè)細(xì)胞。

間質(zhì)譜系前驅(qū)細(xì)胞或干細(xì)胞可占組合物細(xì)胞群體的至少約5％。在其它實(shí)例中，間質(zhì)譜系前驅(qū)細(xì)胞或干細(xì)胞可占組合物細(xì)胞群體的至少約10％、至少約15％、至少約20％、至少約25％、至少約30％、至少約35％、至少約40％、至少約45％、至少約50％、至少約55％、至少約60％、至少約65％、至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％。

表達(dá)CD44的干細(xì)胞可占組合物細(xì)胞群體的至少約5％。在其它實(shí)例中，表達(dá)CD44的干細(xì)胞可占組合物細(xì)胞群體的至少約10％、至少約15％、至少約20％、至少約25％、至少約30％、至少約35％、至少約40％、至少約45％、至少約50％、至少約55％、至少約60％、至少約65％、至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約99％、至少約100％。

在一些實(shí)例中，細(xì)胞容納在一腔室內(nèi)，該腔室不允許細(xì)胞離開(kāi)到受試者循環(huán)中，然而，允許細(xì)胞分泌的因子進(jìn)入循環(huán)。以此方式，可溶性因子可以通過(guò)允許細(xì)胞分泌因子到受試者循環(huán)中而施用于受試者。此類腔室可以同等地植入受試者中的部位以增加例如植入心臟中或心臟附近的可溶性因子的局部水平。

干細(xì)胞可以全身施用，例如通過(guò)靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)或腹膜內(nèi)施用。

間質(zhì)譜系前驅(qū)細(xì)胞或干細(xì)胞也可以通過(guò)鼻內(nèi)、肌肉內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)或心內(nèi)施用來(lái)施用。

舉例來(lái)說(shuō)，間質(zhì)譜系前驅(qū)細(xì)胞或干細(xì)胞可以直接施用于疼痛或腫脹關(guān)節(jié)中。

在另一實(shí)例中，表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞經(jīng)由冠狀動(dòng)脈內(nèi)輸注施用。舉例來(lái)說(shuō)，間質(zhì)譜系前驅(qū)細(xì)胞或干細(xì)胞可以施用左前降(LAD)動(dòng)脈。

在另一實(shí)例中，表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞經(jīng)由腎內(nèi)輸注施用。

在一個(gè)實(shí)例中，表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞可以呈單次劑量施用。

在一些實(shí)例中，表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞可以多劑量施用。舉例來(lái)說(shuō)，至少2劑、至少3劑、至少4劑、至少5劑、至少6劑、至少7劑、至少8劑、至少9劑、至少10劑。

包含表達(dá)升高水平Ang1的干細(xì)胞的組合物可以低溫保存。干細(xì)胞的低溫保存可以使用本領(lǐng)域中已知的慢速冷卻法或‘快速’冷凍方案進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)例中，與解凍細(xì)胞相比，低溫保存方法維持低溫保存細(xì)胞類似的表型、細(xì)胞表面標(biāo)記物和生長(zhǎng)速率。

低溫保存的組合物可以包含低溫保存溶液。低溫保存溶液的pH值通常是約6.5至8。

在一個(gè)實(shí)例中，低溫保存溶液的pH值是約7.4。

低溫保存溶液可以包含無(wú)菌的非熱性等張溶液，例如PlasmaLyte 100mL PlasmaLyte含有526mg氯化鈉USP(NaCl)；502mg葡糖酸鈉(C₆H₁₁NaO₇)；368mg三水合乙酸鈉USP(C₂H₃NaO₂·3H₂O)；37mg氯化鉀USP(KCl)；和30mg氯化鎂USP(MgCl₂·6H₂O)。其不含抗微生物劑。用氫氧化鈉調(diào)整pH值。pH值是7.4(6.5至8.0)。

為了促進(jìn)冷凍，通常將例如二甲亞砜(DMSO)等低溫保護(hù)劑添加到低溫保存溶液。理想地，低溫保護(hù)劑應(yīng)對(duì)細(xì)胞和患者來(lái)說(shuō)是無(wú)毒的，非抗原性、化學(xué)惰性，在解凍后存活率高并允許在不洗滌下移植。然而，最常使用的低溫防護(hù)劑DMSO展示一定細(xì)胞毒性。羥乙基淀粉(HES)可以用作DMSO的替代品或與DMSO組合，以降低低溫保存溶液的細(xì)胞毒性。

低溫保存溶液可以包含DMSO、羥乙基淀粉、人類血清組分和其它蛋白質(zhì)填充劑中的一者或多者。在一個(gè)實(shí)例中，低溫保存的溶液包含約5％人類血清白蛋白(HSA)和約10％DMSO。低溫保存溶液可以進(jìn)一步包含甲基纖維素、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)和海藻糖中的一者或多者。

低溫保存的組合物可以解凍并直接施用于受試者?；蛘撸蜏乇４娴慕M合物可以解凍并在施用前使間質(zhì)譜系前驅(qū)細(xì)胞或干細(xì)胞再懸浮于替代溶液中。

表達(dá)升高水平Ang1的干細(xì)胞以有效治療動(dòng)物的疾病或病癥的量施用于動(dòng)物。動(dòng)物可以是哺乳動(dòng)物，且哺乳動(dòng)物可以是靈長(zhǎng)類動(dòng)物，包括人類和非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物。

在一個(gè)實(shí)例中，表達(dá)升高水平Ang1的干細(xì)胞施用于人類。

在一個(gè)實(shí)例中，表達(dá)升高水平Ang1的干細(xì)胞施用于人類。

在一個(gè)實(shí)例中，表達(dá)升高水平Ang1的干細(xì)胞施用于患有糖尿病的受試者。

在一個(gè)實(shí)例中，表達(dá)升高水平Ang1的干細(xì)胞施用于患有II型糖尿病的受試者。

在一個(gè)實(shí)例中，表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞施用于患有II型糖尿病的基線HbA1c值超過(guò)約7％的受試者。舉例來(lái)說(shuō)，表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞可施用于患有II型糖尿病的基線HbA1c值超過(guò)約7.1％、約7.2％、約7.3％、約7.4％、約7.5％、約7.6％、約7.7％、約7.8％、約7.9％、約8.0％、約8.1％、約8.2％、約8.3％、約8.4％、約8.5％、約8.6％、約8.7％、約8.8％、約8.9％、約9.0％的受試者。

在一個(gè)實(shí)例中，表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞可施用患有II型糖尿病的基線HbA1c值大于或等于約8.0％的受試者。

本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將顯而易見(jiàn)用于確定HbA1c值(總血紅蛋白％)的方法。用于確定HbA1c值(總血紅蛋白％)的方法的實(shí)例包括高效液體色譜法(HPLC)或免疫分析法。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員也將意識(shí)到HbA1c值可以表示為其它值，例如mmol/mol。

在一個(gè)實(shí)例中，通過(guò)HPLC測(cè)定受試者HbA1c值。

在一個(gè)實(shí)例中，通過(guò)免疫分析法測(cè)定受試者HbA1c值。

在一個(gè)實(shí)例中，表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞施用于患有II型糖尿病的受試者，其中受試者的葡萄糖水平的控制不足。

在一個(gè)實(shí)例中，表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞施用于患有II型糖尿病的受試者，其中二甲雙胍或二甲雙胍加另一口服治療劑對(duì)受試者的葡萄糖水平的控制不足。

在一個(gè)實(shí)例中，表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞施用于患有慢性腎病的受試者。

在一個(gè)實(shí)例中，表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞施用于患有糖尿病性腎病的受試者。

在一個(gè)實(shí)例中，表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞施用于患有II型糖尿病和慢性腎病的受試者。

在一個(gè)實(shí)例中，表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞施用于患有II型糖尿病和糖尿病性腎病的受試者。

