專利名稱：治療代謝相關(guān)病癥的gpr43和其調(diào)節(jié)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過(guò)測(cè)定化合物是否調(diào)節(jié)GPR43功能性來(lái)鑒別代謝穩(wěn)定化合物的方法。因此，本發(fā)明的化合物可用于預(yù)防或治療代謝相關(guān)病癥，諸如低血糖癥、衰老、胰島素抵抗、葡萄糖耐受性異常、糖尿病、高血糖癥、高胰島素血癥、高脂血癥、高甘油三酯血癥、高膽固醇血癥、血脂異常、肥胖癥、X綜合癥、動(dòng)脈粥樣硬化、心臟病、中風(fēng)、高血壓或末梢血管疾病。
背景技術(shù)：
細(xì)胞使用葡萄糖作為主要能量來(lái)源。因此，食物在被利用前首先被身體分解成葡萄糖。隨后，內(nèi)臟將葡萄糖釋放到血液中，導(dǎo)致血糖含量升高。胰島β細(xì)胞對(duì)這種葡萄糖含量升高起反應(yīng)而增加其產(chǎn)量和胰島素分泌。胰島素在血液內(nèi)循環(huán)且充當(dāng)信使，將信號(hào)傳送到胰島素反應(yīng)器官(諸如脂肪組織、肌肉和肝臟)以增加其對(duì)葡萄糖的攝取。以這種方式，血糖升高將伴隨有隨后β細(xì)胞的胰島素分泌的增加。胰島素升高起到使血糖含量回歸正常的作用。在健康個(gè)體中，血糖含量始終保持相當(dāng)恒定。這一稱為血糖量正常(normoglycemia)(正常葡萄糖含量)的平衡狀態(tài)受胰島素嚴(yán)格控制。
在諸如糖尿病的疾病中，這種對(duì)血糖含量的嚴(yán)格調(diào)控喪失，導(dǎo)致于糖尿病患者體內(nèi)所觀察到的血糖含量增加。高血糖狀態(tài)(高葡萄糖含量)可由胰腺β細(xì)胞的胰島素產(chǎn)量不足和/或由目標(biāo)器官(諸如肌肉、肝臟和脂肪)對(duì)葡萄糖的攝取不充分而引起。結(jié)果導(dǎo)致血糖含量增加。因此，可認(rèn)為糖尿病是由兩種類型的異常引起β細(xì)胞的胰島素分泌異常和主要胰島素反應(yīng)器官的胰島素敏感性異常。這種胰島素敏感性異常(也被稱為胰島素抵抗(因?yàn)槠鞴賹?duì)胰島素的作用具有抗性))意味著需要更多胰島素來(lái)使目標(biāo)器官增加其對(duì)葡萄糖的攝取。由于β細(xì)胞需要增加其胰島素分泌來(lái)補(bǔ)償胰島素抵抗，故胰島素抵抗使β細(xì)胞的壓力增加。這是一個(gè)日趨嚴(yán)重的問(wèn)題，其將首先引起葡萄糖耐受性異常，且最終由于胰腺無(wú)法滿足對(duì)于胰島素日益增加的需求而導(dǎo)致胰島素分泌的完全喪失。
糖尿病為一組以導(dǎo)致血糖升高的異常葡萄糖體內(nèi)平衡(abnormal glucosehomeostasis)為特征的病癥的診斷術(shù)語(yǔ)。存在多種類型的糖尿病，但最常見(jiàn)的兩種類型為I型糖尿病，也稱為胰島素依賴型糖尿病或IDDM；和II型糖尿病，也稱為非胰島素依賴型糖尿病或NIDDM。I型糖尿病主要為年輕時(shí)開始的疾病，且是歸因于由免疫系統(tǒng)引起的胰腺中胰島素分泌β細(xì)胞的破壞。在這一情況下，身體無(wú)法識(shí)別胰腺β細(xì)胞自身且破壞其自身細(xì)胞。因β細(xì)胞的破壞而引起胰島素分泌的完全喪失且受此影響的個(gè)體需完全依賴于胰島素存活。II型糖尿病主要為較年長(zhǎng)時(shí)(通常在40歲以后)開始的疾病，但近年來(lái)，年輕人被診斷患有II型糖尿病的情形愈來(lái)愈常見(jiàn)。II型糖尿病主要以胰島素抵抗和β細(xì)胞衰竭為特征，且通常與肥胖癥關(guān)聯(lián)。II型糖尿病比I型糖尿病常見(jiàn)，且全世界所有確診糖尿病病例中有90-95％為II型糖尿病。
使組織長(zhǎng)期面臨高血糖可導(dǎo)致多種并發(fā)癥，包括神經(jīng)病、視網(wǎng)膜病和腎病的微血管問(wèn)題以及中風(fēng)、冠心病和末梢血管疾病的大血管并發(fā)癥。血糖含量的不適當(dāng)控制也是除糖尿病外的其它疾病(諸如肥胖癥和X綜合癥)的特征。舉例而言，X綜合癥的特征之一為胰島素抵抗或葡萄糖不耐受(glucose intolerance)。此外，肥胖癥的特征在于高胰島素血癥和胰島素抵抗，其與NIDDM、高血壓和動(dòng)脈粥樣硬化的特征相同。另外，肥胖癥是引起NIDDM的主要風(fēng)險(xiǎn)因素。30％或30％以上超重的受檢者發(fā)展成NIDDM的風(fēng)險(xiǎn)將增加三倍，且四分之三的NIDDM患者超重。
在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人類中，由熱量攝入與能量支出的失衡引起的肥胖癥與胰島素抵抗和糖尿病高度相關(guān)。然而，肥胖癥-糖尿病綜合癥所涉及的分子機(jī)制仍在研究之中。在肥胖癥發(fā)展的早期，胰島素分泌增加使胰島素抵抗保持平衡且使患者免于高血糖(Le Stunff等人，Diabetes43696-702(1989))。然而，隨時(shí)間的變遷，β細(xì)胞功能衰退，且約20％的肥胖個(gè)體發(fā)展成非胰島素依賴型糖尿病(Pederson，P.，Diab.Metab.Rev.5505-509(1989)，和Brancati，F(xiàn).L.等人，Arch.Intern.Med.159957-963(1999))。在現(xiàn)代社會(huì)，隨著肥胖的日趨流行，肥胖癥因此已成為引起NIDDM的主導(dǎo)風(fēng)險(xiǎn)因素(Hill，J.O.等人，Science2801371-1374(1998))。然而，使一些患者易于對(duì)脂肪積累作出反應(yīng)而改變胰島素分泌的因素尚未可知。不幸的是，治療肥胖癥的有效的長(zhǎng)期療法仍不可行。
糖尿病使全世界數(shù)百萬(wàn)人深受其害。僅在美國(guó)，就有超過(guò)一千八百萬(wàn)的糖尿病患者，同時(shí)每年會(huì)有600,000個(gè)確診的新病例?；继悄虿〉娜藛T將具有較高的罹患心臟病、失明、腎衰竭、感染、肢體截肢(extremity amputation)和其它病況的風(fēng)險(xiǎn)。據(jù)估計(jì)，2002年美國(guó)針對(duì)糖尿病的直接醫(yī)藥支出和間接支出高達(dá)1320億美元?？傊?，糖尿病并發(fā)癥在美國(guó)是死亡的主導(dǎo)原因之一。
確已存在治療糖尿病的療法，諸如α-葡糖苷酶抑制劑、雙胍、噻唑烷二酮(thiazolidinedione)、美格替耐(meglitinide)、磺酰脲和外源性胰島素。然而，這些療法具有有限的效用，且與顯著的安全性和耐受性問(wèn)題相關(guān)，諸如有引起低血糖事件、體重增加、胃腸道功能紊亂和貧血的風(fēng)險(xiǎn)。此外，許多治療選擇都需要注射或每日多次給藥，這存在依從性問(wèn)題。
因此，需要鑒別安全及有效地治療諸如糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化和肥胖癥的代謝相關(guān)病癥的藥劑。本發(fā)明滿足這一需求且也提供相關(guān)優(yōu)勢(shì)。

發(fā)明內(nèi)容
申請(qǐng)者意外地發(fā)現(xiàn)，GPR43在胰島中表達(dá)且在db/db糖尿病患者和ob/ob肥胖小鼠體內(nèi)GPR43上調(diào)。此外，申請(qǐng)者也公開GPR43在分化脂肪細(xì)胞中高度誘導(dǎo)。另外，申請(qǐng)者還公開GPR43的反向激動(dòng)劑或拮抗劑可用于治療代謝相關(guān)病癥，諸如胰島素抵抗、葡萄糖耐受性異常和糖尿病。
第一方面，本發(fā)明提供鑒別代謝穩(wěn)定化合物的方法，其包含a)使候選化合物與GPR43接觸，和b)測(cè)定GPR43功能性是否受到調(diào)節(jié)，其中對(duì)GPR43功能性的調(diào)節(jié)表明候選化合物是代謝穩(wěn)定化合物。在一些實(shí)施例中，所述GPR43為人類GPR43。在一些實(shí)施例中，所述測(cè)定包含第二信使分析。
第二方面，本發(fā)明提供根據(jù)第一方面的方法鑒別的代謝穩(wěn)定化合物。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為GPR43激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為GPR43反向激動(dòng)劑或拮抗劑。
第三方面，本發(fā)明提供制備組合物的方法，其包含鑒別代謝穩(wěn)定化合物，隨后使所述化合物與載劑混合，其中所述化合物是由第一方面的方法鑒別。
第四方面，本發(fā)明提供醫(yī)藥組合物，其包含、基本上由或由第二方面的化合物組成。
第五方面，本發(fā)明提供治療或預(yù)防有此需要的個(gè)體的代謝相關(guān)病癥的方法，其包含向所述個(gè)體投與有效量的第四方面的化合物。在一些實(shí)施例中，所述代謝相關(guān)病癥為低血糖癥、衰老、胰島素抵抗、葡萄糖耐受性異常、糖尿病、高血糖癥、高胰島素血癥、高脂血癥、高甘油三酯血癥、高膽固醇血癥、血脂異常、肥胖癥、X綜合癥、動(dòng)脈粥樣硬化、心臟病、中風(fēng)、高血壓或末梢血管疾病。在一些實(shí)施例中，第五方面的方法進(jìn)一步包含向所述個(gè)體投與有效量的用于治療糖尿病、血脂病癥或肥胖癥的藥劑與有效量的第四方面的化合物的組合。在一些實(shí)施例中個(gè)體為哺乳動(dòng)物，且在一些實(shí)施例中個(gè)體為人類。
第六方面，本發(fā)明提供制造藥物的方法，所述藥物包含用作代謝穩(wěn)定化合物的第四方面化合物；和制造藥物的方法，所述藥物包含用于治療代謝相關(guān)病癥的第四方面化合物。
第七方面，本發(fā)明提供鑒別代謝穩(wěn)定化合物的方法，其包含a)使候選化合物與GPR43接觸，和b)測(cè)定GPR43功能性是否降低，其中GPR43功能性的降低表明候選化合物是代謝穩(wěn)定化合物。在一些實(shí)施例中，所述GPR43為人類GPR43。在一些實(shí)施例中，所述測(cè)定包含第二信使分析。
第八方面，本發(fā)明提供根據(jù)第七方面的方法鑒別的代謝穩(wěn)定化合物。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為GPR43反向激動(dòng)劑或拮抗劑。
第九方面，本發(fā)明提供制備組合物的方法，其包含鑒別代謝穩(wěn)定化合物，隨后使所述化合物與載劑混合，其中所述化合物是由第七方面的方法鑒別。
第十方面，本發(fā)明提供醫(yī)藥組合物，其包含、基本上由或由第二方面的化合物組成。
第十一方面，本發(fā)明提供治療或預(yù)防有此需要的個(gè)體的代謝相關(guān)病癥的方法，其包含向所述個(gè)體投與有效量的第十方面的化合物。在一些實(shí)施例中，所述代謝相關(guān)病癥為胰島素抵抗、葡萄糖耐受性異常、糖尿病、高血糖癥、高胰島素血癥、高脂血癥、高甘油三酯血癥、高膽固醇血癥、血脂異常、肥胖癥、X綜合癥、動(dòng)脈粥樣硬化、心臟病、中風(fēng)、高血壓或末梢血管疾病。在一些實(shí)施例中，所述代謝相關(guān)病癥為胰島素抵抗、葡萄糖耐受性異?；蛱悄虿　Ｔ谝恍?shí)施例中，第十一方面的方法進(jìn)一步包含向所述個(gè)體投與有效量的用于治療糖尿病、血脂病癥或肥胖癥的藥劑與有效量的第十方面的化合物的組合。在一些實(shí)施例中個(gè)體為哺乳動(dòng)物，且在一些實(shí)施例中個(gè)體為人類。
第十二方面，本發(fā)明提供制造藥物的方法，所述藥物包含用作代謝穩(wěn)定化合物的第十方面化合物；和制造藥物的方法，所述藥物包含用于治療代謝相關(guān)病癥的第十方面化合物。
第十三方面，本發(fā)明提供治療或預(yù)防代謝相關(guān)病癥的方法，其包含向有此需要的個(gè)體投與有效量的GPR43調(diào)節(jié)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝相關(guān)病癥為低血糖癥或衰老，且所述調(diào)節(jié)劑為激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝相關(guān)病癥為胰島素抵抗、葡萄糖耐受性異常、糖尿病、高血糖癥、高胰島素血癥、高脂血癥、高甘油三酯血癥、高膽固醇血癥、血脂異常、肥胖癥、X綜合癥、動(dòng)脈粥樣硬化、心臟病、中風(fēng)、高血壓或末梢血管疾病，且所述調(diào)節(jié)劑為反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，第十三方面的方法進(jìn)一步包含向所述個(gè)體投與有效量的用于治療糖尿病、血脂病癥或肥胖癥的藥劑與有效量的GPR43反向激動(dòng)劑或拮抗劑的組合。在一些實(shí)施例中，所述代謝相關(guān)病癥為胰島素抵抗、葡萄糖耐受性異?；蛱悄虿?。
第十四方面，本發(fā)明提供治療或預(yù)防可通過(guò)降低GPR43功能來(lái)治療或預(yù)防的病癥的方法，其包含向有此需要的個(gè)體投與有效量的GPR43反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述病癥為代謝相關(guān)病癥，例如胰島素抵抗、葡萄糖耐受性異常、糖尿病、高血糖癥、高胰島素血癥、高脂血癥、高甘油三酯血癥、高膽固醇血癥、血脂異常、肥胖癥、X綜合癥、動(dòng)脈粥樣硬化、心臟病、中風(fēng)、高血壓或末梢血管疾病。在一些實(shí)施例中，所述代謝相關(guān)病癥為胰島素抵抗、葡萄糖耐受性異?；蛱悄虿　Ｔ谝恍?shí)施例中，所述代謝相關(guān)病癥為II型糖尿病。在一些實(shí)施例中，第十四方面的方法進(jìn)一步包含向所述個(gè)體投與有效量的用于治療糖尿病、血脂病癥或肥胖癥的藥劑與有效量的GPR43反向激動(dòng)劑或拮抗劑的組合。


圖1繪示對(duì)于小鼠成年和胎兒組織和細(xì)胞中小鼠GPR43表達(dá)的Affymetrix基因芯片分析。
圖2繪示對(duì)所選人類組織和細(xì)胞中人類GPR43表達(dá)(上圖)和所選小鼠組織、細(xì)胞和細(xì)胞系中小鼠GPR43表達(dá)(下圖)的RT-PCR分析。
具體實(shí)施例方式
申請(qǐng)者已于本文公開小鼠GPR43在脂肪、大腸和胰島細(xì)胞中高度表達(dá)(參看圖1)，而且與來(lái)自野生型小鼠的胰島相比，小鼠GPR43在從db/db糖尿病患者和ob/ob肥胖小鼠分離的胰島中上調(diào)(參看圖1)。此外，申請(qǐng)者也于本文公開小鼠GPR43在分化3T3-L1脂肪細(xì)胞中高度誘導(dǎo)(參看圖1)。另外，申請(qǐng)者已公開，人類GPR43在包括胰腺的若干個(gè)組織中表達(dá)(參看圖2，上圖)，且小鼠GPR43在若干個(gè)組織和胰島細(xì)胞系中表達(dá)(參看圖2，下圖)。
盡管人類體內(nèi)存在多類受體，但迄今，最豐富且治療相關(guān)的受體類型是由G蛋白偶合受體(GPCR)類所代表。據(jù)估計(jì)，人類基因組內(nèi)存在約30,000-40,000個(gè)基因，且估計(jì)其中有大約2％的基因編碼GPCR。GPCR代表著醫(yī)藥產(chǎn)品研發(fā)的重要領(lǐng)域已由100種已知GPCR中的大約20種研發(fā)出所有處方藥物中的大約60％。
GPCR共有共同的結(jié)構(gòu)基元，其具有七個(gè)含有22至24個(gè)疏水氨基酸的序列，所述序列形成七個(gè)各自跨膜(每一跨越都以數(shù)字標(biāo)識(shí)，意即，跨膜-1(TM-1)、跨膜-2(TM-2)等)的α螺旋?？缒ぢ菪峭ㄟ^(guò)細(xì)胞膜外部或“胞外”側(cè)的跨膜-2與跨膜-3、跨膜-4與跨膜-5和跨膜-6與跨膜-7之間的氨基酸鏈接合(這些分別稱為“胞外”區(qū)域1、2和3(EC-1、EC-2和EC-4))?？缒ぢ菪彩峭ㄟ^(guò)細(xì)胞膜內(nèi)部或“胞內(nèi)”側(cè)的跨膜-1與跨膜-2、跨膜-3與跨膜-4和跨膜-5與跨膜-6之間的氨基酸鏈接合(這些分別稱為“胞內(nèi)”區(qū)域1、2和3(IC-1、IC-2和IC-3))。受體的“羧基”(“C”)端位于細(xì)胞內(nèi)的胞內(nèi)間隙中，而受體的“氨基”(“N”)端位于細(xì)胞外側(cè)的胞外間隙中。
一般說(shuō)來(lái)，當(dāng)配體與受體結(jié)合(通常稱為受體的“活化”)時(shí)，引起受體構(gòu)形的改變，其有助于胞內(nèi)區(qū)域與胞內(nèi)“G-蛋白”之間的偶合。據(jù)報(bào)導(dǎo)，GPCR關(guān)于G蛋白是“混雜的”，意即GPCR可與一種以上的G蛋白相互作用。參看Kenakin，T.，43Life Sciences1095(1988)。盡管也存在其它G蛋白，但目前已鑒別出的G蛋白為Gq、Gs、Gi、Gz和Go。經(jīng)配體活化的GPCR與G蛋白的偶合會(huì)引發(fā)信號(hào)級(jí)聯(lián)過(guò)程(稱為“信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)”)。在正常條件下，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)最終將導(dǎo)致細(xì)胞活化或細(xì)胞抑制。盡管不希望受理論束縛，但認(rèn)為IC-3環(huán)以及受體的羧基端都與G蛋白相互作用。
也存在似乎將數(shù)類GPCR與磷脂酶C路徑偶合的混雜G蛋白(諸如Gα15或Gα16)(Offermanns&Simon，J Biol Chem27015175-80(1995))，或經(jīng)設(shè)計(jì)為使多種不同GPCR與相同路徑(例如磷脂酶C)偶合的嵌合G蛋白(Milligan&Rees，Trends in PharmaceuticalSciences20118-24(1999))。
Gi偶合GPCR降低胞內(nèi)cAMP含量。黑素細(xì)胞技術(shù)(參看下文)可用于鑒別Gi偶合GPCR，而且也可以用于鑒別所述Gi偶合GPCR的調(diào)節(jié)劑。
在生理?xiàng)l件下，GPCR是以兩種不同構(gòu)形之間的平衡存在于細(xì)胞膜中“非活性”狀態(tài)和“活性”狀態(tài)。處于非活性狀態(tài)的受體無(wú)法與胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑連接以引發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而引起生物反應(yīng)。受體構(gòu)形改變成活性狀態(tài)將允許與轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑連接(通過(guò)G蛋白)并產(chǎn)生生物反應(yīng)。
可用配體或化合物(諸如藥物)使受體穩(wěn)定于活性狀態(tài)。最近的發(fā)現(xiàn)(包括但不專門限于對(duì)受體氨基酸序列的修飾)提供除配體或藥物之外的方式以促進(jìn)并穩(wěn)定活性狀態(tài)構(gòu)形的受體。這些方式通過(guò)刺激配體與受體結(jié)合的作用而有效地使受體穩(wěn)定于活性狀態(tài)。由所述不依賴于配體的方式進(jìn)行的穩(wěn)定化作用被稱為“組成性受體活化作用”。
GPR43的序列首先發(fā)表于Sawzdargo等人的文獻(xiàn)中(Sawzdargo等人，Biochem.Biophvs.Res.Comrnun.，239543-547(1997))。Sawzdargo等人使用PCR以基于人類和大鼠甘丙肽(galanin)受體1(GALR1)和大鼠GALR2內(nèi)的保守序列的簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增人類基因組DNA。一種產(chǎn)物含有展示出與一部分人類CD22基因的3-引物區(qū)100％同源的區(qū)段。作者在序列數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒別出與這一區(qū)域重疊且含有新穎GPCR基因GPR43的PAC克隆。無(wú)內(nèi)含子的GPR43基因位于GPR42基因下游大約77Kb處。GPR43編碼具有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的經(jīng)推導(dǎo)具330個(gè)氨基酸的蛋白。GPR43蛋白與GPR40共有28％的氨基酸一致性，但與GALR幾乎無(wú)相似性。此外，GPR43與GPR41共有43％的氨基酸一致性。第三個(gè)家族成員GPR42很可能為GPR41的近期基因副本，且可能為假基因。
GPR43被歸類為孤兒受體(orphan receptor)，意味著尚未鑒別出所述受體的配體。近來(lái)，Brown等人已報(bào)導(dǎo)GPR43是由乙酸根和其它短鏈羧酸陰離子活化(Brown等人，J.Biol.Chem.，27811312-11319(2003))。此外，Brown等人指出GPR43活化G蛋白的Gi、Gq和G12家族。另外，Brown等人報(bào)導(dǎo)已發(fā)現(xiàn)GPR43在諸如嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的免疫細(xì)胞中具有最高含量。
定義由受體引伸而來(lái)的科學(xué)文獻(xiàn)中已采用大量術(shù)語(yǔ)以涉及對(duì)受體具有不同作用的配體。為清晰和一致性起見(jiàn)，本專利文獻(xiàn)中將使用以下定義。
激動(dòng)劑應(yīng)意謂當(dāng)與受體結(jié)合時(shí)活化胞內(nèi)反應(yīng)的物質(zhì)，例如配體或候選化合物。舉例而言，胞內(nèi)反應(yīng)可為增強(qiáng)GTP與膜的結(jié)合，或調(diào)節(jié)諸如cAMP或IP3的第二信使的含量。在一些實(shí)施例中，激動(dòng)劑為先前未知的當(dāng)與受體結(jié)合時(shí)活化胞內(nèi)反應(yīng)的物質(zhì)(例如，增強(qiáng)GTPγS與膜的結(jié)合或降低胞內(nèi)cAMP含量)。在一些實(shí)施例中，激動(dòng)劑為先前未知的當(dāng)與受體結(jié)合時(shí)降低血糖含量的物質(zhì)。術(shù)語(yǔ)激動(dòng)劑也包括部分激動(dòng)劑，其為當(dāng)與受體結(jié)合時(shí)以比完全激動(dòng)劑低的程度或范圍活化胞內(nèi)反應(yīng)的物質(zhì)，例如配體或候選化合物。
拮抗劑應(yīng)意謂在與激動(dòng)劑相同的位點(diǎn)處與受體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，但不活化胞內(nèi)反應(yīng)且可由此抑制由激動(dòng)劑所引起的胞內(nèi)反應(yīng)的物質(zhì)，例如配體或候選化合物。在不存在激動(dòng)劑的情況下，拮抗劑并不會(huì)降低基線胞內(nèi)反應(yīng)。在一些實(shí)施例中，拮抗劑為先前未知的當(dāng)與受體結(jié)合時(shí)與激動(dòng)劑競(jìng)爭(zhēng)以抑制細(xì)胞反應(yīng)的物質(zhì)(例如，其中細(xì)胞反應(yīng)為GTPγS與膜的結(jié)合或胞內(nèi)cAMP含量的降低)。
在本文中抗體旨在涵蓋單克隆抗體和多克隆抗體。術(shù)語(yǔ)抗體進(jìn)一步旨在涵蓋IgG、IgA、IgD、IgE和IgM?？贵w包括完整抗體(其包括單鏈完整抗體)和其抗原結(jié)合片段(其包括Fab、Fab′、F(ab)2和F(ab′)2)。抗體可來(lái)自任何天然或合成來(lái)源，例如來(lái)自人類、鼠類、兔、山羊、豚鼠、倉(cāng)鼠、駱駝、驢、綿羊、馬或雞?？贵w可具有解離常數(shù)或Kd值例如小于5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M和10-15M的結(jié)合親和性。本發(fā)明的抗體可由所屬領(lǐng)域中已知的任何適當(dāng)方法制備。
候選化合物應(yīng)意謂受篩檢技術(shù)檢驗(yàn)的分子(例如化合物)。術(shù)語(yǔ)候選化合物特別排除已知用于調(diào)節(jié)GPR43的任何化合物，例如已知的GPR43激動(dòng)劑。
組合物應(yīng)意謂包含至少兩種化合物或兩種組份的物質(zhì)，例如“醫(yī)藥組合物”為組合物。
化合物功效應(yīng)意謂與受體結(jié)合親和性相對(duì)，化合物抑制或刺激受體功能性的能力的度量。
組成性活化受體應(yīng)意謂經(jīng)受組成性受體活化的受體。
組成性受體活化應(yīng)意謂通過(guò)不同于受體與其內(nèi)源配體或其化學(xué)等效物結(jié)合的方式使受體穩(wěn)定于活性狀態(tài)。
接觸應(yīng)意謂無(wú)論在體外系統(tǒng)或是在體內(nèi)系統(tǒng)中使至少兩個(gè)部分集中在一起。