估計(jì)腎小球?yàn)V過(guò)率(eGFR)用以篩選和檢測(cè)早期腎損害和監(jiān)測(cè)腎狀態(tài)。

在一個(gè)實(shí)例中，表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞施用于基線eGFR超過(guò)約35ml/min/1.73m²、約34ml/min/1.73m²、約44ml/min/1.73m²、約32ml/min/1.73m²、約31ml/min/1.73m²、約30ml/min/1.73m²、約29ml/min/1.73m²、約28ml/min/1.73m²、約27ml/min/1.73m²、約26ml/min/1.73m²、約25ml/min/1.73m²的受試者。

在一個(gè)實(shí)例中，表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞施用于具有腎功能階段3A、3B、4或5的受試者。

在一個(gè)實(shí)例中，表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞施用于具有腎功能階段3B的受試者。

在一個(gè)實(shí)例中，表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞施用于受試者

在一個(gè)實(shí)例中，表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞施用于基線eGFR大于或等于30ml/min/1.73m²的受試者。

本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將顯而易見(jiàn)用于估計(jì)GFR的方法并例示于下文中。可以使用肌酸酐和/或胱抑素C水平計(jì)算eGFR。

舉例來(lái)說(shuō)，可以使用MDRD等式計(jì)算eGFR：

GFR(mL/min/1.73m²)＝175×(S_cr)^-1.¹⁵⁴×(Age)^-0.²⁰³×(女性0.742)×(非裔美國(guó)人1.212)

在其它實(shí)例中可以使用CKD-EPI等式計(jì)算eGFR(Levey等人Ann Intern.Med.150(9),604-12,2009)；

GFR＝141×min(S_cr/κ,1)^α×max(S_cr/κ,1)^-1.209×0.993^Age×1.018[女性]×1.159[黑人]

其中；

S_cr為血清肌酸酐，以mg/dL為單位，

κ對(duì)于女性為0.7，且對(duì)于男性為0.9，

α對(duì)于女性為-0.329，且對(duì)于男性，為-0.411，

min指示S_cr/κ或1的最小值，以及

max指示S_cr/κ或1的最大值。

eGFR也可以隨著時(shí)間推移不斷地計(jì)算和監(jiān)測(cè)，以確定eGFR是下降還是提高?？梢栽趯?duì)照組與處理組之間比較eGFR以鑒別在處理組中是否抑制eGFR的下降。

在一個(gè)實(shí)例中，表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞施用于患有關(guān)節(jié)炎的受試者。

在一個(gè)實(shí)例中，表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞施用于患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的受試者。

在一個(gè)實(shí)例中，表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞施用于患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的分類為不完全抗TNFα反應(yīng)者的受試者。

在一個(gè)實(shí)例中，表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞施用于患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎生物療法失效的受試者。

在兩個(gè)實(shí)例中，表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞施用于患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的兩種類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎生物療法失效的受試者。

在兩個(gè)實(shí)例中，表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞施用于患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的三種類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎生物療法失效的受試者。

TNF-α、IL-6、IL-17的抑制

TNF-α、IL-6和IL-17是被稱為細(xì)胞因子的化學(xué)信使。這些分子回應(yīng)于多種信號(hào)從細(xì)胞釋放。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)‘抑制(inhibit或inhibiting)’是指例如蛋白質(zhì)(例如細(xì)胞因子)等物質(zhì)或過(guò)程(例如細(xì)胞分化或細(xì)胞極化)的可測(cè)量水平的減少或遏制。

因此，在一個(gè)實(shí)例中，設(shè)想施用包含表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞的細(xì)胞組合物將降低受試者中TNF-α、IL-17和/或IL-6的可測(cè)量水平。在此實(shí)例中，抑制TNF-α、IL-17和/或IL-6從細(xì)胞釋放。

在一個(gè)實(shí)例中，本公開(kāi)涉及一種監(jiān)測(cè)受試者對(duì)施用表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞的反應(yīng)的方法。在此實(shí)例中，可以在施用表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞后的一段時(shí)間內(nèi)監(jiān)測(cè)水平或例如細(xì)胞因子等促炎性和/或消炎標(biāo)記物。

在一個(gè)實(shí)例中，本公開(kāi)涉及一種在施用表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞后監(jiān)測(cè)受試者反應(yīng)的方法，所述方法包括：評(píng)估從已經(jīng)施用表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞的受試者獲得的例如全血樣品等樣品中發(fā)炎和/或消炎標(biāo)記物的水平；以及基于促炎性和/或消炎標(biāo)記物的水平，確定受試者是否對(duì)施用表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞作出反應(yīng)。

在一個(gè)實(shí)例中，消炎標(biāo)記物水平增加和/或發(fā)炎標(biāo)記物水平下降表明受試者對(duì)施用干細(xì)胞作出反應(yīng)。

在一個(gè)實(shí)例中，發(fā)炎和/或消炎標(biāo)記物是細(xì)胞或細(xì)胞群體。

在一個(gè)實(shí)例中，消炎細(xì)胞數(shù)目增加和/或發(fā)炎細(xì)胞數(shù)目下降指示受試者對(duì)施用干細(xì)胞作出反應(yīng)。

在一個(gè)實(shí)例中，消炎細(xì)胞是Th2細(xì)胞、Treg細(xì)胞和/或M2型巨噬細(xì)胞。

在一個(gè)實(shí)例中，發(fā)炎細(xì)胞是Th17細(xì)胞和/或M1型巨噬細(xì)胞。

熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者可以使用多種分析法，所述分析法可以用于確定發(fā)炎細(xì)胞數(shù)目是否已經(jīng)降低和/或消炎細(xì)胞數(shù)目是否已經(jīng)增加。

舉例來(lái)說(shuō)，可使用基于流式細(xì)胞術(shù)的技術(shù)，例如熒光激活細(xì)胞分類術(shù)(FACS)，針對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)來(lái)評(píng)估從全血樣品分離的細(xì)胞群體。

在一個(gè)實(shí)例中，CD14+單核細(xì)胞可以從獲自施用表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞的受試者的全血樣品純化?？舍槍?duì)CD16、CD163和CD206表達(dá)評(píng)估單核細(xì)胞，以鑒別M1和M2型巨噬細(xì)胞的比例?？梢噪S著時(shí)間推移，評(píng)估多個(gè)樣品以確定M1型巨噬細(xì)胞數(shù)目是降低還是遞降，和/或M2型巨噬細(xì)胞水平是增加還是遞增。在一個(gè)實(shí)例中，相對(duì)于從施用干細(xì)胞前的受試者獲得的樣品(例如基線或治療前參考樣品)中M1和/或M2型巨噬細(xì)胞數(shù)目，評(píng)估M1和/或M2型巨噬細(xì)胞數(shù)目。

在另一實(shí)例中，評(píng)估的發(fā)炎和/或消炎標(biāo)記物是細(xì)胞因子。

在一個(gè)實(shí)例中，發(fā)炎標(biāo)記物是TNF-α、IL-17和/或IL-6。

在一個(gè)實(shí)例中，消炎標(biāo)記物是IL-10。

熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者可以使用多種分析法，所述分析法可以確定TNF-α、IL-17和/或IL-6水平是否已經(jīng)降低或IL-10水平是否已經(jīng)增加。在一個(gè)實(shí)例中，可以使用分光光度技術(shù)，例如Immulite化學(xué)發(fā)光免疫分析法，測(cè)定TNF-α、IL-17、IL-10和/或IL-6濃度水平。在另一實(shí)例中，可以使用Luminex平臺(tái)，使用市售試劑盒(Millipore)，測(cè)量TNF-α、IL-17、IL-10和/或IL-6濃度水平。

在一個(gè)實(shí)例中，施用包含表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞的細(xì)胞組合物將抑制巨噬細(xì)胞的TNF-α和/或IL-6釋放。熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者可以使用多種方法，所述方法可以確定TNF-α和/或IL-6從巨噬細(xì)胞的釋放是否減少。舉例來(lái)說(shuō)，巨噬細(xì)胞可以體外培養(yǎng)，并暴露于包含表達(dá)升高水平Ang1的干細(xì)胞的組合物或者適合對(duì)照。一段時(shí)間后，接著可以使用以上例示的方法評(píng)估TNF-α和/或IL-6釋放。接著暴露于包含表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞的細(xì)胞組合物的細(xì)胞中TNF-α和/或IL-6水平可以與對(duì)照細(xì)胞中TNF-α和/或IL-6水平相比，以確定TNF-α和/或IL-6水平是否降低。

已經(jīng)定義巨噬細(xì)胞的兩種不同極化狀態(tài)：經(jīng)典活化(M1)的巨噬細(xì)胞表型或“M1型巨噬細(xì)胞”，和替代性活化(M2)的巨噬細(xì)胞表型或M2型巨噬細(xì)胞(Gordon和Taylor.,Nat.Rev.Immunol.5:953-964,2005；Mantovani等人,Trends Immunol.23:549-555,2002)。M1型巨噬細(xì)胞具有“促炎性”細(xì)胞因子型態(tài)(例如TNF-α、IL-6、IL-1-β、IL-12、IL-23)。而M2型巨噬細(xì)胞具有“消炎”細(xì)胞因子型態(tài)(例如IL-10)。在一個(gè)實(shí)例中，設(shè)想施用包含表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞的細(xì)胞組合物將抑制M1型巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子釋放。在另一實(shí)例中，設(shè)想施用包含表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞的細(xì)胞組合物將抑制M1型巨噬細(xì)胞的TNF-α和/或IL-6釋放。熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者可以使用多種分析法，所述分析法可以確定M1型巨噬細(xì)胞的TNF-α、IL-6和/或其它細(xì)胞因子釋放是否減少。舉例來(lái)說(shuō)，在上述體外分析法中使用M1型巨噬細(xì)胞。在此實(shí)例中，可以通過(guò)從全血樣品進(jìn)行免疫選擇來(lái)純化CD14+單核細(xì)胞。

增加消炎細(xì)胞產(chǎn)生和/或功能

在一個(gè)實(shí)例中，本公開(kāi)涉及一種增加受試者中消炎細(xì)胞產(chǎn)生和/或功能的方法，其通過(guò)施用表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞。

術(shù)語(yǔ)“消炎細(xì)胞”在本公開(kāi)的上下文中用以指在受試者中引發(fā)或介導(dǎo)消炎反應(yīng)的細(xì)胞。“消炎細(xì)胞”可以直接作用于細(xì)胞群體或目標(biāo)以指導(dǎo)消炎反應(yīng)?；蛘?，本公開(kāi)涵蓋的消炎細(xì)胞可以表達(dá)或分泌作用于特定細(xì)胞群體或目標(biāo)以指導(dǎo)消炎反應(yīng)的例如細(xì)胞因子等因子。

消炎細(xì)胞的實(shí)例包括Th2細(xì)胞、Treg細(xì)胞和/或M2型巨噬細(xì)胞。

在一個(gè)實(shí)例中，本公開(kāi)涉及一種增加受試者中Th2細(xì)胞、Treg和/或M2型巨噬細(xì)胞數(shù)目的方法，其通過(guò)施用表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞。

在一個(gè)實(shí)例中，本公開(kāi)涉及一種增加受試者中M2型巨噬細(xì)胞數(shù)目的方法，其通過(guò)施用表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞。

在一個(gè)實(shí)例中，本公開(kāi)的方法增加受試者中M2型巨噬細(xì)胞數(shù)目至總單核細(xì)胞群體的至少約6％、至少約7％、至少約8％、至少約9％。

在一個(gè)實(shí)例中，本公開(kāi)的方法增加受試者中M2型巨噬細(xì)胞數(shù)目至總單核細(xì)胞群體的至少約10％。

在一個(gè)實(shí)例中，本公開(kāi)的方法增加受試者中M2型巨噬細(xì)胞數(shù)目至總單核細(xì)胞群體的至少約10％、至少約15％、至少約20％、至少約25％、至少約30％、至少約35％、至少約40％、至少約45％、至少約50％、至少約55％、至少約60％、至少約65％、至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％。

本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易使用此項(xiàng)技術(shù)中已知的多種方法確定相對(duì)于受試者的總單核細(xì)胞群體的M2-巨噬細(xì)胞％。舉例來(lái)說(shuō)，M2巨噬細(xì)胞可以基于其CD14和CD16以及例如CD163和CD206等其它標(biāo)記物的表達(dá)來(lái)確定。

在此實(shí)例中，可以從受試者獲得全血樣品，可以經(jīng)由FACS基于CD14的表達(dá)免疫選擇細(xì)胞。接著可以針對(duì)CD16、CD163和CD206的表達(dá)評(píng)估CD14+細(xì)胞。CD14+CD16+CD163+CD206+的比例可以相對(duì)于樣品中總CD14+細(xì)胞群體計(jì)算。

在一個(gè)實(shí)例中，增加受試者中消炎細(xì)胞的產(chǎn)生和/或功能引起：

-受試者中IL-6水平降低；

-受試者中TNF-α水平降低；和/或

-受試者中IL-10水平增加。

在另一實(shí)例中，本公開(kāi)的方法是一種促進(jìn)巨噬細(xì)胞從M1極化成M2表型的方法。

舉例來(lái)說(shuō)，本公開(kāi)提供了一種促進(jìn)有需要的受試者中M1型巨噬細(xì)胞極化成M2型巨噬細(xì)胞的方法，所述方法包括向所述受試者施用包含未遺傳修飾的干細(xì)胞的組合物，其中所述未遺傳修飾的干細(xì)胞表達(dá)至少0.1μg/10⁶個(gè)細(xì)胞的量的血管生成素-1(Ang1)。

在此實(shí)例中，CD14+CD16+細(xì)胞、CD14++CD16+細(xì)胞、CD14+CD16+CD163+細(xì)胞、CD14++CD16+CD163+細(xì)胞、CD14+CD16+CD206+細(xì)胞、CD14++CD16+CD206+細(xì)胞、CD14+CD16+CD163+CD206+細(xì)胞、CD14++CD16+CD163+CD206+細(xì)胞、CD14+CD163+細(xì)胞、CD14++CD163+細(xì)胞、CD14+CD206+細(xì)胞、CD14++CD206+細(xì)胞、CD14+CD163+206+細(xì)胞、CD14++CD163+CD206+細(xì)胞產(chǎn)生或數(shù)目增加、IL-6水平降低、TNF-α水平降低和/或IL-10水平增加可以指示已經(jīng)促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞極化成M2型巨噬細(xì)胞。

相反地，在另一實(shí)例中，本公開(kāi)提供了一種抑制M2型巨噬細(xì)胞極化成M1型巨噬細(xì)胞的方法。

在另一實(shí)例中，本公開(kāi)提供了一種抑制有需要的受試者中M1型巨噬細(xì)胞產(chǎn)生和/或功能的方法，所述方法包括向受試者施用包含未遺傳修飾的干細(xì)胞的組合物，其中所述未遺傳修飾的干細(xì)胞表達(dá)升高水平的血管生成素-1(Ang1)。

治療方法

本公開(kāi)涉及一種治療發(fā)炎性疾病的方法。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“發(fā)炎性疾病”涵蓋包括(但不限于)以下的疾?。吼W、皮膚發(fā)炎、牛皮癬、多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、全身性紅斑狼瘡、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroidis)、重癥肌無(wú)力、I型或II型糖尿病、糖尿病性腎病、哮喘、發(fā)炎性肺損傷、發(fā)炎性肝損傷、發(fā)炎性腎小球損傷、異位性皮炎、變應(yīng)性接觸性皮炎、刺激性接觸性皮炎、脂溢性皮炎、休格連氏綜合癥(Sjoegren's syndrome)、角膜結(jié)膜炎、葡萄膜炎、發(fā)炎性腸病、克羅恩氏病(Crohn's disease)、潰瘍性結(jié)腸炎、關(guān)節(jié)、皮膚或肌肉發(fā)炎性疾病、急性或慢性發(fā)炎性關(guān)節(jié)炎、肌炎、髓鞘脫失病、慢性阻塞性肺病、間質(zhì)性肺病、間質(zhì)性腎炎和慢性活動(dòng)型肝炎。