如本文所使用的糖尿病旨在涵蓋由例如包括以下清單的任何方法所作出的對(duì)糖尿病的常見(jiàn)診斷糖尿病癥狀(例如，多尿、多飲、多食)和大于或等于200mg/dl的隨機(jī)血糖(casual blood glucose)含量，其中隨機(jī)血糖是定義為不考慮飲食消耗時(shí)刻的一天中任何時(shí)間的血糖；或大于或等于126mg/dl的8小時(shí)空腹血糖含量；或經(jīng)口投與75g溶解于水中的無(wú)水葡萄糖后兩小時(shí)大于或等于200mg/dl的血糖含量。此外，如本文所使用的術(shù)語(yǔ)糖尿病包括“前糖尿病”狀態(tài)，美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)(American DiabetesAssociation)將所述“前糖尿病”狀態(tài)定義為100-125mg/dl空腹血糖含量或經(jīng)口投與葡萄糖后兩小時(shí)140-199mg/dl的血糖含量。糖尿病可由若干病況促成，例如包括β胰島細(xì)胞的自體免疫破壞、β細(xì)胞凋亡或妊娠(妊娠期糖尿病(gestational diabete))。
內(nèi)源性應(yīng)意謂哺乳動(dòng)物天然產(chǎn)生的物質(zhì)。關(guān)于(例如且不限于)術(shù)語(yǔ)“受體”的內(nèi)源性應(yīng)意謂哺乳動(dòng)物(例如且不限于人類)或病毒天然產(chǎn)生的物質(zhì)。相反，在本文中，術(shù)語(yǔ)非內(nèi)源性應(yīng)意謂并非由哺乳動(dòng)物(例如且不限于人類)或病毒天然產(chǎn)生的物質(zhì)。舉例而言且不限于，內(nèi)源形式不具組成性活性但在經(jīng)操縱后變得具有組成性活性的受體最優(yōu)選在本文中稱為“非內(nèi)源性組成性活化受體”。兩種術(shù)語(yǔ)都可用于描述“體內(nèi)”和“體外”系統(tǒng)。舉例而言且不限于，在篩檢方法中，內(nèi)源性或非內(nèi)源性受體都可與體外篩檢系統(tǒng)相關(guān)。
有效量意謂于組織、系統(tǒng)或個(gè)體中引起研究人員或醫(yī)師或其它臨床醫(yī)師所尋求的所需生物或醫(yī)學(xué)反應(yīng)的活性化合物或醫(yī)藥組合物的量。舉例而言，有效劑量可為可治療代謝相關(guān)病癥的量。舉例而言，有效劑量也可為可預(yù)防代謝相關(guān)病癥的量。
如本文所使用的葡萄糖耐受性異常(IGT)旨在表明與胰島素抵抗相關(guān)的病況，其為明顯2型糖尿病(frank type 2 diabete)與正常葡萄糖耐受(NGT)之間的中間病況。IGT是通過(guò)以下程序診斷當(dāng)通過(guò)2小時(shí)餐后血漿葡萄糖含量評(píng)定時(shí)，受感染人員的餐后葡萄糖反應(yīng)經(jīng)測(cè)定為異常。在這一測(cè)試中，將被測(cè)數(shù)量的葡萄糖提供給患者，且以規(guī)律間隔測(cè)量血糖含量，通常為前兩小時(shí)每半小時(shí)且此后每小時(shí)進(jìn)行測(cè)量。在“正?！被蚍荌GT個(gè)體中，葡萄糖含量在前兩小時(shí)中升高到小于140mg/dl的含量，隨后迅速下降。在IGT個(gè)體中，血糖含量較高且以較慢速率逐漸下降。
如本文所使用的需要預(yù)防或治療是指由護(hù)理人員(例如，在人類的情況下為醫(yī)師、護(hù)士、護(hù)理從業(yè)人員等；在動(dòng)物、包括非人類哺乳動(dòng)物的情況下為獸醫(yī))所作的關(guān)于個(gè)體或動(dòng)物需要治療或?qū)闹委煫@益的判斷。這一判斷是基于護(hù)理人員的專業(yè)知識(shí)領(lǐng)域內(nèi)的多種因素作出，且所述多種因素包括有關(guān)個(gè)體或動(dòng)物因可由本發(fā)明化合物治療的病況而生病或即將生病的知識(shí)。
如本文所使用的個(gè)體是指任何動(dòng)物，包括哺乳動(dòng)物，優(yōu)選為小鼠、大鼠、其它嚙齒動(dòng)物、兔、狗、貓、豬、牛、綿羊、馬或靈長(zhǎng)類動(dòng)物且最優(yōu)選為人類。
與術(shù)語(yǔ)“反應(yīng)”有關(guān)聯(lián)的抑制應(yīng)意謂，與不存在化合物的情況相比，在化合物存在下反應(yīng)被降低或阻止。
如本文所述的胰島素抵抗旨在涵蓋由多種方法中的任一種所作出的關(guān)于胰島素抵抗的常見(jiàn)診斷，所述方法包括(但不限于)靜脈內(nèi)葡萄糖耐受性測(cè)試或空腹胰島素含量的測(cè)量。眾所周知，空腹胰島素含量的高度與胰島素抵抗的程度之間存在良好的相關(guān)性。因此，出于確認(rèn)哪些正常葡萄糖耐受(NGT)個(gè)體具有胰島素抵抗的目的，可使用空腹胰島素含量升高作為胰島素抵抗的替代標(biāo)志。也可以使用正常血糖胰島素鉗夾測(cè)試(euglycemic glucose clamp test)對(duì)胰島素抵抗進(jìn)行診斷。
反向激動(dòng)劑意謂與內(nèi)源形式或組成性活化形式的受體結(jié)合以便降低在不存在激動(dòng)劑時(shí)所觀察的受體的基線胞內(nèi)反應(yīng)的物質(zhì)，例如配體或候選化合物。舉例而言，胞內(nèi)反應(yīng)可為調(diào)節(jié)GTP與膜的結(jié)合，或調(diào)節(jié)諸如cAMP或IP3的第二信使的含量。在一些實(shí)施例中，反向激動(dòng)劑為先前未知的降低不存在激動(dòng)劑時(shí)所觀察的受體基線胞內(nèi)反應(yīng)的物質(zhì)。
配體應(yīng)意謂對(duì)天然存在的內(nèi)源性受體特異的天然存在的內(nèi)源性分子。
代謝相關(guān)病癥意謂代謝病癥。舉例而言，如本文所使用的代謝相關(guān)病癥旨在包括低血糖癥、衰老、胰島素抵抗、葡萄糖耐受性異常、糖尿病、高血糖癥、高胰島素血癥、高脂血癥、高甘油三酯血癥、高膽固醇血癥、血脂異常、肥胖癥、X綜合癥、動(dòng)脈粥樣硬化、心臟病、中風(fēng)、高血壓或末梢血管疾病。
代謝穩(wěn)定化合物旨在意謂穩(wěn)定代謝參數(shù)的化合物。代謝參數(shù)包括對(duì)于代謝的任何度量，諸如脂質(zhì)、糖、酶或?qū)Υx過(guò)程起反應(yīng)的其它蛋白的含量。舉例而言，代謝穩(wěn)定化合物可穩(wěn)定個(gè)體的血糖含量。
如本文所使用的術(shù)語(yǔ)調(diào)節(jié)應(yīng)意謂是指特定活性、功能或分子的量、品質(zhì)、反應(yīng)或作用的增加或降低。GPR43調(diào)節(jié)劑為調(diào)節(jié)GPR43受體的藥劑。
醫(yī)藥組合物應(yīng)意謂包含至少一種化合物和醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑的組合物。舉例而言，醫(yī)藥組合物可包含至少一種活性成份，借此使組合物可受對(duì)于動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物，諸如人類)體內(nèi)指定有效結(jié)果的調(diào)查的檢驗(yàn)。基于技術(shù)人員的需要，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將理解和了解適于測(cè)定活性成份是否具有所需有效結(jié)果的技術(shù)。
受體功能性應(yīng)該是指受體接收刺激物且調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)作用的正常運(yùn)作，其包括(但不限于)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、調(diào)控離子的流入或流出、實(shí)現(xiàn)催化反應(yīng)和/或通過(guò)G蛋白調(diào)節(jié)活性。舉例而言，GPR43功能性可為結(jié)合諸如Gi、Gq或G12的G蛋白；通過(guò)諸如cAMP、IP3或鈣的第二信使進(jìn)行信號(hào)傳輸；與GPR43特異性抗體結(jié)合；或與諸如GPR43激動(dòng)劑的化合物結(jié)合。
第二信使應(yīng)意謂由受體活化所引起的胞內(nèi)反應(yīng)。舉例而言，第二信使可包括三磷酸肌醇(IP3)、二酰基甘油(DAG)、環(huán)AMP(cAMP)、環(huán)GMP(cGMP)和Ca2+。可測(cè)量第二信使反應(yīng)以測(cè)定受體活化。此外，可測(cè)量第二信使反應(yīng)以直接鑒別候選化合物，其例如包括反向激動(dòng)劑、部分激動(dòng)劑、激動(dòng)劑和拮抗劑。
本發(fā)明提供鑒別代謝穩(wěn)定化合物的方法，其包含a)使候選化合物與GPR43接觸，和b)測(cè)定GPR43功能性是否受到調(diào)節(jié)，其中對(duì)GPR43功能性的調(diào)節(jié)表明候選化合物是代謝穩(wěn)定化合物。
如本文所使用的“GPR43”是指具有如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的多肽，或所述序列實(shí)質(zhì)上保留具有如SEQ ID NO2所提及的氨基酸序列的多肽的功能的變異體或同源物。
應(yīng)了解，可在不損害功能的情況下對(duì)GPR43進(jìn)行有限變異或修飾。舉例而言，GPR43旨在包括其它GPR43多肽，例如人類GPR43多肽的哺乳動(dòng)物物種同源物。數(shù)據(jù)庫(kù)中存在人類GPR43的物種同源物的核苷酸和氨基酸序列，例如，GPR43的小鼠同源物可以寄存編號(hào)第NM_146187號(hào)見(jiàn)于GenBank中，且GPR43的大鼠同源物可以寄存編號(hào)第AB106675號(hào)見(jiàn)于GenBank中。此外，GPR43包括GPR43的變異體，諸如對(duì)偶基因變異體、剪接變異體和保守氨基酸取代變異體。舉例而言，GPR43包括實(shí)質(zhì)上保留野生型GPR43多肽的功能的變異體，所述功能例如為通過(guò)G-αi、G-αq或G-α12進(jìn)行信號(hào)傳輸?shù)哪芰Α⑴cGPR43特異性抗體結(jié)合的能力或與諸如已知配體或激動(dòng)劑的化合物結(jié)合的能力。GPR43變異體無(wú)需與野生型GPR43起到相同程度的作用，而且也無(wú)需含有野生型GPR43的每一種功能。
可使用可用算法和程序(諸如基本局部比對(duì)搜索工具(Basic Local Alignment SearchTool，“BLAST”))使用默認(rèn)設(shè)置將氨基酸序列的保守和非保守氨基酸改變、缺失和插入與參考序列相比較[例如參看Karlin和Altschul，Proc Natl Acad Sci USA(1990)872264-8；Altschul等人，J Mol Biol(1990)215403-410；Altschul等人，Nature Genetics(1993)3266-72；和Altschul等人，Nucleic Acids Res(1997)253389-3402]。
應(yīng)了解，所述定義中包括實(shí)質(zhì)上保留整個(gè)多肽的功能的GPR43片段。舉例而言，可使用GPR43的信號(hào)產(chǎn)生結(jié)構(gòu)域或GPR43的化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域代替整個(gè)多肽。此外，GPR43可含有異源序列，諸如抗原決定部位標(biāo)簽或其它融合多肽。另外，GPR43可含有標(biāo)記，例如放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記或酶標(biāo)記。
在一實(shí)施例中，可使用與SEQ ID NO2具有99％、98％、95％、92％、90％、85％、80％或75％序列一致性的多肽來(lái)應(yīng)用本發(fā)明的方法。
在一些實(shí)施例中，所述GPR43變異體為GPR43的非內(nèi)源性、組成性活化突變體。在一實(shí)施例中，所述GPR43是來(lái)源于哺乳動(dòng)物。在另一實(shí)施例中，所述GPR43是人類GPR43。
在某些實(shí)施例中，所述GPR43為重組體。在某些實(shí)施例中，所述接觸包含與表達(dá)GPCR的宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞膜接觸，其中所述宿主細(xì)胞包含表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含編碼受體的聚核苷酸。在一些實(shí)施例中，所述接觸是在已知的GPCR激動(dòng)劑存在下進(jìn)行。
在某些實(shí)施例中，所述方法進(jìn)一步包含以下步驟將由候選化合物引起的受體調(diào)節(jié)與通過(guò)使受體與受體的已知調(diào)節(jié)劑接觸所引起的另一受體調(diào)節(jié)相比較。在某些實(shí)施例中，所述已知調(diào)節(jié)劑為激動(dòng)劑。
在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為血糖穩(wěn)定化合物。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為胰島素分泌調(diào)節(jié)劑。
在一些實(shí)施例中，所述測(cè)定包含第二信使分析，例如，測(cè)定是通過(guò)測(cè)量與包含所述GPCR的膜結(jié)合的GTPγS進(jìn)行。在某些實(shí)施例中，所述GTPγS是經(jīng)[35S]標(biāo)記。在某些實(shí)施例中，所述測(cè)定是通過(guò)測(cè)量選自由下列各物組成的群組的第二信使的含量進(jìn)行環(huán)AMP(cAMP)、環(huán)GMP(cGMP)、三磷酸肌醇(IP3)、二?；视?DAG)、MAP激酶活性和鈣(Ca2+)。在某些實(shí)施例中，所述第二信使為cAMP。在某些實(shí)施例中，所述對(duì)cAMP的測(cè)量是使用全細(xì)胞腺苷酰基環(huán)化酶分析進(jìn)行。在某些實(shí)施例中，所述對(duì)cAMP的測(cè)量是用包含所述GPCR的膜進(jìn)行。在某些實(shí)施例中，所述測(cè)定是通過(guò)測(cè)量胞內(nèi)IP3進(jìn)行。在某些實(shí)施例中，所述第二信使為MAP激酶活性。在一些實(shí)施例中，所述測(cè)定是通過(guò)CRE報(bào)告基因分析進(jìn)行。在某些實(shí)施例中，所述報(bào)告基因?yàn)闊晒馑孛?。在一些?shí)施例中，所述報(bào)告基因?yàn)棣?半乳糖苷酶。在某些實(shí)施例中，所述測(cè)定或所述比較是通過(guò)例如使用FLIPR分析測(cè)量胞內(nèi)鈣(Ca2+)進(jìn)行。
在一些實(shí)施例中，所述測(cè)定是通過(guò)測(cè)量從哺乳動(dòng)物獲得的脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取進(jìn)行。
在某些實(shí)施例中，所述測(cè)定是通過(guò)使用黑素細(xì)胞分析進(jìn)行。
在本發(fā)明的方法中，可進(jìn)行對(duì)照反應(yīng)以展示反應(yīng)的特異性。舉例而言，可將經(jīng)模擬轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(mock-transfected cell)與經(jīng)GPR43轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比較以展示對(duì)GPR43受體的反應(yīng)的特異性。
在本發(fā)明的方法中，在某些實(shí)施例中，所述候選化合物不是抗體或其抗原結(jié)合衍生物。在某些實(shí)施例中，所述候選化合物不是肽。在某些實(shí)施例中，所述候選化合物不是多肽。
如上所述，受體功能性是指受體接收刺激物且調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)作用的正常運(yùn)作，其包括(但不限于)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、調(diào)控離子的流入或流出、實(shí)現(xiàn)催化反應(yīng)和/或通過(guò)G蛋白調(diào)節(jié)活性。舉例而言，GPR43功能性可為結(jié)合諸如Gi、Gq或G12的G蛋白；通過(guò)諸如cAMP、IP3或鈣的第二信使進(jìn)行信號(hào)傳輸；與GPR43特異性抗體結(jié)合；或與諸如GPR43激動(dòng)劑的化合物結(jié)合。
在本發(fā)明的方法中，測(cè)定可包含第二信使分析。例如可通過(guò)測(cè)量第二信使的含量來(lái)確定胞內(nèi)信號(hào)的起始，所述第二信使諸如為環(huán)AMP(cAMP)、環(huán)GMP(cGMP)、三磷酸肌醇(IP3)、二?；视?DAG)、MAP激酶或鈣。所屬領(lǐng)域中眾所周知用于測(cè)量這些第二信使的若干分析，例如cAMP分析、IP3分析、FLIPR分析、黑素細(xì)胞分析或CRE-報(bào)告基因分析。此外，本文的實(shí)例6-11中公開第二信使分析的實(shí)例。在某些實(shí)施例中，所述第二信使為cAMP。在其它實(shí)施例中，所述第二信使為IP3。在其它實(shí)施例中，所述第二信使為鈣。
在一實(shí)施例中，所述測(cè)定是通過(guò)測(cè)量與包含所述GPCR的膜結(jié)合的GTPγS進(jìn)行。這些分析已為所屬領(lǐng)域中眾所周知，且于本文的實(shí)例6和8中加以例示說(shuō)明。在某些實(shí)施例中，所述GTPγS是經(jīng)[35S]標(biāo)記。
本發(fā)明也涉及可根據(jù)以下方法鑒別的代謝穩(wěn)定化合物a)使候選化合物與GPR43接觸，和b)測(cè)定GPR43功能性是否受到調(diào)節(jié)，其中對(duì)GPR43功能性的調(diào)節(jié)表明候選化合物是代謝穩(wěn)定化合物。
舉例而言，本發(fā)明提供可根據(jù)以下方法鑒別的代謝穩(wěn)定化合物a)使候選化合物與GPR43接觸，和b)測(cè)定GPR43功能性是否受到調(diào)節(jié)，其中對(duì)GPR43功能性的調(diào)節(jié)表明候選化合物是代謝穩(wěn)定化合物。
在一實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為GPR43激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述激動(dòng)劑為先前未知的當(dāng)與GPR43受體結(jié)合時(shí)活化胞內(nèi)反應(yīng)的物質(zhì)。
在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為EC50小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的GPR43激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為EC50具有選自1nM至10μM的區(qū)間內(nèi)的值的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為EC50具有選自1nM至1μM的區(qū)間內(nèi)的值的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為EC50具有選自1nM至100nM的區(qū)間內(nèi)的值的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為EC50具有選自1nM至10nM的區(qū)間內(nèi)的值的激動(dòng)劑。
在某些實(shí)施例中，所述EC50是使用選自由以下分析組成的群組的分析測(cè)定IP3分析，其是使用表達(dá)重組GPR43多肽的經(jīng)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞進(jìn)行；和黑素細(xì)胞分析，其是使用表達(dá)重組GPR43多肽的經(jīng)轉(zhuǎn)染黑素細(xì)胞進(jìn)行。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于10μM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于9μM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于8μM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于7μM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于6μM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于5μM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于4μM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于3μM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于2μM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于1μM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于900nM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于800nM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于700nM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于600nM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于500nM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于400nM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于300nM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于200nM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于100nM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于90nM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于80nM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于70nM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于60nM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于50nM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于40nM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于30nM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于20nM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于10nM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50具有選自1nM至10μM的區(qū)間內(nèi)的值的激動(dòng)劑。在某些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50具有選自1nM至1μM的區(qū)間內(nèi)的值的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50具有選自1nM至100nM的區(qū)間內(nèi)的值的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50具有選自1nM至10nM的區(qū)間內(nèi)的值的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物對(duì)GPCR具有選擇性。
在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為GPR43反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為IC50小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的GPR43反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為IC50具有選自1nM至10μM的區(qū)間內(nèi)的值的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為IC50具有選自1nM至1μM的區(qū)間內(nèi)的值的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為IC50具有選自1nM至100nM的區(qū)間內(nèi)的值的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在某些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為IC50具有選自1nM至10nM的區(qū)間內(nèi)的值的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。
在某些實(shí)施例中，所述IC50是使用選自由以下分析組成的群組的分析測(cè)定IP3分析，其是使用表達(dá)重組GPR43多肽的經(jīng)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞進(jìn)行；和黑素細(xì)胞分析，其是使用表達(dá)重組GPR43多肽的經(jīng)轉(zhuǎn)染黑素細(xì)胞進(jìn)行。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于10μM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于9μM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于8μM的反向反向激動(dòng)劑或拮抗劑或反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于7μM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于6μM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于5μM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于4μM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于3μM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于2μM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于1μM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于900nM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于800nM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于700nM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于600nM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于500nM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于400nM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于300nM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于200nM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于100nM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于90nM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于80nM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于70nM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于60nM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于50nM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于40nM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于30nM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于20nM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于10nM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50具有選自1nM至10μM的區(qū)間內(nèi)的值的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50具有選自1nM至1μM的區(qū)間內(nèi)的值的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50具有選自1nM至100nM的區(qū)間內(nèi)的值的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50具有選自1nM至10nM的區(qū)間內(nèi)的值的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物對(duì)GPCR具有選擇性。
在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物可經(jīng)口服生物利用。在一些實(shí)施例中，相對(duì)于腹膜內(nèi)投藥而言，所述口服生物利用度為至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些實(shí)施例中，相對(duì)于腹膜內(nèi)投藥而言，所述口服生物利用度為至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些實(shí)施例中，所述可經(jīng)口服生物利用的代謝穩(wěn)定化合物另外能夠穿越血腦屏障。
此外，本發(fā)明提供用于制備組合物的方法，其包含鑒別代謝穩(wěn)定化合物，隨后使所述化合物與載劑混合，其中所述化合物可通過(guò)以下方法鑒別a)使候選化合物與GPR43接觸，和b)測(cè)定GPR43功能性是否受到調(diào)節(jié)，其中對(duì)GPR43功能性的調(diào)節(jié)表明候選化合物是代謝穩(wěn)定化合物。舉例而言，本發(fā)明提供用于制備組合物的方法，其包含鑒別代謝穩(wěn)定化合物，隨后使所述化合物與載劑混合，其中所述化合物是通過(guò)以下方法鑒別a)使候選化合物與GPR43接觸，和b)測(cè)定GPR43功能性是否受到調(diào)節(jié)，其中對(duì)GPR43功能性的調(diào)節(jié)表明候選化合物是代謝穩(wěn)定化合物。
本發(fā)明還提供醫(yī)藥組合物，其包含、基本上由或由可根據(jù)以下方法鑒別的代謝穩(wěn)定化合物組成a)使候選化合物與GPR43接觸，和b)測(cè)定GPR43功能性是否受到調(diào)節(jié)，其中對(duì)GPR43功能性的調(diào)節(jié)表明候選化合物是代謝穩(wěn)定化合物。
可使用所屬領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)將化合物調(diào)配成醫(yī)藥組合物。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員可用除本文所提及的那些載劑外的適當(dāng)醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑；例如參看Remington′sPharmaceutical Sciences，第16版，1980，Mack Publishing Co.，(Oslo等人編輯)。
盡管在替代使用中可能以化學(xué)原料或純化學(xué)物質(zhì)的形式投與由本發(fā)明的方法所鑒別的化合物以用于預(yù)防或治療，但提供另外包含醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑的醫(yī)藥調(diào)配物或組合物形式的化合物或活性成份也是有用的。
因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供醫(yī)藥調(diào)配物，其包含由本發(fā)明的方法鑒別的化合物或其醫(yī)藥學(xué)上可接受的鹽或衍生物連同一種或一種以上其醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑和/或預(yù)防成份。在載劑可與調(diào)配物中的其它成份相容且不會(huì)對(duì)其接受者過(guò)度有害的意義上來(lái)說(shuō)，載劑是“可接受的”。
醫(yī)藥調(diào)配物包括適于經(jīng)口、經(jīng)直腸、經(jīng)鼻、經(jīng)局部(包括口腔和舌下)、經(jīng)陰道或不經(jīng)腸(包括肌內(nèi)、皮下和靜脈內(nèi))投藥或?yàn)檫m于經(jīng)吸入或吹入投藥的形式的醫(yī)藥調(diào)配物。
因此，可將本發(fā)明的化合物連同常規(guī)佐劑、載劑或稀釋劑一起放置成醫(yī)藥調(diào)配物和其單位劑量的形式，且在所述形式下其可以下列形式使用經(jīng)口使用的固體形式(諸如片劑或填充膠囊)或液體形式(諸如溶液、懸浮液、乳液、酏劑、凝膠或填充有所述物質(zhì)的膠囊)、經(jīng)直腸投藥的栓劑形式或不經(jīng)腸(包括皮下)使用的無(wú)菌注射溶液形式。在有或沒(méi)有其它活性化合物或成份的情況下，這些醫(yī)藥組合物和其單位劑型都可包含常規(guī)比例的常規(guī)成份，且所述單位劑型可含有與打算使用的每日劑量范圍相稱的任何適當(dāng)有效量的活性成份。
對(duì)于經(jīng)口投藥而言，醫(yī)藥組合物可為例如片劑、膠囊、懸浮液或液體的形式?？蓪⑨t(yī)藥組合物制成含有特定量的活性成份的劑量單位的形式。所述劑量單位的實(shí)例為膠囊、片劑、粉劑、顆粒劑或懸浮液，其具有常規(guī)添加劑，諸如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或馬鈴薯淀粉；粘合劑，諸如結(jié)晶纖維素、纖維素衍生物、阿拉伯膠、玉米淀粉或明膠；崩解劑，諸如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉或羧甲基纖維素鈉；和潤(rùn)滑劑，諸如滑石或硬脂酸鎂。也可通過(guò)以組合物形式注射來(lái)投與活性成份，例如在所述組合物中可將生理食鹽水、右旋糖或水用作適當(dāng)?shù)尼t(yī)藥學(xué)上可接受的載劑。
本發(fā)明提供治療或預(yù)防有此需要的個(gè)體的代謝相關(guān)病癥的方法，其包含向所述個(gè)體投與有效量的根據(jù)以下方法鑒別的化合物a)使候選化合物與GPR43接觸，和b)測(cè)定GPR43功能性是否受到調(diào)節(jié)，其中對(duì)GPR43功能性的調(diào)節(jié)表明候選化合物是代謝穩(wěn)定化合物。在一些實(shí)施例中，所述代謝相關(guān)病癥為低血糖癥、衰老、胰島素抵抗、葡萄糖耐受性異常、糖尿病、高血糖癥、高胰島素血癥、高脂血癥、高甘油三酯血癥、高膽固醇血癥、血脂異常、肥胖癥、X綜合癥、動(dòng)脈粥樣硬化、心臟病、中風(fēng)、高血壓或末梢血管疾病。在一些實(shí)施例中，所述代謝相關(guān)病癥為II型糖尿病。在一實(shí)施例中，所投與的化合物包含GPR43反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一實(shí)施例中，所述方法進(jìn)一步包含向所述個(gè)體投與有效量的用于治療糖尿病、血脂病癥或肥胖癥的藥劑與有效量的醫(yī)藥組合物的組合，所述醫(yī)藥組合物包含、基本上由或由根據(jù)以下方法鑒別的代謝穩(wěn)定化合物組成a)使候選化合物與GPR43接觸，和b)測(cè)定GPR43功能性是否受到調(diào)節(jié)，其中對(duì)GPR43功能性的調(diào)節(jié)表明候選化合物是代謝穩(wěn)定化合物。舉例而言，在一實(shí)施例中，所述方法進(jìn)一步包含向所述個(gè)體投與有效量的用于治療糖尿病、血脂病癥或肥胖癥的藥劑與有效量的含有GPR43反向激動(dòng)劑的醫(yī)藥組合物的組合。在一實(shí)施例中個(gè)體為哺乳動(dòng)物，且在另一實(shí)施例中個(gè)體為人類。在一實(shí)施例中，所述代謝相關(guān)病癥為低血糖癥且所述所投與的化合物包含GPR43激動(dòng)劑。
如本文所用的關(guān)于病癥的術(shù)語(yǔ)“治療”意謂使與特定病癥相關(guān)的一種或一種以上癥狀的嚴(yán)重程度降低。因此，治療病癥未必意謂使與病癥相關(guān)的所有癥狀的嚴(yán)重程度都降低，且未必意謂使與病癥相關(guān)的一種或一種以上癥狀的嚴(yán)重程度完全降低。類似地，術(shù)語(yǔ)“預(yù)防”意謂對(duì)與特定病癥相關(guān)的一種或一種以上癥狀的發(fā)生或發(fā)作的預(yù)防，且未必意謂對(duì)病癥的完全預(yù)防。本發(fā)明的方法可用于治療代謝相關(guān)病癥，例如包括糖尿病。
當(dāng)使用本發(fā)明的方法所鑒別的化合物時(shí)，劑量可于廣泛界限內(nèi)變化，并且作為醫(yī)師的慣例且如其所知，將針對(duì)每一個(gè)別病例中的個(gè)別情況定制劑量。舉例而言，其取決于待治療的疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度、患者的情況、所使用的化合物、進(jìn)行治療或預(yù)防的病狀為急性或慢性或除本發(fā)明方法所鑒別的化合物外是否投與其它活性化合物。本發(fā)明的代表性劑量包括約0.01mg至約1000mg、約0.01mg至約750mg、約0.01mg至約500mg、0.01mg至約250mg、0.01mg至約200mg、約0.01mg至150mg、約0.01mg至約100mg和約0.01mg至約75mg?？稍谝惶熘型杜c多次劑量(例如2、3或4次劑量)，尤其是當(dāng)認(rèn)為需要相對(duì)大量時(shí)。適當(dāng)時(shí)，視個(gè)體行為而定和適當(dāng)時(shí)由患者的醫(yī)師或護(hù)理人員決定，可能需要上調(diào)或下調(diào)每日劑量。
治療用所需的活性成份或其活性鹽或衍生物的量不僅將隨所選擇的特定鹽而變化，而且也隨投藥途徑、所治療的病況的性質(zhì)和患者的年齡和情況而變化，且最終將取決于主治醫(yī)師或臨床醫(yī)師的判斷。一般說(shuō)來(lái)，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解怎樣由模型系統(tǒng)、通常為動(dòng)物模型中獲得的體內(nèi)數(shù)據(jù)外推至另一模型，諸如人類。動(dòng)物模型通常包括(但不限于)嚙齒動(dòng)物糖尿病模型(其它動(dòng)物模型已由Reed和Scribner于Diabetes，Obesity andMetabolism，175-86(1999)中進(jìn)行報(bào)導(dǎo))。在一些情況下，這些外推可僅基于動(dòng)物模型與另一動(dòng)物模型(諸如哺乳動(dòng)物，例如人類)的體重比較，然而，更常見(jiàn)的是，這些外推并非簡(jiǎn)單地基于體重，而是并入多種因素考慮。代表性因素包括患者的類型、年齡、體重、性別、飲食和健康情況、疾病的嚴(yán)重程度、投藥途徑、所使用的特定化合物的藥理學(xué)考慮(諸如活性、功效、藥物動(dòng)力學(xué)和毒理學(xué)概況)、是否利用藥物傳遞系統(tǒng)、進(jìn)行治療或預(yù)防的病狀為急性或慢性或除本發(fā)明的方法所鑒別且作為藥物組合的部分的化合物外是否投與其它活性化合物。用于以本發(fā)明的化合物和/或組合物治療疾病病況的劑量方案是根據(jù)上文所述的多種因素選擇。因此，所用的實(shí)際劑量方案可廣泛變化，且因此可偏離優(yōu)選劑量方案，且所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到可對(duì)這些典型范圍以外的劑量和劑量方案進(jìn)行測(cè)試，且適當(dāng)時(shí)，可將其用于本發(fā)明的方法中。
所需劑量方便地可以單劑量形式或以經(jīng)適當(dāng)間隔投與的分劑量形式(例如，每天2次、3次、4次或更多分劑量)提供。舉例而言，分劑量本身可進(jìn)一步細(xì)分成多個(gè)不連續(xù)的松散間隔的投藥。尤其當(dāng)認(rèn)為投與相對(duì)大量適當(dāng)時(shí)，可將每日劑量細(xì)分成若干份投藥，例如2、3或4份。適當(dāng)時(shí)，視個(gè)體行為而定，可能需要上調(diào)或下調(diào)所指定的每日劑量。
由本發(fā)明的方法鑒別的化合物可以廣泛多種經(jīng)口和不經(jīng)腸劑型投與。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將了解，以下劑型可包含本文所公開或由本發(fā)明方法所鑒別的化合物或由本發(fā)明方法所鑒別的化合物的醫(yī)藥學(xué)上可接受的鹽作為活性組份。
就由本發(fā)明的方法所鑒別的化合物制備醫(yī)藥組合物而言，適當(dāng)?shù)尼t(yī)藥學(xué)上可接受的載劑的選擇可為固體、液體或兩者的混合物。固體形式的制劑包括粉劑、片劑、丸劑、膠囊、扁囊劑、栓劑和可分散顆粒劑。固體載劑可為一種或一種以上還可以充當(dāng)稀釋劑、調(diào)味劑、增溶劑、潤(rùn)滑劑、懸浮劑、粘合劑、防腐劑、片劑崩解劑或封裝材料的物質(zhì)。
在粉劑中，載劑為與細(xì)粉狀(finely divided)活性組份混合的細(xì)粉狀固體。在片劑中，活性組份與具有必需的結(jié)合能力的載劑以適當(dāng)比例混合，且經(jīng)壓制成所需的形狀和尺寸。
粉劑和片劑可含有不同百分比數(shù)量的活性化合物。粉劑或片劑中的代表性數(shù)量可含有0.5至約90％活性化合物；然而，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將了解何時(shí)需要所述范圍以外的量。粉劑和片劑的適當(dāng)載劑為碳酸鎂、硬脂酸鎂、滑石、糖、乳糖、果膠、糊精、淀粉、明膠、黃芪膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、低熔點(diǎn)蠟、可可油等。術(shù)語(yǔ)“制劑”旨在包括活性化合物與作為載劑的封裝材料的調(diào)配物，從而提供其中含有或不含載劑的活性組份由載劑包圍且因此互相締合的膠囊。類似地，包括扁囊劑和糖錠。片劑、粉劑、膠囊、丸劑、扁囊劑和糖錠都可用作適于經(jīng)口投與的固體形式。
對(duì)于制備栓劑而言，首先將低熔點(diǎn)蠟(諸如脂肪酸甘油酯或可可油的混合物)熔融，并如通過(guò)攪拌使活性組份均勻分散于其中。隨后，將熔融的均勻混合物倒入適宜尺寸的模具中，使其冷卻，并由此使其固化。
適于經(jīng)陰道投與的調(diào)配物可以子宮托、棉塞、乳膏、凝膠、糊狀物、泡沫或噴霧形式提供，除活性成份外其還含有諸如所屬領(lǐng)域中已知適當(dāng)?shù)妮d劑。
液體形式的制劑包括溶液、懸浮液和乳液，例如水或水-丙二醇溶液。舉例而言，可將不經(jīng)腸注射用液體制劑調(diào)配成聚乙二醇水溶液中的溶液?？筛鶕?jù)已知技術(shù)使用適當(dāng)?shù)姆稚┗驖?rùn)濕劑和懸浮劑調(diào)配可注射制劑，例如無(wú)菌可注射水性或油性懸浮液。無(wú)菌可注射制劑也可為無(wú)毒不經(jīng)腸可接受的稀釋劑或溶劑中的無(wú)菌可注射溶液或懸浮液，例如1，3-丁二醇中的溶液?？墒褂玫目山邮艿拿絼┖腿軇樗⒘指袷先芤?Ringer′s solution)和等滲氯化鈉溶液。此外，通常將無(wú)菌的不揮發(fā)性油用作溶劑或懸浮介質(zhì)。出于這一目的，可使用任何溫和的不揮發(fā)性油，包括合成單甘油酯或二甘油酯。此外，諸如油酸的脂肪酸可用于制備可注射物。
因此，可調(diào)配用于不經(jīng)腸投與(例如，通過(guò)注射，例如團(tuán)注(bolus injection)或連續(xù)輸注)的本發(fā)明的化合物，且其可以添加有防腐劑的安瓿、預(yù)填充注射器、小容量輸注或多劑量容器中的單位劑型提供。醫(yī)藥組合物可采用諸如油性或水性媒劑中的懸浮液、溶液或乳液的形式，且可含有諸如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑的調(diào)配劑?；蛘?，活性成份可為通過(guò)無(wú)菌分離無(wú)菌固體或通過(guò)由溶液凍干而獲得的粉末形式，其在使用前用適當(dāng)媒劑(例如無(wú)菌無(wú)熱原質(zhì)水)復(fù)水。
適于經(jīng)口使用的水溶液可通過(guò)將活性組份溶解于水中并視需要加入適當(dāng)著色劑、調(diào)味劑、穩(wěn)定劑和增稠劑來(lái)制備。
適于經(jīng)口使用的水性懸浮液可通過(guò)將細(xì)粉狀活性組份分散于含有粘性材料的水中而制得，所述粘性材料諸如為天然或合成樹膠、樹脂、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉或其它眾所周知的懸浮劑。
還包括打算在即將使用前轉(zhuǎn)化成用于經(jīng)口投與的液體形式制劑的固體形式制劑。所述液體形式包括溶液、懸浮液和乳液。這些制劑除活性組份外還可含有著色劑、調(diào)味劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、人工和天然甜味劑、分散劑、增稠劑、增溶劑等。
對(duì)于向表皮局部投藥而言，可將本發(fā)明的化合物調(diào)配成油膏、乳膏或洗液，或調(diào)配成透皮貼片。
舉例而言，可以水性或油性基質(zhì)調(diào)配油膏和乳膏，同時(shí)加入適當(dāng)?shù)脑龀韯┖?或膠凝劑?？梢运曰蛴托曰|(zhì)調(diào)配洗液，且其通常也含有一種或一種以上的乳化劑、穩(wěn)定劑、分散劑、懸浮劑、增稠劑或著色劑。
適于在口中局部投與的調(diào)配物包括糖錠，其包含調(diào)味基質(zhì)(通常為蔗糖和阿拉伯膠或黃芪膠)中的活性劑；錠劑，其包含惰性基質(zhì)(諸如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯膠)中的活性成份；和漱口液，其包含適當(dāng)液體載劑中的活性成份。
溶液或懸浮液是通過(guò)常規(guī)方式、例如用滴管、吸液管或噴霧器直接施加到鼻腔中。調(diào)配物可以單劑量或多劑量形式提供。在用滴管或吸液管的后一情況下，這可通過(guò)患者投與適當(dāng)?shù)念A(yù)定體積的溶液或懸浮液實(shí)現(xiàn)。在噴霧器的情況下，這可例如借助于計(jì)量霧化噴霧泵實(shí)現(xiàn)。
也可借助于在具有適當(dāng)推進(jìn)劑的加壓包裝中提供活性成份的氣霧劑調(diào)配物實(shí)現(xiàn)向呼吸道投藥。如果以氣霧劑形式(例如鼻氣霧劑)或通過(guò)吸入投與由本發(fā)明的方法鑒別的化合物或包含其的醫(yī)藥調(diào)配物，那么這可例如使用噴霧器、霧化器、霧化泵(pumpnebulizer)、吸入設(shè)備、計(jì)量式吸入器(metered inhaler)或干粉吸入器進(jìn)行?？赏ㄟ^(guò)所屬領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法制備用于投與由本發(fā)明的方法所鑒別的化合物的醫(yī)藥形式(如氣霧劑形式)。就其制備而言，例如，所使用的由本發(fā)明的方法所鑒別的化合物于水、水/醇混合物或適當(dāng)生理食鹽水溶液中的溶液或懸浮液中可使用常用添加劑(例如苯甲醇)或其它適當(dāng)?shù)姆栏瘎?、用于增加生物利用度的吸收增?qiáng)劑、增溶劑、分散劑等，且適當(dāng)時(shí)可使用常用推進(jìn)劑，其例如包括二氧化碳、CFC(諸如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷或二氯四氟乙烷)等。氣霧劑適宜地也可含有表面活性劑，諸如卵磷脂。藥物的劑量可通過(guò)提供量閥進(jìn)行控制。