在一個(gè)實(shí)例中，本公開(kāi)的方法治療的發(fā)炎性疾病是糖尿病。在另一實(shí)例中，發(fā)炎性疾病是糖尿病相關(guān)病狀或癥狀。在此實(shí)例中，可以治療的癥狀包括：異常傷口愈合、與心臟病發(fā)作相關(guān)的癥狀(例如胸痛)、與中風(fēng)相關(guān)的癥狀、周圍血管疾病癥狀、截肢、腎病、腎衰竭、失明、神經(jīng)病、發(fā)炎、性交不能或非酒精性脂肪肝炎(NASH)。

舉例來(lái)說(shuō)，本公開(kāi)的方法治療的發(fā)炎性疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。

舉例來(lái)說(shuō)，本公開(kāi)的方法治療的發(fā)炎性疾病是糖尿病性視網(wǎng)膜病。

在一個(gè)實(shí)例中，本公開(kāi)涉及一種治療糖尿病的方法。

在一個(gè)實(shí)例中，本公開(kāi)涉及一種治療II型糖尿病的方法。

在一個(gè)實(shí)例中，本公開(kāi)涉及一種治療糖尿病性腎病的方法。

在一個(gè)實(shí)例中，本公開(kāi)涉及一種治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法。

如本文所用，應(yīng)了解術(shù)語(yǔ)“治療(treat或treatment或treating)”意指施用治療有效量的細(xì)胞。在本公開(kāi)的上下文中，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞的治療有效量”是指細(xì)胞有效預(yù)防、改善或治療發(fā)炎性疾病或病癥的量。此類有效量一般將改善發(fā)炎性疾病或病癥的征象、癥狀和/或其它指示物。舉例來(lái)說(shuō)，在糖尿病中，有效量的細(xì)胞可降低HbA1c值、降低例如IL-6和/或TNF-α等細(xì)胞因子水平、降低空腹胰島素和/或增加脂肪細(xì)胞因子水平。

舉例來(lái)說(shuō)，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中，有效量的細(xì)胞可以實(shí)現(xiàn)ACR20、ACR 50和/或ACR70、降低例如IL-6等細(xì)胞因子水平和/或降低疾病活性評(píng)分。

舉例來(lái)說(shuō)，在糖尿病性腎病中，有效量的細(xì)胞可以抑制eGFR或mGFR下降、改善eGFR或mGFR和/或降低例如IL-6等細(xì)胞因子水平。

在糖尿病或其相關(guān)病狀或癥狀的上下文中，熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者可以使用多種常規(guī)臨床分析法，所述分析法可以用于確定HbA1c值降低、空腹胰島素降低和/或脂肪細(xì)胞因子水平增加。舉例來(lái)說(shuō)，血液樣品一般將從受試者獲得，接著進(jìn)行免疫分析法以檢測(cè)HbA1c、胰島素和脂肪細(xì)胞因子水平。

細(xì)胞培養(yǎng)方法

在一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)生表達(dá)升高水平Ang1的干細(xì)胞的方法包括：在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)干細(xì)胞群體，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基含有短效L-抗壞血酸衍生物，但不含有大量的長(zhǎng)效L-抗壞血酸衍生物；和/或補(bǔ)充少于10％v/v胎牛血清。

術(shù)語(yǔ)“培養(yǎng)基(media)”或“培養(yǎng)基(medium)”在提及細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)使用時(shí)包括細(xì)胞周圍環(huán)境的組分。設(shè)想培養(yǎng)基促成和/或提供足夠誘導(dǎo)Ang1表達(dá)的表達(dá)的條件。培養(yǎng)基可以是固體、液體、氣體或各相和物質(zhì)的混合物。培養(yǎng)基可以包括液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基以及不保持細(xì)胞生長(zhǎng)的液體介質(zhì)。培養(yǎng)基還包括凝膠狀培養(yǎng)基，例如瓊脂、瓊脂糖、明膠和膠原蛋白基質(zhì)。示例性氣體培養(yǎng)基包括在皮式培養(yǎng)皿(petri dish)或其它固體或半固體支撐物上生長(zhǎng)的細(xì)胞所暴露的氣相。術(shù)語(yǔ)“培養(yǎng)基”還指意圖用于細(xì)胞培養(yǎng)中，即使尚未與細(xì)胞接觸的物質(zhì)。

用于產(chǎn)生表達(dá)升高水平Ang1的干細(xì)胞的方法中的培養(yǎng)基可以通過(guò)使用用于培養(yǎng)干細(xì)胞的培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基來(lái)制備?；A(chǔ)培養(yǎng)基包括例如伊格爾最低必需(MEM)培養(yǎng)基、α改性MEM培養(yǎng)基和其混合培養(yǎng)基，且不特別限制，只要其可以用于培養(yǎng)干細(xì)胞即可。

此外，培養(yǎng)基可以含有例如脂肪酸或脂質(zhì)、維生素、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、抗氧化劑、緩沖劑、無(wú)機(jī)鹽等任何組分。

細(xì)胞培養(yǎng)基還可以含有所有必需氨基酸且還可以含有非必需氨基酸。一般說(shuō)來(lái)，氨基酸分為必需氨基酸(Thr、Met、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Lys、His)和非必需氨基酸(Gly、Ala、Ser、Cys、Gln、Asn、Asp、Tyr、Arg、Pro)。

抗壞血酸是多種細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)和分化的必需補(bǔ)充物?，F(xiàn)在了解特定的抗壞血酸衍生物是“短效”的，因?yàn)槠湓谌芤褐胁环€(wěn)定，尤其是在中性pH值和37℃的正常細(xì)胞培養(yǎng)條件下。這些短效衍生物迅速氧化成乙二酸或蘇糖酸。在培養(yǎng)基(pH 7)中在37℃下，在24小時(shí)內(nèi)氧化使這些短效抗壞血酸衍生物的水平降低大約80％-90％。因此，在多種細(xì)胞類型的常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)中，短效抗壞血酸衍生物已經(jīng)替換成更穩(wěn)定的“長(zhǎng)效”抗壞血酸衍生物。

在本公開(kāi)的上下文中，術(shù)語(yǔ)“短效”涵蓋在中性pH值和37℃的培養(yǎng)條件下24小時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)后氧化大約80％-90％的抗壞血酸衍生物。在一個(gè)實(shí)例中，短效L-抗壞血酸衍生物是L-抗壞血酸鹽。舉例來(lái)說(shuō)，在本公開(kāi)的上下文中，L-抗壞血酸鈉鹽是“短效”抗壞血酸衍生物。

相比之下，術(shù)語(yǔ)“長(zhǎng)效”涵蓋在中性pH值和37℃的培養(yǎng)條件下24小時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)后未氧化大約80％-90％的抗壞血酸衍生物。在一個(gè)實(shí)例中，在本公開(kāi)的上下文中，L-抗壞血酸-2-磷酸鹽是“長(zhǎng)效”抗壞血酸衍生物。長(zhǎng)效抗壞血酸衍生物的其它實(shí)例包括四己基癸基抗壞血酸酯、抗壞血酸磷酸鎂和2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗壞血酸。

在一個(gè)實(shí)例中，用于產(chǎn)生表達(dá)升高水平Ang1的干細(xì)胞的方法中的細(xì)胞培養(yǎng)基補(bǔ)充短效抗壞血酸衍生物。舉例來(lái)說(shuō)，細(xì)胞培養(yǎng)基可以含有至少約0.005g/L的短效抗壞血酸衍生物。在另一實(shí)例中，細(xì)胞培養(yǎng)基可以含有至少約0.01g/L的短效抗壞血酸衍生物。舉例來(lái)說(shuō)，細(xì)胞培養(yǎng)基可以含有至少約0.02g/L的短效抗壞血酸衍生物。在另一實(shí)例中，細(xì)胞培養(yǎng)基可以含有至少約0.03g/L的短效抗壞血酸衍生物。舉例來(lái)說(shuō)，細(xì)胞培養(yǎng)基可以含有至少約0.04g/L的短效抗壞血酸衍生物。在另一實(shí)例中，細(xì)胞培養(yǎng)基可以含有至少約0.05g/L的短效抗壞血酸衍生物。在另一實(shí)例中，細(xì)胞培養(yǎng)基可以含有至少約0.06g/L的短效抗壞血酸衍生物。在此實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)例中，細(xì)胞培養(yǎng)基補(bǔ)充L-抗壞血酸鈉鹽。