在打算用于向呼吸道投與的調(diào)配物(包括鼻內(nèi)調(diào)配物)中，化合物通常將具有例如約10微米或10微米以下的小粒度。可通過(guò)所屬領(lǐng)域中已知的方式、例如通過(guò)微粉化獲得所述粒度。需要時(shí)，可使用適于提供活性成份的持續(xù)釋放的調(diào)配物。
或者，活性成份可以干粉形式提供，例如化合物于適當(dāng)粉末基質(zhì)中的粉末混合物，所述粉末基質(zhì)諸如為乳糖、淀粉、淀粉衍生物(諸如羥丙基甲基纖維素)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。適宜地，粉末載劑將于鼻腔內(nèi)形成凝膠。粉末組合物可以單位劑型提供，例如明膠膠囊或藥包或可借助于吸入器從其中投與粉末的發(fā)泡包裝。
醫(yī)藥制劑可為單位劑型。在這種形式下，將制劑再分成含有適量活性組份的單位劑量。單位劑型可為包裝制劑，所述包裝含有個(gè)別量的制劑，諸如小瓶或安瓿中的包裝片劑、膠囊和粉劑。同樣，單位劑型可為膠囊、片劑、扁囊劑或糖錠本身，或其可為適當(dāng)數(shù)量的所述包裝形式的單位劑型中的任一者。
用于經(jīng)口投與的片劑或膠囊和用于靜脈內(nèi)投與的液體為特別有用的組合物。
代謝相關(guān)病癥例如包括低血糖癥、衰老、胰島素抵抗、葡萄糖耐受性異常、糖尿病、高血糖癥、高胰島素血癥、高脂血癥、高甘油三酯血癥、高膽固醇血癥、血脂異常、肥胖癥、X綜合癥、動(dòng)脈粥樣硬化、心臟病、中風(fēng)、高血壓或末梢血管疾病。
低血糖癥是定義為異常低的血糖。舉例而言，低血糖癥可由過(guò)量的胰島素或較差飲食引起。舉例而言，當(dāng)患有糖尿病的人注射過(guò)多的胰島素、食用過(guò)少的食物或在不食用額外食物的情況下進(jìn)行鍛煉時(shí)，可引發(fā)低血糖癥。低血糖癥的癥狀例如包括感覺(jué)焦慮或虛弱、頭痛、視力模糊、饑餓和多汗。
衰老是當(dāng)有機(jī)體變老時(shí)出現(xiàn)的生理學(xué)過(guò)程。熱量限制使胰島素分泌下調(diào)，且有理由懷疑這些作用是熱量限制對(duì)壽命產(chǎn)生有利影響的關(guān)鍵介導(dǎo)物。此外，胰島素或胰島素信號(hào)傳輸路徑的突變影響線蟲(C.elegans)的衰老。因此，下調(diào)胰島素的策略可用于減緩衰老進(jìn)程并增加壽命。
上文已描述糖尿病、肥胖癥和相關(guān)病況，諸如胰島素抵抗、葡萄糖耐受性異常和高血糖癥。在一些實(shí)施例中，所述代謝相關(guān)病癥為高胰島素血癥、高脂血癥、高甘油三酯血癥、高膽固醇血癥、血脂異常、動(dòng)脈粥樣硬化、心臟病、中風(fēng)、高血壓、X綜合癥和末梢血管疾病。
胰腺中的β細(xì)胞產(chǎn)生胰島素。胰島素刺激葡萄糖從血液中到身體細(xì)胞中的攝取。如上所述，當(dāng)身體細(xì)胞對(duì)胰島素的作用產(chǎn)生抗性時(shí)，稱為胰島素抵抗。由于胰島素抵抗，使得胰腺產(chǎn)生比正常水平多得多的胰島素。這稱為高胰島素血癥。
血脂異常為意謂體內(nèi)脂質(zhì)含量失調(diào)的常用術(shù)語(yǔ)。高脂血癥為血流中脂質(zhì)(脂肪)含量升高。這些脂質(zhì)包括膽固醇、膽固醇酯(化合物)、磷脂和甘油三酯。所述脂質(zhì)是作為被稱為脂蛋白的大分子的部分轉(zhuǎn)運(yùn)至血液中。這些脂蛋白是五個(gè)主要家族的血液(血漿)脂蛋白乳糜微粒、極低密度脂蛋白(VLDL)、中等密度脂蛋白(IDL)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)。當(dāng)根據(jù)血液中脂蛋白升高的類別定義高脂血癥時(shí)，使用術(shù)語(yǔ)高脂蛋白血癥。高膽固醇血癥是關(guān)于血液中高膽固醇含量的術(shù)語(yǔ)。高甘油三酯血癥是指血液中的高甘油三酯含量。
動(dòng)脈粥樣硬化為脂肪物質(zhì)、膽固醇和其它物質(zhì)的沉積物積聚于動(dòng)脈內(nèi)層中的過(guò)程。所述積聚物是稱為斑塊。破裂的斑塊導(dǎo)致形成可阻斷血液流到心臟(心臟病發(fā)作)或腦部(中風(fēng))的血凝塊。在美國(guó)，心臟病發(fā)作是導(dǎo)致男性和女性死亡的首要原因，且中風(fēng)是導(dǎo)致死亡的第三號(hào)原因[例如參看Nature Medicine，Special Focus on Atherosclerosis，(2002)81209-1262]。異常高含量的循環(huán)脂質(zhì)是發(fā)展動(dòng)脈粥樣硬化的主要誘發(fā)因素。高含量的低密度脂蛋白(LDL)膽固醇、高含量的甘油三酯或低含量的高密度脂蛋白(HDL)膽固醇獨(dú)立地為動(dòng)脈粥樣硬化和相關(guān)病理學(xué)的風(fēng)險(xiǎn)因素。
心臟病包括(但不限于)心功能不全、冠狀動(dòng)脈功能不全、冠狀動(dòng)脈疾病和高血壓。末梢血管疾病是指心臟和腦部外側(cè)血管的疾病。有機(jī)末梢血管疾病是由血管的結(jié)構(gòu)改變(諸如發(fā)炎和組織損傷)引起。實(shí)例為末梢動(dòng)脈疾病。末梢動(dòng)脈疾病(PAD)是與冠狀動(dòng)脈疾病和頸動(dòng)脈疾病類似的病況。在PAD中，脂肪沉積物沿動(dòng)脈壁積聚，并影響血液循環(huán)，主要影響通向腿和腳的動(dòng)脈中的血液循環(huán)。在PAD早期，常見(jiàn)癥狀為活動(dòng)時(shí)腿和臀部抽筋或疲勞。當(dāng)人站立不動(dòng)時(shí)，所述抽筋癥狀將減退。這被稱為“間歇性跛行(intermittent claudication)”?；加蠵AD的人具有較高的因中風(fēng)和心臟病發(fā)作而死亡的風(fēng)險(xiǎn)，這是因?yàn)樾纬裳龎K的風(fēng)險(xiǎn)。
X綜合癥(也稱為代謝綜合癥)是以一個(gè)人體內(nèi)的一組代謝風(fēng)險(xiǎn)因素為特征。這些風(fēng)險(xiǎn)因素包括中心型肥胖(central obesity)(腹部中和腹部周圍脂肪組織過(guò)多)、致動(dòng)脈粥樣硬化的血脂異常(血脂病癥，主要是高甘油三酯和低HDL膽固醇)、高血壓(130/85mmHg或更高)、胰島素抵抗或葡萄糖不耐受、血栓前狀態(tài)(prothrombotic state)(例如，血液中高含量的血纖維蛋白原或血纖維蛋白溶酶原活化因子抑制劑[-1])和促炎癥狀態(tài)(proinflammatory state)(例如，血液中高敏感性C反應(yīng)蛋白含量升高)。
高血壓是血壓保持異常高(140/90mmHg或更高的讀數(shù))的常見(jiàn)病癥。市面上存在若干種可治療高血壓的藥物。高血壓是若干種嚴(yán)重病況(包括中風(fēng))的風(fēng)險(xiǎn)因素。
末梢血管疾病是心臟外側(cè)動(dòng)脈中動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的積聚。末梢血管疾病的癥狀視影響何種動(dòng)脈和血流降低的嚴(yán)重程度而定。舉例而言，患者可經(jīng)歷鈍痛、絞痛、麻痹或刺痛或皮膚顏色改變。臨床研究已確認(rèn)增加末梢血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的因素，諸如糖尿病或吸煙。可使用(例如)踝臂指數(shù)(ankle brachial index，ABI)測(cè)試、超聲波多普勒測(cè)試(ultrasound Doppler test)或血管造影對(duì)末梢血管疾病進(jìn)行診斷。末梢血管疾病可用藥物、外科手術(shù)、微創(chuàng)介入程序(minimally invasive interventional procedure)或這些療法的組合進(jìn)行治療。
盡管由本發(fā)明的方法所鑒別的化合物可如上文所述作為唯一的活性醫(yī)藥劑投與，但其也可與一種或一種以上藥劑組合使用，所述藥劑例如包括用于治療糖尿病、血脂病癥或肥胖癥的藥劑。舉例而言，諸如GPR43反向激動(dòng)劑或拮抗劑的化合物可與一種或一種以上屬于一類被稱為α-葡糖苷酶抑制劑、醛糖還原酶抑制劑、雙胍、噻唑烷二酮、美格替耐、磺酰脲、胰島素、HMG-CoA還原酶抑制劑、角鯊烯合成抑制劑、貝特類化合物(fibrate compound)、LDL分解代謝增強(qiáng)劑、血管收縮素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑、脂肪酶抑制劑、血清素和/或去甲腎上腺素釋放劑或再攝取抑制劑的藥物的藥劑組合使用。
α-葡糖苷酶抑制劑屬于競(jìng)爭(zhēng)性抑制胰腺和/或小腸內(nèi)的消化酶的一類藥物，所述消化酶諸如為α-淀粉酶、麥芽糖酶、α-糊精酶、蔗糖酶等。α-葡糖苷酶抑制劑的可逆抑制通過(guò)延緩淀粉和糖的消化來(lái)阻礙、減小或降低血糖含量。α-葡糖苷酶抑制劑的一些代表性實(shí)例包括阿卡波糖(acarbose)、N-(1，3-二羥基-2-丙基)井崗霉醇胺(N-(1，3-dihydroxy-2-propyl)valiolamine)(通用名伏格列波糖(voglibose))、米格列醇(miglitol)和所屬領(lǐng)域中已知的α-葡糖苷酶抑制劑。
醛糖還原酶抑制劑類為抑制多元醇路徑中的第一階段限速酶并由此預(yù)防或阻止糖尿病并發(fā)癥的藥物。在糖尿病的高血糖狀態(tài)下，多元醇路徑中對(duì)于葡萄糖的利用增加，且由此引起的胞內(nèi)積累的過(guò)量山梨糖醇充當(dāng)組織毒素，并因此引起諸如糖尿病神經(jīng)病變、視網(wǎng)膜病和腎病的并發(fā)癥的發(fā)作。醛糖還原酶抑制劑的實(shí)例包括托勒司他(tolurestat)、依帕司他(epalrestat)、3，4-二氫-2，8-二異丙基-3-硫代-2H-1，4-苯并惡嗪-4-乙酸、2，7-二氟螺(9H-芴-9，4′-咪唑烷)-2′，5′-二酮(通用名咪瑞司他(imirestat))、3-[(4-溴-2-氟苯基)甲基]-7-氯-3，4-二氫-2，4-二氧代-1(2H)-喹唑啉乙酸(通用名折那司他(zenarestat))、6-氟-2，3-二氫-2′，5′-二氧代-螺[4H-1-苯并吡喃-4，4′-咪唑烷]-2-甲酰胺(SNK-860)、唑泊司他(zopolrestat)、索比尼爾(sorbinil)和1-[(3-溴-2-苯并呋喃基)磺?；鵠-2，4-咪唑烷二酮(M-16209)和所屬領(lǐng)域中已知的醛糖還原酶抑制劑。
雙胍為刺激無(wú)氧糖酵解、增加周圍組織對(duì)胰島素的敏感性、抑制葡萄糖從腸的吸收、抑制肝糖原異生和抑制脂肪酸氧化的一類藥物。雙胍的實(shí)例包括芬法敏(phenformin)、美氟明(metformin)、丁福明(buformin)和所屬領(lǐng)域中已知的雙胍。
胰島素分泌增強(qiáng)劑屬于具有促進(jìn)胰腺β細(xì)胞分泌胰島素的特性的一類藥物。胰島素分泌增強(qiáng)劑的實(shí)例包括磺酰脲(SU)?；酋ｋ?SU)為通過(guò)經(jīng)由細(xì)胞膜中的SU受體傳輸胰島素分泌信號(hào)來(lái)促進(jìn)胰腺β細(xì)胞分泌胰島素的藥物?；酋ｋ宓膶?shí)例包括甲苯磺丁脲(tolbutamide)、氯磺丙脲(chlorpropamide)、妥拉磺脲(tolazamide)、乙酸磺環(huán)己脲(acetohexamide)、4-氯-N-[(1-吡咯烷基氨基)羰基-苯磺酰胺(通用名格列克比脲(glycopyramide))或其銨鹽、格列本脲(glibenclamide)(格列本脲(glyburide))、格列齊特(gliclazide)、1-丁基-3-間氨基苯磺?；?、氨磺丁脲(carbutamide)、格列波脲(glibonuride)、格列吡嗪(glipizide)、格列喹酮(gliquidone)、格列派特(glisoxepid)、格列噻唑(glybuthiazole)、格列布唑(glibuzole)、格列己脲(glyhexamide)、格列嘧啶(glymidine)、格列平脲(glypinamide)、苯磺丁脲(phenbutamide)、甲磺環(huán)己脲(tolcyclamide)、格列美脲(glimepiride)和所屬領(lǐng)域中已知的其它胰島素分泌增強(qiáng)劑。其它胰島素分泌增強(qiáng)劑包括N-[[4-(1-甲基乙基)環(huán)己基)羰基]-D-苯丙氨酸(那格列奈(Nateglinide))、(2S)-2-苯甲基-3-(順-六氫-2-異吲哚啉基羰基)丙酸鈣二水合物(米格列奈(Mitiglinide)，KAD-1229)和所屬領(lǐng)域中已知的其它胰島素分泌增強(qiáng)劑。
噻唑烷二酮屬于通常更被稱為TZD的一類藥物。噻唑烷二酮為通過(guò)增加細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性來(lái)降低血糖的一類用于2型糖尿病的藥物。隨后胰島素可使葡萄糖從血液移動(dòng)到細(xì)胞中以用于能量目的。這些藥物也可增加HDL。
噻唑烷二酮的實(shí)例包括羅格列酮(rosiglitazone)、吡格列酮(pioglitazone)和所屬領(lǐng)域中已知的噻唑烷二酮。在美國(guó)，雷株林(Rezulin)(曲格列酮(troglitazone))是這類藥物中的首個(gè)藥物，但由于肝臟毒性而退出市場(chǎng)。當(dāng)前可用的具有較好安全性概況的姐妹化合物(sister compound)包括艾可拓(Actos)(吡格列酮)和文迪雅(Avandia)(羅格列酮)。使用這些藥物的主要禁忌癥包括肝病和心力衰竭。這些藥物也可引起體液潴留(fluid retention)的顯著增加并因此使心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)增加。
美格替耐是用于終止患2型糖尿病的人員進(jìn)食后可能立即出現(xiàn)的血糖快速升高。例如包括瑞格列奈(repaglinide)(普瑞丁(Prandin))和那格列奈(唐力(Starlix))的這些化合物通過(guò)以與磺酰脲藥物起作用的方式類似的方式增加胰腺產(chǎn)生胰島素的量來(lái)起作用。美格替耐是在進(jìn)食前服用。與這類藥物相關(guān)的副作用包括低血糖、上呼吸道感染(包括竇病癥(sinus condition))、頭痛、關(guān)節(jié)和背部疼痛、惡心、腹瀉和便秘。
根據(jù)胰島素開始作用(起始)的快慢程度和其持續(xù)作用(持續(xù)時(shí)間)的時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)不同類型的胰島素進(jìn)行分類。當(dāng)前可用的類型包括速效胰島素、短效胰島素、中效胰島素和長(zhǎng)效胰島素。存在可用的預(yù)混合速效和中效胰島素，其包括70％中效胰島素(NPH)和30％短效常規(guī)胰島素，稱為70/30胰島素；50％中效胰島素(NPH)和50％短效常規(guī)胰島素，稱為50/50胰島素；75％中效胰島素(NPH)和25％速效優(yōu)泌樂(lè)(Humalog)(賴脯胰島素(lispro))，稱為75/25胰島素；70％中效胰島素(NPH)和30％速效諾和諾德(NovoLog)(門冬胰島素(insulin aspart))，稱為諾和諾德混合物(NovoLog Mix)70/30。胰島素通常是以注射液形式提供到皮膚下(皮下)組織中。也可通過(guò)胰島素泵或無(wú)針注射器(jet injector)(一種將藥物噴到皮膚中的裝置)提供胰島素。
胰島素使糖(葡萄糖)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，糖于其中用于能量目的。在無(wú)胰島素的情況下，血糖含量上升到對(duì)身體安全的含量以上。通常，采用速效或短效和中效或長(zhǎng)效胰島素提供身體所需的恒定和可變含量的胰島素。短效胰島素迅速降低血糖含量且隨后逐漸消失。當(dāng)速效或短效胰島素開始消失時(shí)，一些長(zhǎng)效胰島素開始生效。新穎長(zhǎng)效胰島素蘭德仕(Lantus)在給藥后數(shù)分鐘內(nèi)起效，并且以相同速率持續(xù)作用約24小時(shí)。
速效或短效胰島素與中效或長(zhǎng)效胰島素的組合協(xié)助使血糖含量一整天都保持在對(duì)身體安全的范圍內(nèi)。因此，可使用胰島素治療胰腺產(chǎn)生極少或不產(chǎn)生胰島素或口服藥物無(wú)法控制血糖的1型糖尿病患者和2型糖尿病患者。這些人可僅采用胰島素或同時(shí)采用胰島素和口服藥物，所述人員為因嚴(yán)重疾病或大外科手術(shù)而具有高血糖含量的2型糖尿病患者；無(wú)法用飲食和鍛煉使血糖含量保持在安全范圍內(nèi)的處于妊娠或哺乳期的患有2型糖尿病的婦女。僅已研究出一種口服糖尿病藥物(格列本脲(glyburide))在妊娠期使用。
胰島素的主要副作用可為危險(xiǎn)低的血糖含量(嚴(yán)重低血糖癥)。極低血糖含量可在10至15分鐘內(nèi)顯現(xiàn)。胰島素可促成體重增加，尤其是對(duì)于已超重的2型糖尿病患者而言。長(zhǎng)期使用胰島素的其它可能的副作用包括其中注射胰島素的脂肪組織的損失(脂肪代謝障礙)和罕見(jiàn)的過(guò)敏性反應(yīng)(包括腫脹(浮腫))。
他汀(statin)化合物屬于通過(guò)抑制羥甲基戊二?；o酶A(HMG-CoA)還原酶來(lái)降低血液膽固醇含量的一類藥物。HMG-CoA還原酶為膽固醇生物合成中的限速酶。抑制這種還原酶的他汀通過(guò)上調(diào)LDL受體活性和負(fù)責(zé)將LDL從血液中清除來(lái)降低血清LDL濃度。他汀化合物的實(shí)例包括羅蘇伐他汀(rosuvastatin)、普伐他汀(pravastatin)和其鈉鹽、辛伐他汀(simvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、阿伐他汀(atorvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、西立伐他汀(cerivastatin)和所屬領(lǐng)域中已知的HMG-CoA還原酶抑制劑。
角鯊烯合成抑制劑屬于通過(guò)抑制角鯊烯合成來(lái)降低血液膽固醇含量的一類藥物。角鯊烯合成抑制劑的實(shí)例包括(S)-α-[雙[2，2-二甲基-1-氧代丙氧基)甲氧基]氧膦基(phosphinyl)]-3-苯氧基苯丁烷磺酸單鉀鹽(BMS-188494)和所屬領(lǐng)域中已知的角鯊烯合成抑制劑。
貝特類化合物屬于通過(guò)抑制肝臟中甘油三酯合成和分泌并活化脂蛋白脂肪酶來(lái)降低血液膽固醇含量的一類藥物。已知貝特類活化過(guò)氧化物酶體增殖物活化受體(peroxisome proliferators-activated receptor)并誘導(dǎo)脂蛋白脂肪酶的表達(dá)。貝特類化合物的實(shí)例包括苯扎貝特(bezafibrate)、貝羅貝特(beclobrate)、比尼貝特(binifibrate)、刺博貝特(ciplofibrate)、克利貝特(clinofibrate)、氯貝特(clofibrate)、氯貝酸(clofibricacid)、依托貝特(etofibrate)、非諾貝特(fenofibrate)、吉非貝齊(gemfibrozil)、尼可貝特(nicofibrate)、吡貝特(pirifibrate)、氯煙貝特(ronifibrate)、雙貝特(simfibrate)、益多脂(theofibrate)和所屬領(lǐng)域中已知的貝特類。
LDL(低密度脂蛋白)分解代謝增強(qiáng)劑屬于通過(guò)增加LDL(低密度脂蛋白)受體的數(shù)量來(lái)降低血液膽固醇含量的一類藥物，實(shí)例包括所屬領(lǐng)域中已知的LDL分解代謝增強(qiáng)劑。
血管收縮素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑屬于通過(guò)抑制血管收縮素轉(zhuǎn)化酶來(lái)部分降低血糖含量同時(shí)降低血壓的一類藥物。血管收縮素轉(zhuǎn)化酶抑制劑的實(shí)例包括卡托普利(captopril)、依那普利(enalapril)、阿拉普利(alacepril)、地拉普利(delapril)、雷米普利(ramipril)、賴諾普利(lisinopriL)、咪噠普利(imidapril)、貝那普利(benazepril)、西羅普利(ceronapril)、西拉普利(cilazapril)、依那普利拉(enalaprilat)、福辛普利(fosinopril)、莫夫普利(moveltopril)、培多普利(perindopril)、喹那普利(quinapril)、螺普利(spirapril)、替莫普利(temocapril)、雷多普利(randolapril)和所屬領(lǐng)域中已知的血管收縮素轉(zhuǎn)化酶抑制劑。
脂肪酶抑制劑例如包括抗肥胖癥化合物，諸如奧利司他(Orlistat)(XENICALTM)。奧利司他直接抑制脂肪吸收，并且傾向于產(chǎn)生高發(fā)生率的使胃部不適的副作用(諸如腹瀉和腸胃氣脹)。
另一類抗肥胖癥藥物包括血清素和/或去甲腎上腺素釋放劑或再攝取抑制劑。舉例而言，西布曲明(sibutramine)(MeridiaTM)為混合5-HT/去甲腎上腺素再攝取抑制劑。西布曲明的主要副作用可為使一些患者的血壓和心率增加。已報(bào)導(dǎo)血清素釋放劑/再攝取抑制劑芬氟拉明(fenfluramine)(PondiminTM)和右旋氟苯丙胺(dexfenfluramine)(ReduxTM)可長(zhǎng)時(shí)間(大于6個(gè)月)降低食物攝入和體重。然而，在報(bào)導(dǎo)與使用這兩種產(chǎn)品有關(guān)的心臟瓣膜畸形的初步證據(jù)后，不再使用這兩種產(chǎn)品。
本發(fā)明的一些實(shí)施例包括醫(yī)藥組合物，其包含本文所公開或由本發(fā)明的方法所鑒別的化合物或其醫(yī)藥學(xué)上可接受的鹽與至少一種選自由下列各物組成的群組的成員的組合α-葡糖苷酶抑制劑、醛糖還原酶抑制劑、雙胍、HMG-CoA還原酶抑制劑、角鯊烯合成抑制劑、貝特類化合物、LDL分解代謝增強(qiáng)劑和血管收縮素轉(zhuǎn)化酶抑制劑。在另一實(shí)施例中，HMG-CoA還原酶抑制劑是選自由普瓦他汀(prevastatin)、辛伐他汀、洛伐他汀、阿伐他汀、氟伐他汀和利匹妥(lipitor)組成的群組。
根據(jù)本發(fā)明，可通過(guò)使各別活性組份一起或獨(dú)立地與上文所述的生理學(xué)上可接受的載劑、賦形劑、粘合劑、稀釋劑等混合并且經(jīng)口或不經(jīng)口投與一種或一種以上醫(yī)藥組合物形式的混合物來(lái)使用所述組合。當(dāng)作為組合療法或預(yù)防投與化合物或化合物混合物與另一活性化合物時(shí)，可將治療劑調(diào)配為在相同時(shí)間或不同時(shí)間給藥的單獨(dú)醫(yī)藥組合物，或可提供單一組合物形式的治療劑。
本發(fā)明還提供制造包含醫(yī)藥組合物的藥物的方法，所述醫(yī)藥組合物包含、基本上由或由用作代謝穩(wěn)定化合物的可根據(jù)以下方法鑒別的代謝穩(wěn)定化合物組成a)使候選化合物與GPR43接觸，和b)測(cè)定GPR43功能性是否受到調(diào)節(jié)，其中對(duì)GPR43功能性的調(diào)節(jié)表明候選化合物是代謝穩(wěn)定化合物。
本發(fā)明進(jìn)一步提供制造包含醫(yī)藥組合物的藥物的方法，所述醫(yī)藥組合物包含、基本上由或由用于治療代謝相關(guān)疾病的可根據(jù)以下方法鑒別的代謝穩(wěn)定化合物組成a)使候選化合物與GPR43接觸，和b)測(cè)定GPR43功能性是否受到調(diào)節(jié)，其中對(duì)GPR43功能性的調(diào)節(jié)表明候選化合物是代謝穩(wěn)定化合物。
本發(fā)明涉及鑒別代謝穩(wěn)定化合物的方法，其包含a)使候選化合物與GPR43接觸，和b)測(cè)定GPR43功能性是否增加，其中GPR43功能性增加表明候選化合物是代謝穩(wěn)定化合物。
在一實(shí)施例中，所述GPR43是來(lái)源于哺乳動(dòng)物。在另一實(shí)施例中，所述GPR43是人類GPR43。
在某些實(shí)施例中，所述GPR43為重組體。在某些實(shí)施例中，所述接觸包含與表達(dá)GPCR的宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞膜接觸，其中所述宿主細(xì)胞包含表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含編碼受體的聚核苷酸。在一些實(shí)施例中，所述接觸是在已知的GPCR激動(dòng)劑或如本文所公開的激動(dòng)劑存在下進(jìn)行。
在某些實(shí)施例中，所述方法進(jìn)一步包含以下步驟將由候選化合物所引起的受體功能性增加與通過(guò)使受體與受體的已知配體或激動(dòng)劑接觸所引起的另一受體功能性增加相比較。
在一些實(shí)施例中，所述測(cè)定包含第二信使分析，例如，測(cè)定是通過(guò)測(cè)量與包含所述GPCR的膜結(jié)合的GTPγS進(jìn)行。在某些實(shí)施例中，所述GTPγS是經(jīng)[35S]標(biāo)記。在某些實(shí)施例中，所述測(cè)定是通過(guò)測(cè)量選自由下列各物組成的群組的第二信使的含量進(jìn)行環(huán)AMP(cAMP)、環(huán)GMP(cGMP)、三磷酸肌醇(IP3)、二?；视?DAG)、MAP激酶活性和Ca2+。在某些實(shí)施例中，所述第二信使為cAMP。在某些實(shí)施例中，所述對(duì)cAMP的測(cè)量是使用全細(xì)胞腺苷酰基環(huán)化酶分析進(jìn)行。在某些實(shí)施例中，所述對(duì)cAMP的測(cè)量是用包含所述GPCR的膜進(jìn)行。在某些實(shí)施例中，所述測(cè)定是通過(guò)測(cè)量胞內(nèi)IP3進(jìn)行。在某些實(shí)施例中，所述第二信使為MAP激酶活性。在一些實(shí)施例中，所述測(cè)定是通過(guò)CRE-報(bào)告基因分析進(jìn)行。在某些實(shí)施例中，所述報(bào)告基因?yàn)闊晒馑孛?。在一些?shí)施例中，所述報(bào)告基因?yàn)棣?半乳糖苷酶。在某些實(shí)施例中，所述測(cè)定或所述比較是通過(guò)測(cè)量胞內(nèi)Ca2+進(jìn)行。
在一些實(shí)施例中，所述測(cè)定是通過(guò)測(cè)量從哺乳動(dòng)物獲得的脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取進(jìn)行。
在某些實(shí)施例中，所述測(cè)定是通過(guò)使用黑素細(xì)胞分析進(jìn)行。
在某些實(shí)施例中，所述GPR43為重組體。在某些實(shí)施例中，所述接觸包含與表達(dá)GPCR的宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞膜接觸，其中所述宿主細(xì)胞包含表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含編碼受體的聚核苷酸。在一些實(shí)施例中，所述接觸是在GPCR激動(dòng)劑存在下進(jìn)行。
在本發(fā)明的方法中，可進(jìn)行對(duì)照反應(yīng)以展示反應(yīng)的特異性。舉例而言，可將經(jīng)模擬轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與經(jīng)GPR43轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比較以展示對(duì)GPR43受體的反應(yīng)的特異性。
在本發(fā)明的方法中，在某些實(shí)施例中，所述候選化合物不是抗體或其抗原結(jié)合衍生物。在某些實(shí)施例中，所述候選化合物不是肽。在某些實(shí)施例中，所述候選化合物不是多肽。
在本發(fā)明的方法中，測(cè)定可包含第二信使分析。例如，可通過(guò)測(cè)量第二信使的含量來(lái)確定胞內(nèi)信號(hào)的起始，所述第二信使諸如為環(huán)AMP(cAMP)、環(huán)GMP(cGMP)、三磷酸肌醇(IP3)、二?；视?DAG)、MAP激酶或鈣。所屬領(lǐng)域中眾所周知用于測(cè)量這些第二信使的若干分析，例如cAMP分析、IP3分析、FLIPR分析、黑素細(xì)胞分析或CRE-報(bào)告基因分析。此外，本文的實(shí)例6-11中公開第二信使分析的實(shí)例。在某些實(shí)施例中，所述第二信使為cAMP。在其它實(shí)施例中，所述第二信使為IP3。在其它實(shí)施例中，所述第二信使為鈣。
在一實(shí)施例中，所述測(cè)定是通過(guò)測(cè)量與包含所述GPCR的膜結(jié)合的GTPγS進(jìn)行。這些分析已為所屬領(lǐng)域中眾所周知，且于本文實(shí)例6和8中加以例示說(shuō)明。在某些實(shí)施例中，所述GTPγS是經(jīng)[35S]標(biāo)記。
本發(fā)明也涉及可根據(jù)以下方法鑒別的代謝穩(wěn)定化合物a)使候選化合物與GPR43接觸，和b)測(cè)定GPR43功能性是否增加，其中GPR43功能性增加表明候選化合物是代謝穩(wěn)定化合物。
舉例而言，本發(fā)明涉及可根據(jù)以下方法鑒別的代謝穩(wěn)定化合物a)使候選化合物與GPR43接觸，和b)測(cè)定GPR43功能性是否增加，其中GPR43功能性增加表明候選化合物是代謝穩(wěn)定化合物。
在一實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為GPR43激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述激動(dòng)劑為先前未知的當(dāng)與GPR43受體結(jié)合時(shí)活化胞內(nèi)反應(yīng)的物質(zhì)。
在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為EC50小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的GPR43激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為EC50具有選自1nM至10μM的區(qū)間內(nèi)的值的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為EC50具有選自1nM至1μM的區(qū)間內(nèi)的值的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為EC50具有選自1nM至100nM的區(qū)間內(nèi)的值的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為EC50具有選自1nM至10nM的區(qū)間內(nèi)的值的激動(dòng)劑。
在某些實(shí)施例中，所述EC50是使用選自由以下分析組成的群組的分析測(cè)定IP3分析，其是使用表達(dá)重組GPR43多肽的經(jīng)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞進(jìn)行；和黑素細(xì)胞分析，其是使用表達(dá)重組GPR43多肽的經(jīng)轉(zhuǎn)染黑素細(xì)胞進(jìn)行。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于10μM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于9μM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于8μM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于7μM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于6μM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于5μM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于4μM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于3μM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于2μM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于1μM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于900nM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于800nM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于700nM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于600nM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于500nM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于400nM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于300nM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于200nM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于100nM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于90nM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于80nM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于70nM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于60nM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于50nM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于40nM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于30nM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于20nM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50小于10nM的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50具有選自1nM至10μM的區(qū)間內(nèi)的值的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50具有選自1nM至1μM的區(qū)間內(nèi)的值的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50具有選自1nM至100nM的區(qū)間內(nèi)的值的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中EC50具有選自1nM至10nM的區(qū)間內(nèi)的值的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物對(duì)GPCR具有選擇性。
在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物可經(jīng)口服生物利用。在一些實(shí)施例中，相對(duì)于腹膜內(nèi)投藥而言，所述口服生物利用度為至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些實(shí)施例中，相對(duì)于腹膜內(nèi)投藥而言，所述口服生物利用度為至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些實(shí)施例中，所述可經(jīng)口服生物利用的代謝穩(wěn)定化合物另外能夠穿越血腦屏障。
此外，本發(fā)明涉及制備組合物的方法，其包含鑒別代謝穩(wěn)定化合物，隨后使所述化合物與載劑混合，其中所述化合物可通過(guò)以下方法鑒別a)使候選化合物與GPR43接觸，和b)測(cè)定GPR43功能性是否增加，其中GPR43功能性增加表明候選化合物是代謝穩(wěn)定化合物。舉例而言，本發(fā)明涉及制備組合物的方法，其包含鑒別代謝穩(wěn)定化合物，隨后使所述化合物與載劑混合，其中所述化合物可通過(guò)以下方法鑒別a)使候選化合物與GPR43接觸，和b)測(cè)定GPR43功能性是否增加，其中GPR43功能性增加表明候選化合物是代謝穩(wěn)定化合物。
本發(fā)明還涉及醫(yī)藥組合物，其包含、基本上由或由可根據(jù)以下方法鑒別的代謝穩(wěn)定化合物組成a)使候選化合物與GPR43接觸，和b)測(cè)定GPR43功能性是否增加，其中GPR43功能性增加表明候選化合物是代謝穩(wěn)定化合物。
本發(fā)明的一些實(shí)施例包括制造醫(yī)藥組合物的方法，其包含使至少一種根據(jù)本文所公開的化合物實(shí)施例中任一者的化合物與醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑混合。
可使用所屬領(lǐng)域技術(shù)人員熟知和本文所述的技術(shù)將化合物調(diào)配成醫(yī)藥組合物。
盡管在替代使用中可能以化學(xué)原料或純化學(xué)物質(zhì)的形式投與本文所公開或由本發(fā)明的方法所鑒別的化合物以用于預(yù)防或治療，但提供另外包含醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑的醫(yī)藥調(diào)配物或組合物形式的化合物或活性成份也是適用的。
因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供醫(yī)藥調(diào)配物，其包含本文所公開或由本發(fā)明的方法所鑒別的化合物或其醫(yī)藥學(xué)上可接受的鹽或衍生物連同一種或一種以上其醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑和/或預(yù)防成份。在載劑可與調(diào)配物中的其它成份相容且不會(huì)對(duì)其接受者過(guò)度有害的意義上來(lái)說(shuō)，載劑是“可接受的”。
醫(yī)藥調(diào)配物、投藥途徑和劑量已于上文進(jìn)行描述。
本發(fā)明涉及治療或預(yù)防有此需要的個(gè)體的代謝相關(guān)病癥的方法，其包含向所述個(gè)體投與有效量的根據(jù)以下方法所鑒別的化合物a)使候選化合物與GPR43接觸，和b)測(cè)定GPR43功能性是否增加，其中GPR43功能性增加表明候選化合物是代謝穩(wěn)定化合物。在一些實(shí)施例中，所述代謝相關(guān)病癥為低血糖癥或衰老。在一實(shí)施例中，所投與的化合物包含GPR43激動(dòng)劑。在一實(shí)施例中個(gè)體為哺乳動(dòng)物，且在另一實(shí)施例中個(gè)體為人類。
盡管由本發(fā)明的方法所鑒別的化合物可如上文所述作為唯一的活性醫(yī)藥劑投與，但其也可與一種或一種以上藥劑組合使用。
本發(fā)明還涉及制造包含醫(yī)藥組合物的藥物的方法，所述醫(yī)藥組合物包含、基本上由或由用作代謝穩(wěn)定化合物的可根據(jù)以下方法鑒別的代謝穩(wěn)定化合物組成a)使候選化合物與GPR43接觸，和b)測(cè)定GPR43功能性是否增加，其中GPR43功能性增加表明候選化合物是代謝穩(wěn)定化合物。
本發(fā)明另外涉及制造包含醫(yī)藥組合物的藥物的方法，所述醫(yī)藥組合物包含、基本上由或由用于治療代謝相關(guān)疾病的可根據(jù)以下方法鑒別的代謝穩(wěn)定化合物組成a)使候選化合物與GPR43接觸，和b)測(cè)定GPR43功能性是否增加，其中GPR43功能性增加表明候選化合物是代謝穩(wěn)定化合物。
本發(fā)明提供鑒別代謝穩(wěn)定化合物的方法，其包含a)使候選化合物與GPR43接觸，和b)測(cè)定GPR43功能性是否降低，其中GPR43功能性降低表明候選化合物是代謝穩(wěn)定化合物。
在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為血糖穩(wěn)定化合物。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為胰島素分泌調(diào)節(jié)劑。
在一實(shí)施例中，所述GPR43是來(lái)源于哺乳動(dòng)物。在另一實(shí)施例中，所述GPR43是人類GPR43。
在某些實(shí)施例中，所述GPR43為重組體。在某些實(shí)施例中，所述接觸包含與表達(dá)GPCR的宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞膜接觸，其中所述宿主細(xì)胞包含表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含編碼受體的聚核苷酸。在一些實(shí)施例中，所述接觸是在已知的GPCR激動(dòng)劑存在下進(jìn)行。
在一些實(shí)施例中，所述測(cè)定包含第二信使分析，例如，測(cè)定是通過(guò)測(cè)量與包含所述GPCR的膜結(jié)合的GTPγS進(jìn)行。在某些實(shí)施例中，所述GTPγS是經(jīng)[35S]標(biāo)記。在某些實(shí)施例中，所述測(cè)定是通過(guò)測(cè)量選自由下列各物組成的群組的第二信使的含量進(jìn)行環(huán)AMP(cAMP)、環(huán)GMP(cGMP)、三磷酸肌醇(IP3)、二酰基甘油(DAG)、MAP激酶活性和Ca2+。在某些實(shí)施例中，所述第二信使為cAMP。在某些實(shí)施例中，所述對(duì)cAMP的測(cè)量是使用全細(xì)胞腺苷?；h(huán)化酶分析進(jìn)行。在某些實(shí)施例中，所述對(duì)cAMP的測(cè)量是用包含所述GPCR的膜進(jìn)行。在某些實(shí)施例中，所述測(cè)定是通過(guò)測(cè)量胞內(nèi)IP3進(jìn)行。在某些實(shí)施例中，所述第二信使為MAP激酶活性。在一些實(shí)施例中，所述測(cè)定是通過(guò)CRE-報(bào)告基因分析進(jìn)行。在某些實(shí)施例中，所述報(bào)告基因?yàn)闊晒馑孛?。在一些?shí)施例中，所述報(bào)告基因?yàn)棣?半乳糖苷酶。在某些實(shí)施例中，所述測(cè)定或所述比較是通過(guò)例如使用FLIPR分析測(cè)量胞內(nèi)Ca2+進(jìn)行。
在一些實(shí)施例中，所述測(cè)定是通過(guò)測(cè)量從哺乳動(dòng)物所獲得的脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取進(jìn)行。
在某些實(shí)施例中，所述測(cè)定是通過(guò)使用黑素細(xì)胞分析進(jìn)行。
在本發(fā)明的方法中，可進(jìn)行對(duì)照反應(yīng)以展示反應(yīng)的特異性。舉例而言，可將經(jīng)模擬轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與經(jīng)GPR43轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比較以展示對(duì)GPR43受體反應(yīng)的特異性。
在本發(fā)明的方法中，在某些實(shí)施例中，所述候選化合物不是抗體或其抗原結(jié)合衍生物。在某些實(shí)施例中，所述候選化合物不是肽。在某些實(shí)施例中，所述候選化合物不是多肽。
在本發(fā)明的方法中，測(cè)定可包含第二信使分析。例如，可通過(guò)測(cè)量第二信使的含量來(lái)確定胞內(nèi)信號(hào)的起始，所述第二信使諸如為環(huán)AMP(cAMP)、環(huán)GMP(cGMP)、三磷酸肌醇(IP3)、二酰基甘油(DAG)、MAP激酶或鈣。所屬領(lǐng)域中眾所周知用于測(cè)量這些第二信使的若干分析，例如cAMP分析、IP3分析、FLIPR分析、黑素細(xì)胞分析或CRE-報(bào)告基因分析。此外，在本文的實(shí)例6-11中公開第二信使分析的實(shí)例。在某些實(shí)施例中，所述第二信使為cAMP。在其它實(shí)施例中，所述第二信使為IP3。在其它實(shí)施例中，所述第二信使為鈣。
在一實(shí)施例中，所述測(cè)定是通過(guò)測(cè)量與包含所述GPCR的膜結(jié)合的GTPγS進(jìn)行。這些分析已為所屬領(lǐng)域中眾所周知，且于本文實(shí)例6和8中加以例示說(shuō)明。在某些實(shí)施例中，所述GTPγS是經(jīng)[35S]標(biāo)記。
本發(fā)明也涉及可根據(jù)以下方法鑒別的代謝穩(wěn)定化合物a)使候選化合物與GPR43接觸，和b)測(cè)定GPR43功能性是否降低，其中GPR43功能性降低表明候選化合物是代謝穩(wěn)定化合物。
舉例而言，本發(fā)明提供可根據(jù)以下方法鑒別的代謝穩(wěn)定化合物a)使候選化合物與GPR43接觸，和b)測(cè)定GPR43功能性是否降低，其中GPR43功能性降低表明候選化合物是代謝穩(wěn)定化合物。
在一實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為GPR43反向激動(dòng)劑。在一實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為GPR43拮抗劑。
在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為IC50小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的GPR43反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為IC50具有選自1nM至10μM的區(qū)間內(nèi)的值的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為IC50具有選自1nM至1μM的區(qū)間內(nèi)的值的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為IC50具有選自1nM至100nM的區(qū)間內(nèi)的值的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為IC50具有選自1nM至10nM的區(qū)間內(nèi)的值的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。