在另一實(shí)例中，細(xì)胞培養(yǎng)基含有短效抗壞血酸衍生物，但不含有大量的長(zhǎng)效抗壞血酸衍生物。舉例來(lái)說(shuō)，細(xì)胞培養(yǎng)基可以含有短效抗壞血酸衍生物，但不超過(guò)0.04g/L的長(zhǎng)效抗壞血酸衍生物。在另一實(shí)例中，細(xì)胞培養(yǎng)基可以含有短效抗壞血酸衍生物，但不超過(guò)0.03g/L的長(zhǎng)效抗壞血酸衍生物。在另一實(shí)例中，細(xì)胞培養(yǎng)基可以含有短效抗壞血酸衍生物，但不超過(guò)0.02g/L的長(zhǎng)效抗壞血酸衍生物。在另一實(shí)例中，細(xì)胞培養(yǎng)基可以含有短效抗壞血酸衍生物，但不超過(guò)0.01g/L的長(zhǎng)效抗壞血酸衍生物。在另一實(shí)例中，細(xì)胞培養(yǎng)基可以含有短效抗壞血酸衍生物，但不超過(guò)0.005g/L的長(zhǎng)效抗壞血酸衍生物。在另一實(shí)例中，細(xì)胞培養(yǎng)基可以含有短效抗壞血酸衍生物，但不含長(zhǎng)效抗壞血酸衍生物。

在另一實(shí)例中，細(xì)胞培養(yǎng)基含有L-抗壞血酸鈉鹽，但不含有大量的L-抗壞血酸-2-磷酸鹽。

用于產(chǎn)生表達(dá)升高水平Ang1的干細(xì)胞的方法中的細(xì)胞培養(yǎng)基可以是含血清的培養(yǎng)基或無(wú)血清的培養(yǎng)基。

培養(yǎng)基可以含有或不含有血清替換品。血清替換品可以是例如白蛋白(例如富含脂質(zhì)的白蛋白)、轉(zhuǎn)鐵蛋白、脂肪酸、胰島素、膠原蛋白前驅(qū)物、微量元素、2-巰基乙醇或3'-硫醇甘油或適當(dāng)含有血清同等物的替換品。此類血清替換品可以例如通過(guò)國(guó)際公布WO 93/30679中描述的方法制備，且也可以使用市售產(chǎn)品。

在一個(gè)實(shí)例中，用于產(chǎn)生表達(dá)升高水平Ang1的干細(xì)胞的方法中的細(xì)胞培養(yǎng)基補(bǔ)充至少約9％v/v、至少約8％v/v、至少約7％v/v、至少約6％v/v、至少約5％v/v、至少約4％v/v、至少約3％v/v、至少約2％v/v、至少約1％v/v FCS。還設(shè)想在本公開(kāi)的上下文中術(shù)語(yǔ)胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)CS)和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)可以互換使用。

在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基補(bǔ)充非胎兒血清。設(shè)想培養(yǎng)基可以補(bǔ)充至少約1％v/v、至少約2％v/v、至少約3％v/v、至少約4％v/v、至少約5％v/v、至少約6％v/v、至少約7％v/v、至少約8％v/v、至少約9％、至少約10％、至少約11％、至少約12％、至少約13％、至少約14％、至少約15％、至少約16％、至少約17％、至少約18％、至少約19％、至少約20％、至少約21％、至少約22％、至少約23％、至少約24％、至少約25％v/v非胎兒血清。

舉例來(lái)說(shuō)，培養(yǎng)基可以補(bǔ)充哺乳動(dòng)物非胎兒血清。

舉例來(lái)說(shuō)，培養(yǎng)基可以補(bǔ)充人類非胎兒血清。

舉例來(lái)說(shuō)，培養(yǎng)基可以補(bǔ)充新生血清。設(shè)想培養(yǎng)基可以補(bǔ)充至少約1％v/v、至少約2％v/v、至少約3％v/v、至少約4％v/v、至少約5％v/v、至少約6％v/v、至少約7％v/v、至少約8％v/v、至少約9％、至少約10％、至少約11％、至少約12％、至少約13％、至少約14％、至少約15％、至少約16％、至少約17％、至少約18％、至少約19％、至少約20％、至少約21％、至少約22％、至少約23％、至少約24％、至少約25％v/v新生血清。

在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基補(bǔ)充哺乳動(dòng)物新生血清。

舉例來(lái)說(shuō)，培養(yǎng)基可以補(bǔ)充新生牛血清(NBCS)。設(shè)想培養(yǎng)基可以補(bǔ)充至少約1％v/v、至少約2％v/v、至少約3％v/v、至少約4％v/v、至少約5％v/v、至少約6％v/v、至少約7％v/v、至少約8％v/v、至少約9％、至少約10％、至少約11％、至少約12％、至少約13％、至少約14％、至少約15％、至少約16％、至少約17％、至少約18％、至少約19％、至少約20％、至少約21％、至少約22％、至少約23％、至少約24％、至少約25％v/v NBCS。

在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基補(bǔ)充人類新生血清。

舉例來(lái)說(shuō)，細(xì)胞培養(yǎng)基可以補(bǔ)充至少約1％v/v、至少約2％v/v、至少約3％v/v、至少約4％v/v、至少約5％v/v、至少約6％v/v、至少約7％v/v、至少約8％v/v、至少約9％v/v人類新生血清。舉例來(lái)說(shuō)，人類新生血清從臍帶血“臍帶血”獲得。

在一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)基補(bǔ)充成年血清。設(shè)想培養(yǎng)基可以補(bǔ)充至少約1％v/v、至少約2％v/v、至少約3％v/v、至少約4％v/v、至少約5％v/v、至少約6％v/v、至少約7％v/v、至少約8％v/v、至少約9％、至少約10％、至少約11％、至少約12％、至少約13％、至少約14％、至少約15％、至少約16％、至少約17％、至少約18％、至少約19％、至少約20％、至少約21％、至少約22％、至少約23％、至少約24％、至少約25％v/v成年血清。

在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基補(bǔ)充哺乳動(dòng)物成年血清。

舉例來(lái)說(shuō)，細(xì)胞培養(yǎng)基可以補(bǔ)充至少約1％v/v、至少約2％v/v、至少約3％v/v、至少約4％v/v、至少約5％v/v、至少約6％v/v、至少約7％v/v、至少約8％v/v、至少約9％、至少約10％、至少約11％、至少約12％、至少約13％、至少約14％、至少約15％、至少約16％、至少約17％、至少約18％、至少約19％、至少約20％、至少約21％、至少約22％、至少約23％、至少約24％、至少約25％v/v哺乳動(dòng)物成年血清。

舉例來(lái)說(shuō)，細(xì)胞培養(yǎng)基可以補(bǔ)充至少約1％v/v、至少約2％v/v、至少約3％v/v、至少約4％v/v、至少約5％v/v、至少約6％v/v、至少約7％v/v、至少約8％v/v、至少約9％、至少約10％、至少約11％、至少約12％、至少約13％、至少約14％、至少約15％、至少約16％、至少約17％、至少約18％、至少約19％、至少約20％、至少約21％、至少約22％、至少約23％、至少約24％、至少約25％v/v成年牛血清。

在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基補(bǔ)充成人血清。

舉例來(lái)說(shuō)，細(xì)胞培養(yǎng)基可以補(bǔ)充至少約1％v/v、至少約2％v/v、至少約3％v/v、至少約4％v/v、至少約5％v/v、至少約6％v/v、至少約7％v/v、至少約8％v/v、至少約9％v/v成人血清。

舉例來(lái)說(shuō)，細(xì)胞培養(yǎng)基可以補(bǔ)充至少約1％v/v、至少約2％v/v、至少約3％v/v、至少約4％v/v、至少約5％v/v、至少約6％v/v、至少約7％v/v、至少約8％v/v、至少約9％v/v人類AB血清。