在某些實(shí)施例中，所述IC50是使用選自由以下分析組成的群組的分析測(cè)定IP3分析，其是使用表達(dá)重組GPR43多肽的經(jīng)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞進(jìn)行；和黑素細(xì)胞分析，其是使用表達(dá)重組GPR43多肽的經(jīng)轉(zhuǎn)染黑素細(xì)胞進(jìn)行。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于10μM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于9μM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于8μM的反向反向激動(dòng)劑或拮抗劑或反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于7μM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于6μM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于5μM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于4μM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于3μM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于2μM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于1μM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于900nM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于800nM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于700nM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于600nM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于500nM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于400nM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于300nM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于200nM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于100nM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于90nM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于80nM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于70nM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于60nM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于50nM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于40nM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于30nM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于20nM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50小于10nM的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50具有選自1nM至10μM的區(qū)間內(nèi)的值的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50具有選自1nM至1μM的區(qū)間內(nèi)的值的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50具有選自1nM至100nM的區(qū)間內(nèi)的值的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物為在所述分析中IC50具有選自1nM至10nM的區(qū)間內(nèi)的值的反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物對(duì)GPCR具有選擇性。
在一些實(shí)施例中，所述代謝穩(wěn)定化合物可經(jīng)口服生物利用。在一些實(shí)施例中，相對(duì)于腹膜內(nèi)投藥而言，所述口服生物利用度為至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些實(shí)施例中，相對(duì)于腹膜內(nèi)投藥而言，所述口服生物利用度為至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些實(shí)施例中，所述可經(jīng)口服生物利用的代謝穩(wěn)定化合物另外能夠穿越血腦屏障。
此外，本發(fā)明涉及制備組合物的方法，其包含鑒別代謝穩(wěn)定化合物，隨后使所述化合物與載劑混合，其中所述化合物可通過(guò)以下方法鑒別a)使候選化合物與GPR43接觸，和b)測(cè)定GPR43功能性是否降低，其中GPR43功能性降低表明候選化合物是代謝穩(wěn)定化合物。舉例而言，本發(fā)明提供制備組合物的方法，其包含鑒別代謝穩(wěn)定化合物，隨后使所述化合物與載劑混合，其中所述化合物可通過(guò)以下方法鑒別a)使候選化合物與GPR43接觸，和b)測(cè)定GPR43功能性是否降低，其中GPR43功能性降低表明候選化合物是代謝穩(wěn)定化合物。
本發(fā)明還提供醫(yī)藥組合物，其包含、基本上由或由可根據(jù)以下方法鑒別的代謝穩(wěn)定化合物組成a)使候選化合物與GPR43接觸，和b)測(cè)定GPR43功能性是否降低，其中GPR43功能性降低表明候選化合物是代謝穩(wěn)定化合物。
本發(fā)明的一些實(shí)施例包括制造醫(yī)藥組合物的方法，其包含使至少一種根據(jù)本文所公開的化合物實(shí)施例中任一者的化合物與醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑混合。
醫(yī)藥調(diào)配物、投藥途徑和劑量已于上文進(jìn)行描述。
本發(fā)明提供治療或預(yù)防有此需要的個(gè)體的代謝相關(guān)病癥的方法，其包含向所述個(gè)體投與有效量的根據(jù)以下方法所鑒別的化合物a)使候選化合物與GPR43接觸，和b)測(cè)定GPR43功能性是否降低，其中GPR43功能性降低表明候選化合物是代謝穩(wěn)定化合物。在一些實(shí)施例中，所述代謝相關(guān)病癥為胰島素抵抗、葡萄糖耐受性異?；蛱悄虿?。在一些實(shí)施例中，所述代謝相關(guān)病癥包括高血糖癥、高胰島素血癥、高脂血癥、高甘油三酯血癥、高膽固醇血癥、血脂異常、肥胖癥、X綜合癥、動(dòng)脈粥樣硬化、心臟病、中風(fēng)、高血壓或末梢血管疾病。在一實(shí)施例中，所述代謝相關(guān)病癥為II型糖尿病。在一實(shí)施例中，所投與的化合物包含GPR43反向激動(dòng)劑或拮抗劑。
在一實(shí)施例中，所述方法進(jìn)一步包含向所述個(gè)體投與有效量的用于治療糖尿病、血脂病癥或肥胖癥的藥劑與有效量的醫(yī)藥組合物的組合，所述醫(yī)藥組合物包含、基本上由或由根據(jù)以下方法鑒別的代謝穩(wěn)定化合物組成a)使候選化合物與GPR43接觸，和b)測(cè)定GPR43功能性是否降低，其中GPR43功能性降低表明候選化合物是代謝穩(wěn)定化合物。舉例而言，在一實(shí)施例中，所述方法進(jìn)一步包含向所述個(gè)體投與有效量的用于治療糖尿病、血脂病癥或肥胖癥的藥劑與有效量的含有GPR43反向激動(dòng)劑的醫(yī)藥組合物的組合。
在一實(shí)施例中個(gè)體為哺乳動(dòng)物，且在另一實(shí)施例中個(gè)體為人類。
盡管由本發(fā)明的方法所鑒別的化合物可如上文所述作為唯一的活性醫(yī)藥劑投與，但其也可與一種或一種以上藥劑組合使用，所述藥劑例如包括用于治療糖尿病、血脂病癥或肥胖癥的藥劑。舉例而言，諸如GPR43反向激動(dòng)劑或拮抗劑的化合物可與一種或一種以上屬于一類被稱為α-葡糖苷酶抑制劑、醛糖還原酶抑制劑、雙胍、噻唑烷二酮、美格替耐、磺酰脲、胰島素、HMG-CoA還原酶抑制劑、角鯊烯合成抑制劑、貝特類化合物、LDL分解代謝增強(qiáng)劑、血管收縮素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑、脂肪酶抑制劑、血清素和/或去甲腎上腺素釋放劑或再攝取抑制劑的藥物的藥劑組合使用。
本發(fā)明的一些實(shí)施例包括醫(yī)藥組合物，其包含由本發(fā)明的方法鑒別的化合物或其醫(yī)藥學(xué)上可接受的鹽與至少一種選自由下列各物組成的群組的成員的組合α-葡糖苷酶抑制劑、醛糖還原酶抑制劑、雙胍、HMG-CoA還原酶抑制劑、角鯊烯合成抑制劑、貝特類化合物、LDL分解代謝增強(qiáng)劑和血管收縮素轉(zhuǎn)化酶抑制劑。在另一實(shí)施例中，HMG-CoA還原酶抑制劑是選自由普瓦他汀、辛伐他汀、洛伐他汀、阿伐他汀、氟伐他汀和利匹妥組成的群組。
根據(jù)本發(fā)明，可通過(guò)使各別活性組份一起或獨(dú)立地與上文所述的生理學(xué)上可接受的載劑、賦形劑、粘合劑、稀釋劑等混合并且經(jīng)口或不經(jīng)口投與一種或一種以上醫(yī)藥組合物形式的混合物來(lái)使用所述組合。當(dāng)作為組合療法或預(yù)防投與化合物或化合物混合物與另一活性化合物時(shí)，可將治療劑調(diào)配為在相同時(shí)間或不同時(shí)間給藥的單獨(dú)醫(yī)藥組合物，或可提供單一組合物形式的治療劑。
本發(fā)明還提供制造包含醫(yī)藥組合物的藥物的方法，所述醫(yī)藥組合物包含、基本上由或由用作代謝穩(wěn)定化合物的可根據(jù)以下方法鑒別的代謝穩(wěn)定化合物組成a)使候選化合物與GPR43接觸，和b)測(cè)定GPR43功能性是否降低，其中GPR43功能性降低表明候選化合物是代謝穩(wěn)定化合物。
本發(fā)明進(jìn)一步提供制造包含醫(yī)藥組合物的藥物的方法，所述醫(yī)藥組合物包含、基本上由或由用于治療代謝相關(guān)疾病的可根據(jù)以下方法鑒別的代謝穩(wěn)定化合物組成a)使候選化合物與GPR43接觸，和b)測(cè)定GPR43功能性是否降低，其中GPR43功能性降低表明候選化合物是代謝穩(wěn)定化合物。
本發(fā)明還涉及增加GPR43功能的方法，其包含使GPR43與有效量的GPR43激動(dòng)劑接觸。本發(fā)明還涉及增加細(xì)胞中GPR43功能的方法，其包含使表達(dá)GPR43的細(xì)胞與有效量的GPR43激動(dòng)劑接觸。細(xì)胞可例如在個(gè)體體內(nèi)，或細(xì)胞可為已分離的細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，所述激動(dòng)劑為先前未知的當(dāng)與GPR43受體結(jié)合時(shí)活化胞內(nèi)反應(yīng)的物質(zhì)。
本發(fā)明還涉及降低GPR43功能的方法，其包含使GPR43與有效量的GPR43反向激動(dòng)劑或拮抗劑接觸。本發(fā)明還涉及降低細(xì)胞內(nèi)GPR43功能的方法，其包含使表達(dá)GPR43的細(xì)胞與有效量的GPR43反向激動(dòng)劑或拮抗劑接觸。細(xì)胞可例如在個(gè)體體內(nèi)，或細(xì)胞可為已分離的細(xì)胞。
本發(fā)明提供治療或預(yù)防代謝相關(guān)病癥的方法，其包含向有此需要的個(gè)體投與有效量的GPR43調(diào)節(jié)劑。
在一實(shí)施例中，所述代謝相關(guān)病癥為低血糖癥或衰老。在一實(shí)施例中，所述調(diào)節(jié)劑為激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，所述激動(dòng)劑為先前未知的當(dāng)與GPR43受體結(jié)合時(shí)活化胞內(nèi)反應(yīng)的物質(zhì)。
在一實(shí)施例中，所述代謝相關(guān)病癥為胰島素抵抗、葡萄糖耐受性異?；蛱悄虿　Ｔ谝恍?shí)施例中，所述代謝相關(guān)病癥包括高血糖癥、高胰島素血癥、高脂血癥、高甘油三酯血癥、高膽固醇血癥、血脂異常、肥胖癥、X綜合癥、動(dòng)脈粥樣硬化、心臟病、中風(fēng)、高血壓或末梢血管疾病。在一實(shí)施例中，所述調(diào)節(jié)劑為反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一實(shí)施例中，所述方法進(jìn)一步包含向所述個(gè)體投與有效量的用于治療糖尿病、血脂病癥或肥胖癥的藥劑與有效量的GPR43反向激動(dòng)劑或拮抗劑的組合。在一實(shí)施例中，所述代謝相關(guān)病癥為胰島素抵抗、葡萄糖耐受性異?；蛱悄虿?。在一實(shí)施例中，所述代謝相關(guān)病癥為II型糖尿病。在一實(shí)施例中個(gè)體為哺乳動(dòng)物，且在另一實(shí)施例中個(gè)體為人類。
本發(fā)明涉及治療或預(yù)防可通過(guò)增加GPR43功能來(lái)治療或預(yù)防的病癥的方法，其包含向有此需要的個(gè)體投與有效量的GPR43激動(dòng)劑。在一實(shí)施例中，所述病癥為代謝相關(guān)病癥。在一些實(shí)施例中，所述代謝相關(guān)病癥為低血糖癥或衰老。在一些實(shí)施例中，所述激動(dòng)劑為先前未知的當(dāng)與GPR43受體結(jié)合時(shí)活化胞內(nèi)反應(yīng)的物質(zhì)。
本發(fā)明提供治療或預(yù)防可通過(guò)降低GPR43功能來(lái)治療或預(yù)防的病癥的方法，其包含向有此需要的個(gè)體投與有效量的GPR43反向激動(dòng)劑或拮抗劑。在一實(shí)施例中，所述病癥為代謝相關(guān)病癥。在一實(shí)施例中，所述代謝相關(guān)病癥為胰島素抵抗、葡萄糖耐受性異常、糖尿病、高血糖癥、高胰島素血癥、高脂血癥、高甘油三酯血癥、高膽固醇血癥、血脂異常、肥胖癥、X綜合癥、動(dòng)脈粥樣硬化、心臟病、中風(fēng)、高血壓或末梢血管疾病。在一些實(shí)施例中，所述代謝相關(guān)病癥為胰島素抵抗、葡萄糖耐受性異常或糖尿病。在一實(shí)施例中，所述代謝相關(guān)病癥為II型糖尿病。在一實(shí)施例中，所述方法進(jìn)一步包含向所述個(gè)體投與有效量的用于治療糖尿病、血脂病癥或肥胖癥的藥劑與有效量的GPR43反向激動(dòng)劑或拮抗劑的組合。在一實(shí)施例中個(gè)體為哺乳動(dòng)物，且在另一實(shí)施例中個(gè)體為人類。
本發(fā)明還涉及增加有此需要的個(gè)體的血糖含量的方法，其包含向所述個(gè)體投與有效量的GPR43激動(dòng)劑。本發(fā)明還涉及降低有此需要的個(gè)體的血糖含量的方法，其包含向所述個(gè)體投與有效量的GPR43反向激動(dòng)劑或拮抗劑。
此外，本發(fā)明涉及降低有此需要的個(gè)體的胰島素分泌的方法，其包含向所述個(gè)體投與有效量的GPR43激動(dòng)劑。
本發(fā)明的一個(gè)目的涉及以下方法a)進(jìn)行本發(fā)明的方法以鑒別代謝穩(wěn)定化合物；和b)視情況，確定所述化合物的結(jié)構(gòu)；和c)提供所述化合物或所述化合物的名稱或結(jié)構(gòu)。此外，本發(fā)明涉及以下方法a)進(jìn)行本發(fā)明的方法以鑒別代謝穩(wěn)定化合物；和b)視情況，確定所述化合物的結(jié)構(gòu)；c)視情況，提供所述化合物的名稱或結(jié)構(gòu)；和d)制造或合成所述化合物。本發(fā)明另外涉及調(diào)節(jié)GPCR的功能性的方法，其包含進(jìn)行本發(fā)明的方法以鑒別代謝穩(wěn)定化合物，且隨后在足以調(diào)節(jié)GPCR功能性的條件下，使GPCR與所述代謝穩(wěn)定化合物接觸或?qū)⑺龃x穩(wěn)定化合物投與個(gè)體。
申請(qǐng)者保留從本發(fā)明的任何實(shí)施例中排除任一種或一種以上候選化合物的權(quán)利。申請(qǐng)者還保留從本發(fā)明的任何實(shí)施例中排除任一種或一種以上調(diào)節(jié)劑的權(quán)利。申請(qǐng)者另外還保留從本發(fā)明的任何實(shí)施例中排除任何聚核苷酸或多肽的權(quán)利。申請(qǐng)者另外還保留從本發(fā)明的任何實(shí)施例中排除任何代謝相關(guān)病癥的權(quán)利。
所屬領(lǐng)域技術(shù)人員基于對(duì)本專利文獻(xiàn)的回顧將了解所公開的受體和方法的其它用途。
提供以下實(shí)例以說(shuō)明本發(fā)明，且所述實(shí)例不打算以任何方式限制本發(fā)明實(shí)例提供實(shí)例以進(jìn)一步定義本發(fā)明，然而，所述實(shí)例不將本發(fā)明限于這些實(shí)例的細(xì)節(jié)。
實(shí)例1小鼠成年和胎兒組織和細(xì)胞中小鼠GPR43表達(dá)的Affymetrix基因芯片分析在本實(shí)例中，使用Affymetrix基因芯片測(cè)定若干小鼠成年和胎兒組織和細(xì)胞中小鼠GPR43的表達(dá)水平(由左至右為胎腦、腦橋脊髓、下半部脊髓、SN腦橋丘腦(SN ponsthalamus)、嗅球、丘腦、海馬區(qū)(hippocampus)、swiss-3T3、3T3-LI脂肪細(xì)胞、BV2+LPS 24hr、NIH-3T3、3T3-LI前脂肪細(xì)胞、NIT-1、分化的N1E-115、E14TG2A、BV2、N1E-115、BV2+LPS4hr、NIT CTL、C57BL6 ES、D3 ES、淋巴結(jié)、骨髓、T細(xì)胞、CD4+卵清蛋白、脾、T細(xì)胞、CD4+天然細(xì)胞、胸腺、十二指腸、皮膚脂肪、褐色脂肪、附睪脂肪、心室、心房、大動(dòng)脈、纖維原細(xì)胞、新生兒心臟、心肌細(xì)胞、缺氧-再給氧(hypoxia-reoxyg)、新生兒、心肌細(xì)胞、常氧(normoxia)、新生兒、心肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、缺氧、新生兒、心室、左TAC、心室、左側(cè)sham(left sham)、近側(cè)大腸、胃糜(stomachfondues)、小腸、大腸末梢、胃竇、白血細(xì)胞、肝臟、肺、氣管、唾液腺、骨、纖維原細(xì)胞、真皮、腎上腺、骨骼肌、皮膚、膀胱、皮膚、嘴、口腔粘膜、嘴、表皮、食道、腎、膽囊、β胰島、ob/ob16 wk、β胰島、ob/ob 6wk、MIN6、βTC6、β胰島、C57B1/6、αTC9、β胰島、db/db、子宮、臍帶、卵巢)。
1.AFFYMETRIX GENECHIP技術(shù)將與若干G蛋白偶合受體(GPCR)對(duì)應(yīng)的核苷酸序列提交給Affymetrix。Affymetrix設(shè)計(jì)并制造出寡核苷酸微陣列以用于經(jīng)由GeneChip技術(shù)測(cè)量在各種組織中這些受體的mRNA表達(dá)水平。擴(kuò)增來(lái)自大量組織和細(xì)胞類型的RNA樣本，標(biāo)記，使其與微陣列雜交，并且根據(jù)制造商的說(shuō)明分析數(shù)據(jù)。
如果表達(dá)指數(shù)大于50(基于并根據(jù)制造商的說(shuō)明)，那么確定GPCR得到表達(dá)。分析數(shù)據(jù)，且數(shù)據(jù)表明，由于先前已報(bào)導(dǎo)神經(jīng)元組織中所表達(dá)的大量已知GPCR具有大于50的表達(dá)指數(shù)，故以大于50的表達(dá)指數(shù)來(lái)分類GPCR是合理的。
使用GeneChip，申請(qǐng)者發(fā)現(xiàn)GPR43在脂肪、大腸、胰島及胰島細(xì)胞系和3T3脂肪細(xì)胞中具有高表達(dá)水平(參看圖1)。
實(shí)例2對(duì)于人類和小鼠組織和細(xì)胞中GPR43表達(dá)的RT-PCR分析在本實(shí)例中，使用RT-PCR分析測(cè)定若干人類和小鼠組織和細(xì)胞類型中人類和小鼠GPR43的表達(dá)水平。如圖2所示，在上圖中，觀察到若干人類組織和細(xì)胞中的人類GPR43基因表達(dá)，所述人類組織和細(xì)胞例如包括胎盤、肺、肝臟、腎、胰腺、脾、前列腺和白細(xì)胞。此外，如圖2所示，在下圖中，觀察到若干小鼠組織、細(xì)胞和細(xì)胞系中的小鼠GPR43基因表達(dá)，所述小鼠組織、細(xì)胞和細(xì)胞系例如包括肺、胰腺、骨骼肌、小腸、脾、胃、胰島3T3-L1分化脂肪細(xì)胞、Nit-1細(xì)胞、Min6細(xì)胞和βTC-6細(xì)胞。
就本實(shí)驗(yàn)而言，人類cDNA是從Human MTC Panel I和Human MTC Panel II(Clontech)獲得。小鼠PolyA+RNA是從Clontech獲得。隨后，根據(jù)制造商的方案用iScript cDNA合成試劑盒(Bio-Rad)合成cDNA。將1μl經(jīng)1∶10稀釋的小鼠PolyA+、8μl5×iScript反應(yīng)混合物和2μliScript反轉(zhuǎn)錄酶連同水組合成40μl的總體積以用于反應(yīng)。于PCR機(jī)器中執(zhí)行反應(yīng)在25℃下執(zhí)行5分鐘；42℃下30分鐘；85℃下5分鐘。
使用Trizol分離細(xì)胞系RNA和小鼠胰島RNA，并且根據(jù)制造商的方案使用無(wú)DNA試劑盒(Ambion)用DNA酶進(jìn)一步進(jìn)行處理。使用iScript cDNA合成試劑盒(Bio-Rad)，使用40μl總反應(yīng)體積的2μg經(jīng)DNA酶處理的RNA。
用Invitrogen的Platinum PCR Supermix進(jìn)行人類和小鼠GPR43的PCR反應(yīng)。對(duì)于各反應(yīng)而言，將2μl cDNA、48μl Supermix、0.2μl各引物(100μM儲(chǔ)備液)組合成50μl的總體積。在PCR機(jī)器中進(jìn)行人類GPR43的反應(yīng)在95℃下變性4分鐘，隨后進(jìn)行30個(gè)以下循環(huán)95℃下1分鐘、60℃下30秒、72℃下1分鐘，最后以在72℃下延長(zhǎng)7分鐘作為終止。小鼠GPR35所使用的退火溫度為63℃。
由Clontech提供G3PDH 5′和3′PCR引物在Human MTC Panel I和II中作為對(duì)照。就G3PDH PCR反應(yīng)而言，將2μl cDNA、45μl Platinum PCR Supermix(Invitrogen)、1μl各引物(10μM儲(chǔ)備液)組合成50μl的總體積。在PCR機(jī)器中進(jìn)行反應(yīng)在95℃變性1分鐘，隨后進(jìn)行23個(gè)以下循環(huán)95℃下30秒、68℃下3分鐘，最后以在68℃下延長(zhǎng)3分鐘作為終止。
人類GPR43 RT-PCR引物對(duì)
正向5′-CTCTGGTGGCCTGGGTTATGTCCT-3′(SEQ IDNO3)反向5′-CCTGCGCACCACTGAAGAAGAGAA-3′(SEQ ID NO4)小鼠GPR43 RT-PCR引物對(duì)正向5′-GTTATCCCGCCGGCCACTGTATG-3′(SEQ ID NO5)反向5′-GCGCACCACGGAGGAGGAGAAG-3′(SEQ ID NO6)實(shí)例3鑒別GPR43調(diào)節(jié)劑在本實(shí)例中，使用篩檢方案于黑素細(xì)胞中鑒別GPR43調(diào)節(jié)劑。
1.黑素細(xì)胞技術(shù)黑素細(xì)胞是在低等脊椎動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的皮膚細(xì)胞。其含有被稱為黑素體的著色細(xì)胞器。當(dāng)G蛋白偶合受體(GPCR)活化時(shí)，黑素細(xì)胞能夠使這些黑素體沿微管網(wǎng)絡(luò)重新分布。這種色素移動(dòng)的結(jié)果是可見(jiàn)的細(xì)胞變亮或變暗。在黑素細(xì)胞中，由Gi偶合受體活化所引起的胞內(nèi)cAMP含量降低使得黑素體遷移到細(xì)胞中心，從而導(dǎo)致顏色顯著變亮。如果Gs偶合受體活化后cAMP含量隨后升高，那么黑素體再分散，且細(xì)胞再次變暗。由Gq偶合受體活化所引起的二?；视秃康脑黾右部梢哉T導(dǎo)這種再分散。此外，所述技術(shù)也適用于研究某些受體酪氨酸激酶。黑素細(xì)胞的反應(yīng)在受體活化后數(shù)分鐘內(nèi)發(fā)生，并且導(dǎo)致簡(jiǎn)單穩(wěn)固的顏色改變。使用常規(guī)吸光度酶標(biāo)儀(absorbance microplate reader)或適度視頻成像系統(tǒng)(modest video imaging system)可輕易地檢測(cè)所述反應(yīng)。與其它皮膚細(xì)胞不同，黑素細(xì)胞是來(lái)源于神經(jīng)嵴，并且似乎表達(dá)信號(hào)蛋白(signaling protein)的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列。具體說(shuō)來(lái)，細(xì)胞表達(dá)廣泛范圍的G蛋白且因此能夠功能性地表達(dá)幾乎所有的GPCR。
可利用黑素細(xì)胞鑒別與GPCR結(jié)合和/或活化GPCR的化合物，包括天然配體?？赏ㄟ^(guò)引入能夠?qū)μ囟ù碳の锲鸱磻?yīng)而分散或聚集其色素并表達(dá)編碼GPCR的外源克隆的色素細(xì)胞系的測(cè)試細(xì)胞來(lái)進(jìn)行本方法?？墒褂美缤屎诩に?、MSH或光來(lái)設(shè)置色素配置的起始狀態(tài)。隨后使測(cè)試細(xì)胞與化合物接觸，并且測(cè)定細(xì)胞中的色素配置是否自色素配置的起始狀態(tài)有所改變。由候選化合物(包括但不限于配體)偶合至GPCR而引起的色素細(xì)胞分散在培養(yǎng)皿(petri dish)上看起來(lái)較暗，而色素細(xì)胞聚集看起來(lái)較亮。
遵循美國(guó)專利第5,462,856號(hào)和美國(guó)專利第6,051,386號(hào)的公開內(nèi)容中的材料和方法。這些專利的公開內(nèi)容是以全文引用的方式并入本文中。
用含有小鼠或人類GPR43的編碼序列的質(zhì)粒通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)染黑素細(xì)胞。將細(xì)胞涂在96孔板上。在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，用10nM褪黑激素處理各培養(yǎng)板上的半數(shù)細(xì)胞。褪黑激素活化黑素細(xì)胞中的內(nèi)源Gi偶合受體，并且使它們聚集其色素。將剩余的半數(shù)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到無(wú)血清培養(yǎng)基0.7×L-15(Gibco)中。1小時(shí)后，無(wú)血清培養(yǎng)基中的細(xì)胞保持色素分散狀態(tài)，而經(jīng)褪黑激素處理的細(xì)胞處于色素聚集狀態(tài)。此時(shí)，用來(lái)自含有140,000-150,000種有機(jī)小分子化合物的專賣化合物文庫(kù)的不同化合物處理細(xì)胞。如果GPR43與化合物結(jié)合，那么預(yù)期黑素細(xì)胞將經(jīng)歷顏色改變，例如這是由于對(duì)化合物起反應(yīng)而引起的色素聚集。
實(shí)例4口服葡萄糖耐受性測(cè)試可于經(jīng)口投與葡萄糖后測(cè)試GPR43調(diào)節(jié)劑(諸如激動(dòng)劑、拮抗劑或反向激動(dòng)劑)對(duì)血漿葡萄糖的影響。
舉例而言，可使67天大的雄性C57bl/6小鼠禁食18小時(shí)，且將其隨機(jī)分組以接收所選劑量的GPR43調(diào)節(jié)劑或媒劑(含有80％PEG、10％吐溫80(Tween80)和10％乙醇的PET)。經(jīng)由管飼針(gavage needle)經(jīng)口傳遞GPR43調(diào)節(jié)劑(口服體積100μl)。投與GPR43調(diào)節(jié)劑或媒劑后30分鐘，以3g/kg劑量經(jīng)口向小鼠投與右旋糖。在若干時(shí)間點(diǎn)使用Glucometer Elite XL(Bayer)測(cè)定血糖含量。
也可以使用腹膜內(nèi)傳遞葡萄糖來(lái)測(cè)試葡萄糖耐受性。舉例而言，禁食18小時(shí)后，用100mg/kg的GPR43調(diào)節(jié)劑或PET媒劑處理68天大的雄性C57B1/6小鼠。投與GPR43調(diào)節(jié)劑或媒劑后30分鐘，以2g/kg劑量經(jīng)腹膜內(nèi)向小鼠投與右旋糖。在所選時(shí)間點(diǎn)使用Glucometer Elite XL(Bayer)測(cè)定血糖含量。
實(shí)例53T3-L1脂肪細(xì)胞中胰島素刺激的葡萄糖攝取在本實(shí)例中，使用3H-2-脫氧葡萄糖攝取分析測(cè)試GPR43調(diào)節(jié)劑對(duì)脂肪細(xì)胞中胰島素刺激的葡萄糖攝取的影響。
簡(jiǎn)言之，首先使用標(biāo)準(zhǔn)方案使3T3-L1細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞(Patel和Lane，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.961279-1284(1999))。隨后用含有媒劑或5μM GPR43調(diào)節(jié)劑的無(wú)血清培養(yǎng)基刺激細(xì)胞三小時(shí)。隨后于Krebs-Ringer磷酸鹽緩沖液中洗滌細(xì)胞兩次，并且在存在或不存在10nM胰島素的情況下，于Krebs-Ringer磷酸鹽緩沖液中培育20分鐘。通過(guò)在37℃下將0.05mM(0.5μCi/mol)3H-2-脫氧葡萄糖和0.05mM冷2-脫氧葡萄糖加入細(xì)胞中歷時(shí)5分鐘來(lái)測(cè)量2-脫氧葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)。為終止轉(zhuǎn)運(yùn)反應(yīng)，用冰冷的PBS洗滌細(xì)胞三次，并將其溶解于1％Triton-X中。通過(guò)閃爍計(jì)數(shù)測(cè)定溶解產(chǎn)物中的放射性含量。
實(shí)例6用于確定GPCR活化的分析可用多種方法評(píng)定人類GPCR的活化。下文具有說(shuō)明性；相信所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將有能力確定那些優(yōu)選有益于技術(shù)人員的需要的技術(shù)。
1.膜結(jié)合分析[35S]GTPγS分析當(dāng)G蛋白偶合受體處于其活性狀態(tài)時(shí)，由于配體結(jié)合或組成性活化，受體與G蛋白偶合并且刺激GDP釋放和隨后GTP與G蛋白的結(jié)合。G蛋白-受體復(fù)合物中的α亞單元充當(dāng)GTP酶，并且緩慢地將GTP水解成GDP，此時(shí)受體通常失活?；罨荏w繼續(xù)以GTP交換GDP。可利用不可水解的GTP類似物[35S]GTPγS證實(shí)[35S]GTPγS與表達(dá)活化受體的膜的結(jié)合的增強(qiáng)。使用[35S]GTPγS結(jié)合測(cè)量活化的優(yōu)勢(shì)在于(a)其一般適用于所有G蛋白偶合受體；(b)其接近膜表面從而使其不太可能提取影響胞內(nèi)級(jí)聯(lián)的分子。
所述分析利用G蛋白偶合受體刺激[35S]GTPγS與表達(dá)相關(guān)受體的膜結(jié)合的能力。因此，所述分析可用于直接鑒別方法中以篩檢內(nèi)源GPCR和非內(nèi)源組成性活化GPCR的候選化合物。所述分析為通用分析，并且可用于有關(guān)所有G蛋白偶合受體的藥物發(fā)現(xiàn)中。
將[35S]GTPγS分析物于20mM HEPES和1mM與約20mM之間的MgCl2(為優(yōu)化結(jié)果，可對(duì)所述量進(jìn)行調(diào)節(jié)，但優(yōu)選20mM)(pH7.4)、具有約0.3nM與約1.2nM之間的[35S]GTPγS(為優(yōu)化結(jié)果，可對(duì)所述量進(jìn)行調(diào)節(jié)，但優(yōu)選1.2nM)和12.5至75μg膜蛋白(例如表達(dá)GPR43的293細(xì)胞；為優(yōu)化結(jié)果，可對(duì)所述量進(jìn)行調(diào)節(jié))和10μM GDP(為優(yōu)化結(jié)果，可對(duì)所述量進(jìn)行調(diào)節(jié))的結(jié)合緩沖液中培育1小時(shí)。隨后加入麥芽凝集素珠粒(25μl；Amersham)并且在室溫下再培育混合物30分鐘。隨后在室溫下以1500×g使管離心5分鐘，且隨后于閃爍計(jì)數(shù)器中進(jìn)行計(jì)數(shù)。
2.腺苷?；h(huán)化酶可修飾針對(duì)基于細(xì)胞的分析而設(shè)計(jì)的Flash PlateTM腺苷?；h(huán)化酶試劑盒(NewEngland Nuclear；目錄號(hào)SMP004A)以與粗原生質(zhì)膜一起使用。Flash Plate的孔中可含有閃爍體涂層，所述涂層還含有識(shí)別cAMP的特異性抗體?？赏ㄟ^(guò)對(duì)放射性cAMP示蹤劑與cAMP抗體的結(jié)合的直接競(jìng)爭(zhēng)來(lái)量化所述孔中所產(chǎn)生的cAMP。下文是用作有關(guān)測(cè)量表達(dá)受體的全細(xì)胞中cAMP含量改變的簡(jiǎn)要方案。
瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后大約24小時(shí)，采集經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。小心抽吸出培養(yǎng)基并丟棄。小心地將10ml PBS加入每一盤細(xì)胞中，隨后小心抽吸。將1ml Sigma細(xì)胞解離緩沖液和3mlPBS加入每一培養(yǎng)板中。將細(xì)胞從培養(yǎng)板中吸出，并且將細(xì)胞懸浮液收集于50ml圓錐形離心管中。隨后在室溫下以1,100rpm離心細(xì)胞5分鐘。小心地將細(xì)胞小球再懸浮于適當(dāng)體積的PBS(每培養(yǎng)板約3ml)中。隨后使用血球計(jì)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并且加入額外的PBS以得到適當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞(最終體積為每孔約50μl)。
根據(jù)制造商的說(shuō)明書制備cAMP標(biāo)準(zhǔn)品和檢測(cè)緩沖液(包含1μCi示蹤劑[125I]cAMP(50μl)的11ml檢測(cè)緩沖液)并加以保存。新鮮制備分析緩沖液以供篩檢，且其含有50μl刺激緩沖液、3μl候選化合物(12μM最終分析濃度)和50μl細(xì)胞。將分析緩沖液儲(chǔ)存于冰上待用。通過(guò)將50μlcAMP標(biāo)準(zhǔn)品加入適當(dāng)?shù)目字须S后將50μl PBSA加入孔H11和H12中來(lái)起始優(yōu)選在例如96孔板中進(jìn)行的分析。將50μl刺激緩沖液加入所有孔中。使用能夠分配3μl化合物溶液的針具(pin tool)將DMSO(或所選候選化合物)加入適當(dāng)孔中，其中具有12μM候選化合物的最終分析濃度和100μl的總分析體積。隨后將細(xì)胞加入孔中，并在室溫下培育60分鐘。隨后將100μl含有示蹤劑cAMP的檢測(cè)混合物加入孔中。隨后再培育培養(yǎng)板2小時(shí)，隨后于Wallac MicroBeta閃爍計(jì)數(shù)器中進(jìn)行計(jì)數(shù)。然后由標(biāo)準(zhǔn)cAMP曲線外推每一分析培養(yǎng)板中所含的每孔cAMP值。
3.有關(guān)Gi偶合目標(biāo)GPCR的基于細(xì)胞的cAMP分析TSHR為活化時(shí)引起cAMP積累的Gs偶合GPCR?？赏ㄟ^(guò)使氨基酸殘基623突變(意即，將丙氨酸殘基改變成異亮氨酸殘基)來(lái)組成性活化TSHR。預(yù)期Gi偶合受體將抑制腺苷?；h(huán)化酶，且因此降低cAMP產(chǎn)生水平，可由此對(duì)cAMP含量激發(fā)進(jìn)行評(píng)定。通過(guò)使作為“信號(hào)增強(qiáng)子”的非內(nèi)源組成性活化TSHR(TSHR-A623I)(或內(nèi)源性組成性活性Gs偶合受體)與Gi連接的目標(biāo)GPCR共轉(zhuǎn)染以建立cAMP的基線含量，來(lái)實(shí)現(xiàn)用于測(cè)量作為Gi偶合受體活化的指標(biāo)的cAMP產(chǎn)量降低的有效技術(shù)。產(chǎn)生內(nèi)源或非內(nèi)源型式的Gi偶合受體后，然后使目標(biāo)GPCR與信號(hào)增強(qiáng)子共轉(zhuǎn)染，并且可將所述材料用于篩檢。在一些實(shí)施例中，優(yōu)選將這一方法用于直接鑒別Gi偶合受體的候選化合物。應(yīng)注意，對(duì)于Gi偶合GPCR而言，當(dāng)使用本方法時(shí)，目標(biāo)GPCR的反向激動(dòng)劑將增加cAMP信號(hào)，而激動(dòng)劑將減少cAMP信號(hào)。
第一天時(shí)，將板涂成每孔2×104個(gè)293細(xì)胞。第二天時(shí)，制備兩個(gè)反應(yīng)管(每一管遵循的比例是對(duì)于每一培養(yǎng)板而言)管A是通過(guò)在1.2ml無(wú)血清DMEM(IrvineScientific，Irvine，CA)中混合2μg轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的每一受體的DNA(共4μgDNA(例如，pCMV載體；具有突變THSR(TSHR-A623I)的pCMV載體；TSHR-A623I和GPCR等))來(lái)制備；管B是通過(guò)在1.2ml無(wú)血清DMEM中混合120μl Lipofectamine(Gibco BRL)來(lái)制備。隨后通過(guò)倒轉(zhuǎn)(數(shù)次)使管A和B混合，隨后在室溫下培育30-45分鐘。所述混合物被稱為“轉(zhuǎn)染混合物”。用1×PBS洗滌所涂布的293細(xì)胞，隨后加入10ml無(wú)血清DMEM。然后將2.4ml轉(zhuǎn)染混合物加入細(xì)胞中，隨后在37℃/5％CO2下培育4小時(shí)。然后通過(guò)抽吸移除轉(zhuǎn)染混合物，隨后加入25ml DMEM/10％胎牛血清。隨后在37℃/5％CO2下培育細(xì)胞。24小時(shí)培育后，采集細(xì)胞并將其用于分析。
設(shè)計(jì)Flash PlateTM腺苷?；h(huán)化酶試劑盒(New England Nuclear；目錄號(hào)SMP004A)以供基于細(xì)胞的分析，但視所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的需要可對(duì)其進(jìn)行修飾以與粗原生質(zhì)膜一起使用。Flash Plate的孔中含有閃爍體涂層，所述涂層還含有識(shí)別cAMP的特異性抗體?？赏ㄟ^(guò)對(duì)放射性cAMP示蹤劑與cAMP抗體的結(jié)合的直接競(jìng)爭(zhēng)來(lái)量化所述孔中所產(chǎn)生的cAMP。下文是用作有關(guān)測(cè)量表達(dá)所關(guān)注的受體的全細(xì)胞中cAMP含量改變的簡(jiǎn)要方案。
瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后大約24小時(shí)，采集經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。小心抽吸出培養(yǎng)基并丟棄。小心地將10ml PBS加入每一盤細(xì)胞中，隨后小心抽吸。將1ml Sigma細(xì)胞解離緩沖液和3mlPBS加入每一培養(yǎng)板中。將細(xì)胞從培養(yǎng)板中吸出，并且將細(xì)胞懸浮液收集于50ml圓錐形離心管中。隨后在室溫下以1,100rpm離心細(xì)胞5分鐘。小心地將細(xì)胞小球再懸浮于適當(dāng)體積的PBS(每培養(yǎng)板約3ml)中。隨后使用血球計(jì)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并且加入額外的PBS以得到適當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞(最終體積為每孔約50μl)。
根據(jù)制造商的說(shuō)明書制備cAMP標(biāo)準(zhǔn)品和檢測(cè)緩沖液(包含1μCi示蹤劑[125I]cAMP(50μl)的11ml檢測(cè)緩沖液)并加以保存。應(yīng)新鮮制備分析緩沖液以供篩檢，且其含有50μl刺激緩沖液、3μl候選化合物(12μM最終分析濃度)和50μl細(xì)胞。將分析緩沖液儲(chǔ)存于冰上待用?？赏ㄟ^(guò)將50μl cAMP標(biāo)準(zhǔn)品加入適當(dāng)孔中隨后將50μl PBSA加入孔H11和H12中來(lái)起始分析。將50μl刺激緩沖液加入所有孔中。使用能夠分配3μl化合物溶液的針具將所選化合物(例如TSH)加入適當(dāng)孔中，其中具有12μM候選化合物的最終分析濃度和100μl的總分析體積。隨后將細(xì)胞加入孔中，并在室溫下培育60分鐘。隨后將100μl含有示蹤劑cAMP的檢測(cè)混合物加入孔中。隨后再培育培養(yǎng)板2小時(shí)，隨后于Wallac MicroBeta閃爍計(jì)數(shù)器中進(jìn)行計(jì)數(shù)。由每一分析培養(yǎng)板中所含的標(biāo)準(zhǔn)cAMP曲線外推每孔cAMP值。
4.基于報(bào)告基因的分析a.CRE-LUC報(bào)告基因分析(Gs相關(guān)受體)以每孔2×104個(gè)細(xì)胞的密度將293或293T細(xì)胞涂布于96孔培養(yǎng)板上，并且根據(jù)制造商的說(shuō)明書于次日使用Lipofectamine試劑(BRL)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。如下制備用于每六孔轉(zhuǎn)染的DNA/脂質(zhì)混合物小心地使100μl DMEM中的260ng質(zhì)粒DNA與100μl DMEM中的2μl脂質(zhì)混合(260ng質(zhì)粒DNA是由200ng8×CRE-Luc報(bào)告基因質(zhì)粒、50ng包含內(nèi)源受體或非內(nèi)源受體的pCMV或單獨(dú)pCMV和10ng GPRS表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3中的GPRS(Invitrogen))組成)。如下制備8×CRE-Luc報(bào)告基因質(zhì)粒通過(guò)在pβgal-Basic載體(Clontech)中的BglV-HindIII位點(diǎn)處克隆大鼠生長(zhǎng)激素抑制素啟動(dòng)子(-71/+51)來(lái)獲得載體SRIF-β-gal。通過(guò)PCR由腺病毒模板AdpCF126CCRE8獲得八(8)個(gè)cAMP反應(yīng)元件的拷貝(參看Suzuki等人，Hum Gene Ther71883-1893(1996)，其公開內(nèi)容以全文引用的方式并入本文中)，并且將其克隆至SRIF-β-gal載體的Kpn-BglV位點(diǎn)處，從而產(chǎn)生8×CRE-β-gal報(bào)告基因載體。通過(guò)用自pGL3-basic載體(Promega)獲得的熒光素酶基因在HindIII-BamHI位點(diǎn)處置換8×CRE-β-gal報(bào)告基因載體中的β-半乳糖苷酶基因來(lái)產(chǎn)生8×CRE-Luc報(bào)告基因質(zhì)粒。室溫下培育30分鐘后，用400μl DMEM稀釋DNA/脂質(zhì)混合物，并且將100μl經(jīng)稀釋的混合物加入每一孔中。在細(xì)胞培養(yǎng)恒溫箱中培育4小時(shí)后，將100μl具有10％FCS的DMEM加入每一孔中。次日，用每孔200μl具有10％FCS的DMEM交換經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。八(8)小時(shí)后，用PBS洗滌一次，隨后將孔換成每孔100μl無(wú)酚紅的DMEM。次日，遵循制造商的說(shuō)明書，使用LucLiteTM報(bào)告基因分析試劑盒(Packard)測(cè)量熒光素酶活性，且于1450 MicroBetaTM閃爍和發(fā)光計(jì)數(shù)器(Wallac)上讀取。
b.AP1報(bào)告基因分析(Gq相關(guān)受體)檢測(cè)Gq刺激的方法取決于Gq依賴性磷脂酶C使在啟動(dòng)子中含有AP1元件的基因活化的已知特性。遵循上文有關(guān)CREB報(bào)告基因分析所述的方案，可利用PathdetectTMAP-1順式報(bào)告系統(tǒng)(Stratagene，目錄號(hào)219073)，但是磷酸鈣沉淀物的組份為410ngpAP1-Luc、80ng pCMV受體表達(dá)質(zhì)粒和20ng CMV-SEAP。
c.SRF-LUC報(bào)告基因分析(Gq相關(guān)受體)一種檢測(cè)Gq刺激的方法取決于Gq依賴性磷脂酶C使在啟動(dòng)子中含有血清反應(yīng)因子的基因活化的已知特性?？衫肞athdetectTMSKF-Luc-報(bào)告系統(tǒng)(Stratagene)分析例如COS7細(xì)胞中的Gq偶合活性。根據(jù)制造商的說(shuō)明書，使用Mammalian TransfectionTM試劑盒(Stratagene，目錄號(hào)200285)以系統(tǒng)的質(zhì)粒組份和編碼內(nèi)源或非內(nèi)源性GPCR的指定表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。簡(jiǎn)言之，根據(jù)制造商的說(shuō)明書，使410ng SRF-Luc、80ngpCMV受體表達(dá)質(zhì)粒和20ng CMV-SEAP(經(jīng)分泌的堿性磷酸酶表達(dá)質(zhì)粒；測(cè)量經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)基中的堿性磷酸酶活性以控制樣本之間的轉(zhuǎn)染效率變化)組合于磷酸鈣沉淀物中。將一半沉淀物均等地分布于96孔板中的3個(gè)孔上，并且在無(wú)血清培養(yǎng)基中的細(xì)胞上保持24小時(shí)。在最后5小時(shí)將細(xì)胞與例如1μM候選化合物一起培育。隨后溶解細(xì)胞，并根據(jù)制造商的說(shuō)明書使用LucliteTM試劑盒(Packard，目錄號(hào)6016911)和“Trilux1450 Microbeta”液體閃爍和發(fā)光計(jì)數(shù)器(Wallac)分析熒光素酶活性?？墒褂肎raphPadPrismTM2.0a(GraphPad Software Inc.)分析數(shù)據(jù)。
d.胞內(nèi)IP3積累分析(Gq相關(guān)受體)第1天時(shí)，可將包含所關(guān)注的受體(內(nèi)源或非內(nèi)源)的細(xì)胞涂于24孔板上，通常為每孔1×105個(gè)細(xì)胞(但可以使這一數(shù)量?jī)?yōu)化)。第2天時(shí)，通過(guò)首先使每孔50μl無(wú)血清DMEM中的25μg DNA與每孔50μl無(wú)血清DMEM中的2μl Lipofectamine混合來(lái)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。小心地混合溶液，且在室溫下培育15-30分鐘。用0.5 mlPBS洗滌細(xì)胞，并使400μl無(wú)血清培養(yǎng)基與轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基混合，且將其加入細(xì)胞中。隨后在37℃/CO2下培育細(xì)胞3-4小時(shí)，且隨后移除轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基并以每孔1ml常規(guī)生長(zhǎng)培養(yǎng)基替換。第3天時(shí)，以3H-肌醇標(biāo)記細(xì)胞。簡(jiǎn)言之，移除培養(yǎng)基，并用0.5ml PBS洗滌細(xì)胞。隨后，每孔加入0.5ml無(wú)肌醇/無(wú)血清培養(yǎng)基(GIBCO BRL)和每孔0.25μCi3H-肌醇，并且在37℃/5％CO2下培育細(xì)胞16-18小時(shí)整夜。第4天時(shí)，如果使用含有血清素受體的對(duì)照構(gòu)筑體，那么用0.5ml PBS洗滌細(xì)胞，并加入0.45ml含有無(wú)肌醇/無(wú)血清培養(yǎng)基、10μM帕吉林(pargyline)、10mM氯化鋰的分析培養(yǎng)基，或0.4ml分析培養(yǎng)基和50μl10×酮舍林(ketanserin，ket)至10μM的最終濃度。隨后在37℃下培育細(xì)胞30分鐘。隨后用0.5mlPBS洗滌細(xì)胞，并且每孔加入200μl新制/冰冷的終止溶液(1M KOH；18mM硼酸鈉；3.8mM EDTA)。在冰上保持溶液5-10分鐘或直到細(xì)胞溶解，且接著以200μl新制/冰冷的中和溶液(7.5％HCl)中和。隨后將溶解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到1.5ml eppendorf管中，并且每管加入1ml氯仿/甲醇(1∶2)。渦旋溶液15秒，并將上層相施加至Biorad AG1-X8TM陰離子交換樹脂(100-200目)中。首先，用水以1∶1.25 W/V洗滌樹脂，并將0.9ml上層相裝載于柱上。用10ml5mM肌醇和10ml5mM硼酸鈉/60mM甲酸鈉洗滌柱。將三磷酸肌醇洗提到含有10ml閃爍混合液(scintillation cocktail)的閃爍瓶中，所述閃爍混合液含有2ml 0.1M甲酸/1M甲酸銨。通過(guò)用10ml 0.1M甲酸/3 M甲酸銨洗滌使柱再生，并用雙蒸水沖洗兩次，并且在4℃下儲(chǔ)存于水中。
實(shí)例7融合蛋白的制備a.GPCRGs融合構(gòu)筑體可如下實(shí)現(xiàn)對(duì)GPCR-G蛋白融合構(gòu)筑體的設(shè)計(jì)基因工程設(shè)計(jì)大鼠G蛋白Gsα(長(zhǎng)形式；Itoh，H等人，Proc.Natl.Acad.Sci.833776(1986))的5′和3′端以于其上包括HindIII序列。在確定正確序列(包括側(cè)接HindIII序列)后，通過(guò)使用所述載體的HindIII限制性位點(diǎn)進(jìn)行亞克隆而使完整序列穿梭于pcDNA3.1(-)(Invitrogen，目錄號(hào)V795-20)中。在亞克隆到pcDNA3.1(-)中之后，確定Gsα序列的正確定向。隨后驗(yàn)證在HindIII序列處含有大鼠Gsα基因的經(jīng)修飾pcDNA3.1(-)，所述載體現(xiàn)可作為“通用”Gsα蛋白載體使用。pcDNA3.1(-)載體在HindIII位點(diǎn)上游含有多種眾所周知的限制性位點(diǎn)，因此有益地提供于Gs蛋白的上游插入所關(guān)注的受體的編碼序列的能力。可利用這種相同方法產(chǎn)生其它“通用”G蛋白載體，當(dāng)然，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它市面有售或?qū)Ｙu載體也可加以利用-重要標(biāo)準(zhǔn)在于GPCR序列是在G蛋白上游且與G蛋白的GPCR序列同框。