在一個(gè)實(shí)例中，細(xì)胞培養(yǎng)基補(bǔ)充至少約3％人類AB血清。

在一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)基補(bǔ)充FCS與NBCS的混合物。

舉例來(lái)說(shuō)，培養(yǎng)基可以補(bǔ)充FCS與NBCS的混合物，使得FCS:NBCS比率為至少約0.4:1、至少約0.5:1、至少約0.6:1、至少約0.7:1、至少約0.8:1、至少約0.9:1、至少約1:1、至少約1.5:1、至少約2:1。

舉例來(lái)說(shuō)，設(shè)想FCS與NBCS的混合物可以占細(xì)胞培養(yǎng)基的至少約1％v/v、至少約2％v/v、至少約3％v/v、至少約4％v/v、至少約5％v/v、至少約6％v/v、至少約7％v/v、至少約8％v/v、至少約9％、至少約10％、至少約11％、至少約12％、至少約13％、至少約14％、至少約15％、至少約16％、至少約17％、至少約18％、至少約19％、至少約20％、至少約21％、至少約22％、至少約23％、至少約24％、至少約25％v/v。然而，在此實(shí)例中，細(xì)胞培養(yǎng)基補(bǔ)充至少約1％v/v、至少約2％v/v、至少約3％v/v、至少約4％v/v、至少約5％v/v、至少約6％v/v、至少約7％v/v、至少約8％v/v、至少約9％v/v，但少于10％v/v FCS。

在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基無(wú)FCS血清。

在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基無(wú)胎兒血清。

在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基補(bǔ)充非胎兒血清。

在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基無(wú)胎兒血清且補(bǔ)充非胎兒血清。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基補(bǔ)充一種或多種選自由以下組成的組的刺激因子：1α,25-二羥基維生素D3(1,25D)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和基質(zhì)衍生因子1α(SDF-1α)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞也可以在足夠支持細(xì)胞生長(zhǎng)的量的至少一種細(xì)胞因子存在下培養(yǎng)。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞在足夠支持細(xì)胞生長(zhǎng)的量的血小板細(xì)胞溶解產(chǎn)物存在下培養(yǎng)。舉例來(lái)說(shuō)，細(xì)胞可以在足夠支持細(xì)胞生長(zhǎng)的量的人類血小板細(xì)胞溶解產(chǎn)物中培養(yǎng)。

在一個(gè)實(shí)例中，細(xì)胞用足夠支持細(xì)胞生長(zhǎng)的量的人類AB血清和人類血小板細(xì)胞溶解產(chǎn)物培養(yǎng)。

本領(lǐng)域普通技術(shù)人員還可以使用以下例示的方法產(chǎn)生表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞。

分析細(xì)胞的治療/預(yù)防潛能

本領(lǐng)域技術(shù)人員將顯而易見(jiàn)用于測(cè)定表達(dá)升高水平Ang1的干細(xì)胞治療或預(yù)防或延遲病癥發(fā)作或進(jìn)展的能力的方法。舉例來(lái)說(shuō)，可以評(píng)估干細(xì)胞增加Ang1水平的能力。

在一個(gè)實(shí)例中，測(cè)試表達(dá)至少0.1μg/10⁶個(gè)細(xì)胞的量的Ang1的未遺傳修飾的干細(xì)胞在體外和/或體內(nèi)增加Ang1表達(dá)的能力。在這些實(shí)例中，在施用表達(dá)升高水平Ang1的干細(xì)胞后評(píng)估細(xì)胞或組織的Ang1表達(dá)的發(fā)展。

熟練技工從上述將顯而易見(jiàn)，本公開(kāi)還提供了一種鑒別或分離細(xì)胞用于治療、預(yù)防或延遲病癥的方法，所述方法包括：

(i)向罹患相關(guān)病癥的受試者施用表達(dá)升高水平Ang1的干細(xì)胞并評(píng)估受試者的病癥的癥狀；

(ii)將(i)中受試者病癥的癥狀與罹患病癥的尚未施用干細(xì)胞的對(duì)照受試者的病癥癥狀或活性比較，其中與對(duì)照受試者比較，測(cè)試受試者中癥狀的改善表明干細(xì)胞治療所述病癥。細(xì)胞可以是本文根據(jù)任何實(shí)例所述的任何細(xì)胞。

實(shí)施例

實(shí)施例1：通過(guò)選擇STRO-3⁺細(xì)胞進(jìn)行MPC免疫選擇

骨髓(BM)是從健康的正常成年志愿者(20-35歲)收獲。簡(jiǎn)單地說(shuō)，從髂后嵴吸出40ml BM到含有肝素鋰抗凝劑的管中。

如先前描述(Zannettino等人Blood,92:2613-2628,1998)，通過(guò)使用Lymphoprep^TM(Nycomed Pharma,Oslo,Norway)進(jìn)行密度梯度分離來(lái)制備骨髓單核細(xì)胞(BMMNC)。在400×g下在4℃下離心30分鐘后，用移液管去除血沉棕黃層，并在由含有5％胎牛血清(FCS,CSL Limited,Victoria,Australia)的漢克氏平衡鹽溶液(Hank’s balanced salt solution，HBSS；Life Technologies,Gaithersburg,MD)構(gòu)成的“HHF”中洗滌三次。

隨后通過(guò)如先前描述的磁性活化細(xì)胞分類(Gronthos等人,Journal of Cell Science116:1827-1835,2003；Gronthos和Simmons,Blood,85,929-940,1995)來(lái)分離STRO-3⁺(或TNAP⁺)細(xì)胞。簡(jiǎn)單地說(shuō)，大約1-3×10⁸BMMNC在由含10％(v/v)正常兔血清的HHF組成的阻斷緩沖液中在冰上培育20分鐘。將細(xì)胞與200μl 10μg/ml STRO-3mAb于阻斷緩沖液中的溶液一起在冰上培育1小時(shí)。隨后細(xì)胞在HHF中通過(guò)在400×g下離心洗滌兩次。添加HHF緩沖液中山羊抗小鼠γ-生物素(Southern Biotechnology Associates,Birmingham,UK)的1/50稀釋液并將細(xì)胞在冰上培育1小時(shí)。將細(xì)胞在MACS緩沖液(補(bǔ)充1％BSA、5mM EDTA和0.01％疊氮化鈉的無(wú)Ca²⁺和Mn²⁺的PBS)中如上洗滌兩次并再懸浮于0.9ml最終體積的MACS緩沖液中。

將100μl抗生蛋白鏈菌素微珠(Miltenyi Biotec；Bergisch Gladbach,Germany)添加到細(xì)胞懸浮液中并在冰上培育15分鐘。將細(xì)胞懸浮液洗滌兩次并再懸浮于0.5ml MACS緩沖液中，且隨后負(fù)載到微型MACS柱(MS Columns,Miltenyi Biotec)上，且用0.5ml MACS緩沖液洗滌三次，以收回不結(jié)合STRO-3mAb(以寄存編號(hào)PTA-7282于2005年12月19日寄存在美國(guó)典型菌種保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)-參見(jiàn)國(guó)際公布WO 2006/108229)的細(xì)胞。添加另外1ml MACS緩沖液后，將柱從磁體去除并通過(guò)正壓分離TNAP⁺細(xì)胞。來(lái)自各洗脫份的細(xì)胞的等分試樣可以用抗生蛋白鏈菌素-FITC染色，并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估純度。

以此方式分離的MPC是STRO-1^亮MPC。

實(shí)施例2：起始培養(yǎng)基-過(guò)程A

具有厄爾平衡鹽(Earle’s balanced salt)的伊格爾氏最低必需培養(yǎng)基(MEM)的α改性通常稱為伊格爾氏αMEM，其含有非必需氨基酸、丙酮酸鈉和其它維生素。這些改性首次描述用于生長(zhǎng)雜交小鼠和倉(cāng)鼠細(xì)胞(Stanners等人,Nat New Biol.,230,52-54,1971)。

適于培養(yǎng)初級(jí)干細(xì)胞的伊格爾氏αMEM培養(yǎng)基可以從多種來(lái)源獲得，包括Life Technologies和Sigma。

建立初級(jí)干細(xì)胞培養(yǎng)物的詳細(xì)方法，包括用于例示過(guò)程中的所需生長(zhǎng)因子，描述于Gronthos和Simmons,Blood,85,929-940,1995中。

在過(guò)程A中，補(bǔ)充10％胎牛血清、L-抗壞血酸-2-磷酸鹽(100μM)、地塞米松(10-7M)和/或無(wú)機(jī)磷酸鹽(3mM)的伊格爾氏αMEM培養(yǎng)基用于培養(yǎng)干細(xì)胞。

實(shí)施例3：改性培養(yǎng)基-過(guò)程B

在過(guò)程B中，通過(guò)以下，來(lái)改性用于過(guò)程A的伊格爾氏αMEM培養(yǎng)基(改性αMEM)：

-將長(zhǎng)效抗壞血酸衍生物L(fēng)-抗壞血酸-2-磷酸鹽替換成短效抗壞血酸衍生物L(fēng)-抗壞血酸鈉(50mg/L)；

-FCS從10％v/v減少到5％v/v；

-補(bǔ)充非胎兒血清(5％v/v)。

表1：過(guò)程A與B之間的差異概述

實(shí)施例4：細(xì)胞培養(yǎng)

間質(zhì)前驅(qū)細(xì)胞(MPC)是從單個(gè)供體獲得并在低溫保存后存儲(chǔ)。

一般地說(shuō)，細(xì)胞培養(yǎng)涉及以下步驟：

將低溫保存的MPC解凍，以10,000個(gè)細(xì)胞/平方厘米接種，并在起始培養(yǎng)基(過(guò)程A；n＝3)或者改性培養(yǎng)基(過(guò)程B；n＝3)中在20％O₂、37℃下生長(zhǎng)到90％匯合。

為了產(chǎn)生條件培養(yǎng)基，將生長(zhǎng)培養(yǎng)基替換成補(bǔ)充FCS的EBM-2基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Lonza)，體積是200μl培養(yǎng)基/平方厘米。將細(xì)胞再培養(yǎng)3天，接著收集培養(yǎng)基并離心，以去除任何細(xì)胞，并將所得上清液收集且存儲(chǔ)在-80℃下。

使用Luminex平臺(tái)，使用市售試劑盒(Millipore)測(cè)量生長(zhǎng)因子濃度。

細(xì)胞培養(yǎng)后，評(píng)估MPC生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)(參見(jiàn)圖1-3)。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程A和B后，未觀測(cè)到細(xì)胞生長(zhǎng)、MPC倍增時(shí)間或群體倍增時(shí)間顯著變化。

MPC還根據(jù)其細(xì)胞標(biāo)記物STRO-1、CC9和STRO-4以及促血管生成生長(zhǎng)因子Ang1和VEGF的表達(dá)水平進(jìn)行表征。

在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程A和B后，MPC中STRO-1、CC9和STRO-4水平是可比的。

然而，培養(yǎng)過(guò)程B：

-增加Ang1水平；

-減少VEGF水平；

-Ang1:VEGF比率與以前證明特別有效地加強(qiáng)血管形成的Ang1:VEGF比率一致。

在過(guò)程A或B中培養(yǎng)的MPC的條件培養(yǎng)基中Ang1和VEGF的水平(μg/10⁶個(gè)細(xì)胞)的測(cè)量展示于表2中。

表2：從單個(gè)供體(三個(gè)復(fù)制品)中獲得的MPC在過(guò)程A和B后的表征

實(shí)施例5：改性培養(yǎng)條件-過(guò)程C和D

為了控制長(zhǎng)效抗壞血酸衍生物L(fēng)-抗壞血酸-2-磷酸鹽替換成短效抗壞血酸衍生物L(fēng)-抗壞血酸鈉，來(lái)自3個(gè)不同供體的MPC連續(xù)在α-MEM+10％FCS+50mg/L L-抗壞血酸鈉(過(guò)程C)或α-MEM+3％人類AB血清+50mg/L L-抗壞血酸鈉(過(guò)程D)+生長(zhǎng)因子(例如PDGF和EGF)中增殖。

在過(guò)程C和D中細(xì)胞培養(yǎng)后評(píng)估Ang1和VEGF水平。在過(guò)程C或D中培養(yǎng)的MPC的條件培養(yǎng)基中Ang1和VEGF的水平(ug/10⁶個(gè)細(xì)胞)展示于表3中。

與過(guò)程C比較，培養(yǎng)過(guò)程D：

-增加Ang1水平；

-減少VEGF水平；

-增加Ang1:VEGF比率。

與過(guò)程A比較，過(guò)程C和D使Ang1的表達(dá)水平逐漸增加。此表明短效抗壞血酸衍生物和非胎兒血清的存在各獨(dú)立地增加Ang1表達(dá)且對(duì)增加Ang1表達(dá)一起展現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)。

表3：來(lái)自3個(gè)不同供體(三個(gè)復(fù)制品)的MPC在過(guò)程C和D后的表征

實(shí)例6：促炎性M1單核細(xì)胞極化成M2表型

從全血免疫選擇CD14+單核細(xì)胞?；贑D16表達(dá)表征單核細(xì)胞群體。5.2％細(xì)胞展現(xiàn)M2型巨噬細(xì)胞的表型特性(CD14⁺CD16⁺)(圖4)。

CD14+單核細(xì)胞與表達(dá)升高水平的Ang1的MPC共培養(yǎng)七天。從兩種獨(dú)立的供體(#023和#009)獲得MPC。

三天共培養(yǎng)后，針對(duì)以下，評(píng)估細(xì)胞：

-CD14、CD16表達(dá)；以及

-回應(yīng)于脂多糖(LPS)的TNF-α分泌。添加1ng/ml LPS，歷時(shí)24小時(shí)(+輸送抑制劑，最終5小時(shí))。

共培養(yǎng)引起：

-產(chǎn)生展現(xiàn)M2型巨噬細(xì)胞的表型特性的巨噬細(xì)胞(CD14⁺CD16⁺CD163⁺CD206⁺)(圖4)；

-預(yù)防巨噬細(xì)胞在發(fā)炎驅(qū)動(dòng)下(LPS)分泌TNFα(圖5)。

共培養(yǎng)7天后，針對(duì)IL-10回應(yīng)于LPS的分泌，評(píng)估細(xì)胞。添加1ng/ml LPS，歷時(shí)24小時(shí)(+輸送抑制劑，最終5小時(shí))。通過(guò)細(xì)胞內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)分析IL-10表達(dá)。通過(guò)與MPC在LPS存在下共培養(yǎng)，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-10(圖6)。

這些數(shù)據(jù)表明表達(dá)升高水平的Ang1的MPC促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞產(chǎn)生(圖7)。

表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞與單獨(dú)或與TNF-α組合的遞增水平的IL-1β一起培養(yǎng)，以評(píng)估這些細(xì)胞因子對(duì)PGE2分泌的作用。

觀測(cè)到IL-1β和TNF-α對(duì)PGE2表達(dá)的累加效應(yīng)(圖8)。

PGE2促進(jìn)Th17細(xì)胞分化成Th2和TReg細(xì)胞以及M1型巨噬細(xì)胞極化成M2型巨噬細(xì)胞(圖7)。在患有例如II型糖尿病等發(fā)炎性疾病的受試者中觀測(cè)到升高的IL-1和TNF-α水平。

因此，回應(yīng)于TNFα和IL1β，PGE2從表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞分泌增加表明表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞可以增加患有發(fā)炎性疾病的受試者中消炎細(xì)胞產(chǎn)生。具體地說(shuō)，表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞可以：

-通過(guò)促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞極化成M2型巨噬細(xì)胞，增加M2型巨噬細(xì)胞產(chǎn)生；和/或

-通過(guò)促進(jìn)Th17細(xì)胞分化增加Th2和Treg產(chǎn)生。

實(shí)例7：膠原蛋白誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎的綿羊模型

表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞施用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的綿羊模型(Thorpe等人Clinical&Exp.Rheumatology,10:143-150(1992))。模型特征在于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的全身性和關(guān)節(jié)發(fā)炎表現(xiàn)。

1.5×10⁸個(gè)低溫保存的綿羊MPC經(jīng)由頸靜脈靜脈內(nèi)施用。

在兩周內(nèi)評(píng)估IL-17和IL-10水平。促炎性和消炎細(xì)胞因子水平的變化展示在(圖9)中。

還在建立疾病后期(第42天)時(shí)施用表達(dá)升高水平的Ang1的干細(xì)胞。施用干細(xì)胞引起關(guān)節(jié)中發(fā)炎細(xì)胞因子的水平降低(圖10)。

實(shí)例8：糖尿病中干細(xì)胞施用

3劑間質(zhì)前驅(qū)細(xì)胞(MPC)的單一靜脈內(nèi)輸注與注射安慰劑對(duì)照的患有二甲雙胍或二甲雙胍加另一種口服藥劑控制不足的2型糖尿病的人類受試者比較。在12周內(nèi)評(píng)估基線HbA1c、IL-6、TNF-α、空腹胰島素、脂肪細(xì)胞因子、骨鈣蛋白和hsCRP的變化。

受試者分成3組(圖11)：

組1：MPC劑量1(0.3×10⁶個(gè)細(xì)胞/公斤)[n＝15]或安慰劑[n＝5]

組2：MPC劑量1(1.0×10⁶個(gè)細(xì)胞/公斤)[n＝15]或安慰劑[n＝5]

組3：MPC劑量1(2.0×10⁶個(gè)細(xì)胞/公斤)[n＝15]或安慰劑[n＝5]

與安慰劑對(duì)照受試者中HbA1c略微增加比較，在MPC治療的受試者中，HbA1c略微降低(表4)。在第8周，與安慰劑對(duì)比，在組2中觀測(cè)到更大程度的HbA1c減少(表4)。在基線HbA1c值≥8％的受試者中觀測(cè)到更大程度的HbA1c減少的趨勢(shì)(圖15)。在第12周45名受試者中的八名(17.8％)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)HbA1c(<7.0％)(圖16)。

與安慰劑對(duì)照受試者比較，在MPC治療的受試者中觀測(cè)到空腹胰島素和脂肪細(xì)胞因子水平改善的趨勢(shì)(圖12)。與安慰劑對(duì)照受試者比較，在MPC治療的受試者中TNF-α和IL-6水平降低，在組3中觀測(cè)到最顯著的降低(圖13)。組3中，TNF-α(圖13)和IL-6(圖14)自基線的變化分別是-0.26pg/ml和-0.47pg/ml(圖13)。

表4：

隨訪獲得的基線HbA1c(％)和自基線的變化的概述。

值是與安慰劑的最小平方平均差(SE)

實(shí)例9：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中干細(xì)胞施用

單次靜脈內(nèi)輸注2劑間質(zhì)前驅(qū)細(xì)胞(MPC)與注射安慰劑對(duì)照的患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的分類為不完全抗TNFα反應(yīng)者的人類受試者或多達(dá)2種其它生物制劑失效的那些受試者相比。

試驗(yàn)中包括的48名受試者是：+RF/抗CCP；>4個(gè)腫脹/觸痛關(guān)節(jié)；ESR/CRP>ULN。

受試者分成兩組：

組1：MPC劑量(1.0×10⁶個(gè)細(xì)胞/公斤)[n＝16]或安慰劑[n＝8]

組2：MPC劑量(2.0×10⁶個(gè)細(xì)胞/公斤)[n＝16]或安慰劑[n＝8]

輸注三個(gè)月后評(píng)估的終點(diǎn)包括：

-TNFα；IL-6(圖17)、IL-17；RANKL；MMP-1、MMP-3、MMP-9；TIMP-1、TIMP-2、TIMP-4和骨鈣蛋白水平。在第0、1、2、4、6、8和10周評(píng)估水平；

-ACR 20(圖18)/50(圖19)/70(圖20)；

-ACR核心組(圖21；圖22)；

-癥狀緩解(疾病活性評(píng)分(DAS28(CRP))<2.6)(圖23)；

-疾病活性評(píng)分自基線的變化(DAS28)；ESR/CRP；HAQ-DI(圖24)；SF-36(癥狀緩解DAS28(CRP)<2.6)；反應(yīng)DAS28(CRP)<3.2；圖23)。

-在第6和第12個(gè)月手/腕x射線。

沒(méi)有與組1相關(guān)的治療相關(guān)嚴(yán)重不良事件(SAE)。在3個(gè)月內(nèi)看到早期和持續(xù)功效。

在第1-12周，在組1中，與安慰劑比較，IL-6水平從基線減少(圖17)。

數(shù)據(jù)證明可高于其它生物制劑的約20％潛在癥狀緩解率(圖23)。

組1的十二周主要終點(diǎn)揭露了比安慰劑改善的反應(yīng)的一致趨勢(shì)。

跟蹤中期分析證明作用在反應(yīng)者中隨著時(shí)間推移持久。

組2進(jìn)行更高單次劑量的測(cè)試。

實(shí)例10：糖尿病性腎病中干細(xì)胞施用

單次靜脈內(nèi)輸注2劑間質(zhì)前驅(qū)細(xì)胞(MPC)與注射安慰劑對(duì)照的患有2型糖尿病和中度至重度慢性腎病的人類受試者相比，所述人類受試者進(jìn)行針對(duì)糖尿病性腎病的ACEi或ARB療法的穩(wěn)定方案。

受試者分成兩組：

組1：MPC劑量1(1.5×10⁸個(gè)細(xì)胞/公斤)[n＝10]或安慰劑[n＝5]

組2：MPC劑量1(3.0×10⁸個(gè)細(xì)胞/公斤)[n＝10]或安慰劑[n＝5]

輸注后3個(gè)月和6個(gè)月評(píng)估的終點(diǎn)：

-測(cè)量GFR(mGFR[99Tc DTPA])(圖25)、估計(jì)GFR(eGFR[MDRD])(圖25)、IL-6(圖26)；和血清肌酸酐水平；

-IL-6與血清肌酸酐水平之間的相關(guān)性(圖27)。

在初始24周的研究時(shí)期內(nèi)，相對(duì)于安慰劑，在MPC治療的受試者中，觀測(cè)到通過(guò)測(cè)量與估計(jì)GFR，保護(hù)或改善腎功能的趨勢(shì)：

-兩種MPC劑量的治療作用類似；

-在基線eGFR>30ml/min/1.73m²的受試者中MPC的治療作用更顯著(圖28)；

-在基線IL-6水平超過(guò)中位數(shù)的受試者中MPC的治療作用更顯著；

-基線IL-6水平與血清肌酸酐的MPC相關(guān)的改善之間顯著相關(guān)(圖27)；

-在MPC組中，對(duì)比安慰劑，第12周血清IL-6水平存在劑量依賴性變化(圖26)。

本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，在不脫離如廣泛描述的本公開(kāi)的精神或范圍下，可對(duì)如特定實(shí)施方案中所示的公開(kāi)內(nèi)容進(jìn)行許多改變和/或修改。因此，本發(fā)明的實(shí)施方案在各個(gè)方面都被認(rèn)為是例示性而非限制性的。

本申請(qǐng)主張于2014年6月10日提出的AU 2014901294和2014年6月13日提出的AU 2014902257的優(yōu)先權(quán)，其公開(kāi)內(nèi)容以引用的方式并入本文中。

本文中論述和/或提及的所有公布都整體并入本文中。

已經(jīng)包括在本說(shuō)明書(shū)內(nèi)的文獻(xiàn)、法案、材料、裝置、論文等的任何論述都僅僅是為了提供本公開(kāi)的背景。并不因?yàn)槿魏位蛩羞@些內(nèi)容在本申請(qǐng)的每個(gè)權(quán)利要求的優(yōu)先權(quán)日前已存在而承認(rèn)其形成現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)的一部分，或是與本公開(kāi)有關(guān)的領(lǐng)域中的公知常識(shí)。