b.Gq(6個(gè)氨基酸缺失)/Gi融合構(gòu)筑體可如下實(shí)現(xiàn)對(duì)Gq(del)/Gi融合構(gòu)筑體的設(shè)計(jì)缺失Gαq亞單元的N末端六(6)個(gè)氨基酸(氨基酸2至7，具有序列TLESIM(SEQ ID NO7))且用Gαi蛋白中具有序列DCGLF(SEQ ID NO9)的相應(yīng)氨基酸置換具有序列EYNLV(SEQ ID NO8)的C末端五(5)個(gè)氨基酸。使用下述引物和作為模板的質(zhì)粒63313，可通過(guò)PCR獲得這一融合構(gòu)筑體5′-gatcAAGCTTCCATGGCGTGCTGCCTGAGCGAGGAG-3′(SEQ ID NO10)和5′gatcGGATCCTTAGAACAGGCCGCAGTCCTTCAGGTTCAGCTGCAGGATGGTG-3′(SEQ ID NO11)，所述質(zhì)粒63313含有具有血球凝集素標(biāo)簽的小鼠Gαq野生型型式。包括小寫形式的核苷酸作為間隔部分。
可利用TaqPlus Precision DNA聚合酶(Stratagene)通過(guò)下述循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增，其中步驟2至4重復(fù)35次95℃下2分鐘；95℃下20秒；56℃下20秒；72℃下2分鐘；和72℃下7分鐘?？蓪CR產(chǎn)物克隆到pCRII-TOPO載體(Invitrogen)中，并使用ABI BigDye Terminator試劑盒(P.E.Biosystems)測(cè)序。可通過(guò)兩步克隆方法使含有融合構(gòu)筑體序列的來(lái)自TOPO克隆的插入物穿梭于表達(dá)載體pcDNA3.1(+)中的HindIII/BamHI位點(diǎn)處。另外參看2002年9月6日作為WO02068600公開的PCT申請(qǐng)案第PCT/US02/05625號(hào)，其公開內(nèi)容以全文引用的方式并入本文中。
實(shí)例8[35S]GTPγS分析A.膜制備在一些實(shí)施例中，包含用于鑒別候選化合物(例如作為激動(dòng)劑、反向激動(dòng)劑或拮抗劑)的所關(guān)注的目標(biāo)GPCR的膜制備如下a.材料“膜刮擦緩沖液(Membrane Scrape Buffer)”包含20mM HEPES和10mM EDTA(pH 7.4)；“膜洗滌緩沖液(Membrane Wash Buffer)”包含20mM HEPES和0.1mMEDTA(pH 7.4)；“結(jié)合緩沖液”包含20mM HEPES、100mM NaCl和10mM MgCl2(pH7.4)。
b.程序在整個(gè)程序中始終將所有材料保持于冰上。首先，自長(zhǎng)滿的單層細(xì)胞中抽吸培養(yǎng)基，隨后用10ml冷PBS沖洗，接著進(jìn)行抽吸。此后，加入5ml膜刮擦緩沖液以刮擦細(xì)胞；隨后將細(xì)胞提取物轉(zhuǎn)移到50ml離心管中(4℃下以20,000rpm離心17分鐘)。此后，抽吸出上清液，并將離心塊再懸浮于30ml膜洗滌緩沖液中，隨后在4℃下以20,000rpm離心17分鐘。接著抽吸出上清液，并將離心塊再懸浮于結(jié)合緩沖液中。隨后使用BrinkmanPolytronTM勻漿器進(jìn)行均質(zhì)化(15-20秒沖撞，直到所有材料都呈懸浮液形式)。其在本文中被稱為“膜蛋白”。
Bradford蛋白分析均質(zhì)化后，使用Bradford蛋白分析測(cè)定膜蛋白濃度(可將蛋白稀釋到約1.5mg/ml，等分并冷凍(-80℃)以供以后使用；當(dāng)冷凍時(shí)，所使用的方案如下分析當(dāng)天，在室溫下解凍已冷凍的膜蛋白，隨后渦旋，然后用Polytron以12×1,000rpm均質(zhì)化約5-10秒；應(yīng)注意，為進(jìn)行多次制備，應(yīng)在不同制備的均質(zhì)化之間徹底清潔勻漿器)。
a.材料遵循制造商的說(shuō)明書(Biorad，目錄號(hào)500-0006)，利用結(jié)合緩沖液(根據(jù)上文)、Bradford染料試劑、Bradford蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。
b.程序制備雙重復(fù)管，一只管包括膜且另一只作為對(duì)照“空白”。每一管都含有800μl結(jié)合緩沖液。此后，將10μl Bradford蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(1mg/ml)加入每一管中，且隨后將10μl膜蛋白僅加至一個(gè)管中(非空白管)。此后，將200μl Bradford染料試劑加入每一管中，隨后各自渦旋。五(5)分鐘后，將管再渦旋，且將其中的物質(zhì)轉(zhuǎn)移到比色皿中。使用CECIL 3041分光光度計(jì)于595波長(zhǎng)下讀取比色皿。
鑒別分析a.材料GDP緩沖液是由37.5ml結(jié)合緩沖液和2mg GDP(Sigma，目錄號(hào)G-7127)組成，隨后在結(jié)合緩沖液中進(jìn)行一系列稀釋以獲得0.2μM GDP(每一孔中GDP的最終濃度都為0.1μM GDP)；包含候選化合物的每一孔中具有200μl最終體積，其是由100μl GDP緩沖液(最終濃度0.1μM GDP)、50μl結(jié)合緩沖液中的膜蛋白和50μl結(jié)合緩沖液中的[35S]GTPγS(0.6 nM)(每10ml結(jié)合緩沖液2.5μl[35S]GTPγS)組成。
b.程序可使用96孔板格式篩檢候選化合物(其可在-80℃下冷凍)。短暫地使膜蛋白(或具有排除目標(biāo)GPCR的表達(dá)載體的膜，其作為對(duì)照物)均質(zhì)化直到呈懸浮液形式。使用上文所述的Bradford蛋白分析測(cè)定蛋白濃度。于結(jié)合緩沖液(最終分析濃度為每孔12.5μg)中將膜蛋白(和對(duì)照物)稀釋到0.25mg/ml。此后，將100μlGDP緩沖液加入WallacScintistripTM(Wallac)的每一孔中。使用5μl針具將5μl候選化合物轉(zhuǎn)移到所述孔中(意即，200μl總分析體積中的5μl為1∶40的比率，使得候選化合物的最終篩檢濃度為10μM)。同樣，為避免污染，在每次轉(zhuǎn)移步驟后，應(yīng)在包含水(1×)、乙醇(1×)和水(2×)的三個(gè)貯液器中沖洗針具，每次沖洗后都應(yīng)將過(guò)量的液體從針具中搖出，并用紙和無(wú)塵紙(kimwipe)干燥。此后，將50μl膜蛋白加入每一孔中(也利用包含膜但無(wú)目標(biāo)GPCR的對(duì)照孔)，并在室溫下預(yù)培育5-10分鐘。此后，將50μl結(jié)合緩沖液中的[35S]GTPγS(0.6nM)加入每一孔中，隨后在室溫下于振蕩器上培育60分鐘(培養(yǎng)板覆蓋有箔)。隨后，通過(guò)在22℃下以4000RPM旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)板15分鐘來(lái)終止分析。用8通道歧管抽吸培養(yǎng)板，并用培養(yǎng)板蓋密封。于Wallac1450上使用設(shè)置“Prot.#37”對(duì)培養(yǎng)板進(jìn)行讀數(shù)(根據(jù)制造商的說(shuō)明書)。
實(shí)例9環(huán)AMP分析可通過(guò)利用基于環(huán)化酶的分析來(lái)實(shí)現(xiàn)鑒別候選化合物(例如作為激動(dòng)劑、反向激動(dòng)劑或拮抗劑)的另一分析方法。除直接鑒別外，還可以利用本分析方法作為獨(dú)立方法以證實(shí)如上述實(shí)例所述的[35S]GTPγS方法的結(jié)果。
根據(jù)以下方案，可將經(jīng)修飾的Flash PlateTM腺苷?；h(huán)化酶試劑盒(New EnglandNuclear；目錄號(hào)SMP004A)用于直接鑒別作為所關(guān)注受體的反向激動(dòng)劑和拮抗劑的候選化合物。
轉(zhuǎn)染后大約3天時(shí)采集經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。通過(guò)于含有20mM HEPES(pH7.4)和10mMMgCl2的緩沖液中均質(zhì)化懸浮細(xì)胞來(lái)制備膜。使用Brinkman PolytronTM于冰上進(jìn)行均質(zhì)化歷時(shí)大約10秒。在4℃下以49,000×g離心所得勻漿15分鐘。隨后將所得離心塊再懸浮于含有20mM HEPES(pH7.4)和0.1mM EDTA的緩沖液中，均質(zhì)化10秒，隨后在4℃下以49,000×g離心15分鐘。然后將所得離心塊儲(chǔ)存于-80℃下待用。在直接鑒別篩檢當(dāng)天，于室溫下緩慢解凍膜小球，將其再懸浮于含有20mM HEPES(pH7.4)和10mM MgCl2的緩沖液中以得到0.60mg/ml的最終蛋白濃度(將再懸浮的膜放于冰上待用)。
根據(jù)制造商的說(shuō)明書，制備cAMP標(biāo)準(zhǔn)品和檢測(cè)緩沖液(包含2μCi示蹤劑[125I]cAMP(100μl)的11ml檢測(cè)緩沖液)并加以保存。新鮮制備分析緩沖液以供篩檢，且其含有20mM HEPES(pH 7.4)、10 mM MgCl2、20mM磷酸肌酸(phospocreatine)(Sigma)、0.1單位/毫升肌酸磷酸激酶(Sigma)、50μM GTP(Sigma)和0.2mM ATP(Sigma)；隨后將分析緩沖液儲(chǔ)存于冰上待用。
將候選化合物連同40μl膜蛋白(每孔30μg)和50μl分析緩沖液加入(例如)96孔板的孔中(每孔3μl；12μM的最終分析濃度)。隨后，在輕柔振蕩下，于室溫下培育所述混合物30分鐘。
培育后，將100μl檢測(cè)緩沖液加入每一孔中，隨后培育2-24小時(shí)。于WallacMicroBetaTM讀板器中使用“Prot.#31”對(duì)培養(yǎng)板進(jìn)行計(jì)數(shù)(根據(jù)制造商的說(shuō)明書)。
實(shí)例10測(cè)量胞內(nèi)鈣濃度的熒光成像讀板器(FLIPR)分析將來(lái)自各別克隆系的經(jīng)目標(biāo)受體(實(shí)驗(yàn)性)和pCMV(陰性對(duì)照)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以每孔5.5×104個(gè)細(xì)胞接種至經(jīng)聚-D-賴氨酸預(yù)處理的具有完全培養(yǎng)基(具有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸鈉的DMEM)的96孔板(Becton-Dickinson，#356640)中。由于GPR43與Gαq(一種混雜G蛋白，諸如Gα15、Gα16或嵌合Gq/Giα)偶合，故無(wú)需亞單元來(lái)引起可檢測(cè)的鈣流。為制備Fluo4-AM(Molecular Probe，#F14202)培育緩沖液儲(chǔ)備液，將1mg Fluo4-AM溶解于467μl DMSO和467μl泊洛尼克酸(Pluoronicacid)(Molecular Probe，#P3000)中以得到1mM儲(chǔ)備液，其可在-20℃下儲(chǔ)存一個(gè)月。Fluo4-AM為熒光鈣指示劑染料。
于洗滌緩沖液(1×HBSS/2.5mM丙磺舒(Probenicid)/20mM HEPES(pH7.4))中制備候選化合物。
分析時(shí)，將培養(yǎng)基從孔中移除，并以100μl的4μM Fluo4-AM/2.5mM丙磺舒(Sigma，#P8761)/20mM HEPES/完全培養(yǎng)基(pH 7.4)裝載細(xì)胞。在37℃/5％CO2下進(jìn)行培育60分鐘。
培育1小時(shí)后，移除Fluo4-AM培育緩沖液，并用100μl洗滌緩沖液洗滌細(xì)胞2次。于每一孔中留下100μl洗滌緩沖液。將培養(yǎng)板放回37℃/5％CO2下恒溫箱中培育60分鐘。
對(duì)FLIPR(熒光成像讀板器；Molecular Device)設(shè)定程序以于第30秒時(shí)加入50μl候選化合物，并且記錄由候選化合物所引起的胞內(nèi)鈣濃度([Ca2+])瞬時(shí)改變，再歷時(shí)150秒。使用FLIPR軟件，使用總熒光改變數(shù)來(lái)確定激動(dòng)劑活性。儀器軟件使熒光讀數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化以得到零點(diǎn)處的等效初始讀數(shù)。
盡管上文提供使用經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行的有關(guān)激動(dòng)劑活性的FLIPR分析，但所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠容易地對(duì)所述分析進(jìn)行修改以便表征拮抗劑活性。所述所屬領(lǐng)域技術(shù)人員也將容易地了解，可替代性地使用經(jīng)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
實(shí)例11MAP激酶分析可對(duì)MAP激酶(絲裂原活化激酶)進(jìn)行監(jiān)測(cè)以評(píng)估受體活化。可由若干種方法對(duì)MAP激酶進(jìn)行檢測(cè)。一種方法是基于對(duì)磷酸化狀態(tài)的評(píng)估，即未磷酸化狀態(tài)(非活性)或經(jīng)磷酸化狀態(tài)(活性)。經(jīng)磷酸化的蛋白在SDS-PAGE中具有較慢遷移率，且因此可以使用Western印跡法將其與未經(jīng)刺激的蛋白相比較?；蛘?，可使用對(duì)經(jīng)磷酸化的蛋白具特異性的抗體(New England Biolabs)，其可用于檢測(cè)經(jīng)磷酸化激酶的增加。在任一方法中，細(xì)胞都經(jīng)候選化合物刺激且隨后經(jīng)Laemmli緩沖液提取。將可溶部分施加于SDS-PAGE凝膠上，并且以電泳法將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素或Immobilin中。以標(biāo)準(zhǔn)Western印跡技術(shù)檢測(cè)免疫反應(yīng)帶。將可見(jiàn)或化學(xué)發(fā)光信號(hào)記錄于薄膜上，并且可以通過(guò)光密度分析法進(jìn)行量化。
另一種方法是基于經(jīng)由磷酸化分析評(píng)估MAP激酶活性。用候選化合物刺激細(xì)胞，并且制備可溶提取物。在30℃下將提取物與γ-32P-ATP、ATP再生系統(tǒng)和MAP激酶的特異性底物(諸如由胰島素調(diào)控的經(jīng)磷酸化的熱穩(wěn)定和酸穩(wěn)定蛋白或PHAS-I)一起培育10分鐘。通過(guò)加入H3PO4終止反應(yīng)，并且將樣本轉(zhuǎn)移到冰上。將等分試樣點(diǎn)漬于保留磷酸化蛋白的Whatman P81色譜紙上。洗滌色譜紙并用液體閃爍計(jì)數(shù)器對(duì)32P進(jìn)行計(jì)數(shù)?；蛘?，將細(xì)胞提取物與γ-32P-ATP、ATP再生系統(tǒng)和通過(guò)鏈親和素(streptavidin)結(jié)合至過(guò)濾器載體的生物素標(biāo)記的髓鞘堿性蛋白一起培育。髓鞘堿性蛋白為活性MAP激酶的底物。在30℃下進(jìn)行磷酸化反應(yīng)10分鐘。隨后，可經(jīng)由過(guò)濾器抽吸提取物，所述過(guò)濾器保留經(jīng)磷酸化的髓鞘堿性蛋白。洗滌過(guò)濾器，并通過(guò)液體閃爍計(jì)數(shù)對(duì)32P進(jìn)行計(jì)數(shù)。
實(shí)例12受體結(jié)合分析除本文所述的方法外，另一種用于評(píng)估候選化合物的方式是通過(guò)測(cè)定與GPR43受體的結(jié)合親和性。這類分析通常需要GPR43受體的經(jīng)放射性標(biāo)記的配體。除使用GPR43受體的已知配體和其放射性標(biāo)記外，還可以用放射性同位素標(biāo)記GPR43激動(dòng)劑化合物，并且將其用于評(píng)估候選化合物與GPR43受體的親和性的分析中。
可在篩檢分析中使用經(jīng)放射性標(biāo)記的GPR43化合物(諸如GPR43激動(dòng)劑)以鑒別/評(píng)估化合物。一般說(shuō)來(lái)，可以評(píng)估新近合成或鑒別的化合物(意即，候選化合物)降低經(jīng)放射性標(biāo)記的GPR43激動(dòng)劑與GPR43受體結(jié)合的能力。因此，與經(jīng)放射性標(biāo)記的GPR43激動(dòng)劑競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合GPR43受體的能力與候選化合物與GPR43受體的結(jié)合親和性直接相關(guān)。
有關(guān)測(cè)定GPR43受體結(jié)合的分析方案A.GPR43受體制備舉例而言，可用如本文所述的GPR43瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞(人腎細(xì)胞，ATCC)。舉例而言，可用10μg人類GPR43受體和60μl Lipofectamine(每15cm盤)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，并且隨著培養(yǎng)基的改變使其在所述盤中生長(zhǎng)24小時(shí)(75％融合)。用每盤10ml Hepes-EDTA緩沖液(20mM Hepes+10mM EDTA(pH7.4))移除細(xì)胞。隨后在Beckman Coulter離心機(jī)中以17,000rpm(JA-25.50型轉(zhuǎn)子)離心細(xì)胞20分鐘。隨后將離心塊再懸浮于20mM Hepes+1mM EDTA(pH7.4)中，并用50ml Dounce勻漿器進(jìn)行均質(zhì)化且再次離心。移除上清液后，將離心塊儲(chǔ)存于-80℃下直到用于結(jié)合分析。當(dāng)用于分析時(shí)，于冰上解凍膜20分鐘，且隨后加入10ml培育緩沖液(20mM Hepes，1mM MgCl2，100mM NaCl，pH7.4)。然后渦旋膜以再懸浮粗制膜離心塊，并用BrinkmannPT-3100 Polytron勻漿器以設(shè)置6進(jìn)行均質(zhì)化15秒。使用BRL Bradford蛋白分析測(cè)定膜蛋白的濃度。
B.結(jié)合分析對(duì)于總體結(jié)合而言，將50μl總體積經(jīng)適當(dāng)稀釋的膜(在含有50 mM Tris HCl(pH7.4)、10 mM MgCl2和1 mM EDTA的分析緩沖液中進(jìn)行稀釋；5-50μg蛋白)加入96孔聚丙烯微量滴定盤中，隨后加入100μl分析緩沖液和50μl經(jīng)放射性標(biāo)記的GPR43激動(dòng)劑。對(duì)于非特異性結(jié)合而言，加入50μl而非100μl分析緩沖液，并且再加入50μl10μM冷GPR43，隨后加入50μl經(jīng)放射性標(biāo)記的GPR43激動(dòng)劑。然后在室溫下培育培養(yǎng)板60-120分鐘。通過(guò)使分析板濾過(guò)具有Brandell 96孔板收集器的Microplate DevicesGF/C Unifilter過(guò)濾板來(lái)終止反應(yīng)，隨后用含有0.9％NaCl的冷50mM Tris HCl(pH 7.4)洗滌。然后密封過(guò)濾板底部，將50μl Optiphase Supermix加入每一孔中，密封板頂部，且于Trilux MicroBeta閃爍計(jì)數(shù)器中對(duì)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。對(duì)于化合物競(jìng)爭(zhēng)研究而言，將100μl經(jīng)適當(dāng)稀釋的候選化合物加入適當(dāng)孔中，而非加入100μl分析緩沖液，隨后加入50μl經(jīng)放射性標(biāo)記的GPR43激動(dòng)劑。
C.計(jì)算起初分析1μM和0.1μM的候選化合物，且隨后分析經(jīng)選擇使得中間劑量引起對(duì)經(jīng)放射性標(biāo)記的GPR43激動(dòng)劑結(jié)合約50％抑制(意即，IC50)的濃度范圍內(nèi)的候選化合物。在不存在候選化合物的情況下特異性結(jié)合(Bo)為總結(jié)合(BT)減去非特異性結(jié)合(NSB)的差，且類似地，特異性結(jié)合(在候選化合物存在下)(B)為移位結(jié)合(displacementbinding)(BD)減去非特異性結(jié)合(NSB)的差。由抑制反應(yīng)曲線(即B/Bo％比候選化合物濃度的logit-log圖)確定IC50。
Ki是通過(guò)Cheng和Prustoff轉(zhuǎn)換來(lái)計(jì)算Ki＝IC50/(l+[L]/KD)，其中[L]為分析中所使用的經(jīng)放射性標(biāo)記的GPR43激動(dòng)劑的濃度，且KD為在相同結(jié)合條件下獨(dú)立測(cè)定的經(jīng)放射性標(biāo)記的GPR43激動(dòng)劑的解離常數(shù)。
實(shí)例13嚙齒動(dòng)物糖尿病模型已研發(fā)與肥胖癥和胰島素抵抗相關(guān)的II型糖尿病嚙齒動(dòng)物模型。已研發(fā)諸如小鼠db/db和ob/ob[參看Diabetes(1982)311-6]和Zucker大鼠fa/fa的遺傳模型以了解疾病的病理生理學(xué)并測(cè)試候選治療性化合物[Diabetes(1983)32830-838；Annu Rep Sankyo ResLab(1994)461-57]。Jackson Laboratory所研發(fā)的純合動(dòng)物C57 BL/KsJ-db/db小鼠的特征在于肥胖、高血糖、胰島素過(guò)多和胰島素抵抗[J Clin Invest(1990)85962-967]，而雜合動(dòng)物的特征在于體瘦和血糖量正常。在db/db模型中，小鼠隨年齡增長(zhǎng)逐漸發(fā)展成胰島素貧乏癥(insulinopenia)，即一種當(dāng)不足以控制糖含量時(shí)通常于晚期人類II型糖尿病中觀察到的特征。由于這一模型類似于人類II型糖尿病的模型，故對(duì)本發(fā)明的代謝穩(wěn)定化合物的活性(包括但不限于降低血漿葡萄糖和甘油三酯)進(jìn)行測(cè)試。Zucker(fa/fa)大鼠的特征在于嚴(yán)重肥胖、胰島素過(guò)多和胰島素抵抗{Coleman，Diabetes(1982)311；EShafrir in Diabetes Mellitus，H Rifkin和D Porte，Jr編輯[Elsevier Science Publishing Co，New York，第4版，(1990)，第299-340頁(yè)]}，且fa/fa突變可為鼠類db突變的大鼠等效物[Friedman等人，Cell(1992)69217-220；Truett等人，Proc Natl Acad Sci USA(1991)887806]。Tubby(tub/tub)小鼠的特征在于肥胖、中度胰島素抵抗和胰島素過(guò)多，而無(wú)顯著的高血糖[Coleman等人，Heredity(1990)81424]。
本發(fā)明涵蓋使用本發(fā)明的化合物降低上述嚙齒動(dòng)物糖尿病模型、患有II型糖尿病或前文所述的其它優(yōu)選代謝相關(guān)病癥或脂質(zhì)代謝病癥的人類或基于其它動(dòng)物的模型中任一者或全部的胰島素抵抗和高血糖?？蓽y(cè)試血漿葡萄糖和胰島素含量以及包括(但不限于)血漿游離脂肪酸和甘油三酯的其它因素。
有關(guān)本發(fā)明化合物的抗高血糖活性的體內(nèi)分析在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件下，于22℃和50％相對(duì)濕度下，圈養(yǎng)遺傳性改變的肥胖糖尿病小鼠(db/db)(雄性，7-9周大)(每籠7-9只小鼠)，并讓其隨意進(jìn)食Purina嚙齒動(dòng)物食品和水。治療前，從每一動(dòng)物的尾靜脈收集血液，并使用One Touch Basic葡萄糖監(jiān)測(cè)系統(tǒng)(Lifescan)測(cè)定血糖濃度。使用血漿葡萄糖含量介于250至500mg/dl之間的小鼠。每一治療組都是由經(jīng)分配使得每一組在研究開始時(shí)平均葡萄糖含量都相等的若干只小鼠組成，通過(guò)使用異氟烷麻醉(isoflurane anesthesia)插入的微滲透壓泵對(duì)db/db小鼠給藥以對(duì)所述小鼠皮下提供本發(fā)明的化合物、生理食鹽水或不相關(guān)的化合物。此后，以一定間隔自尾靜脈采血樣，并分析血糖濃度。使用Student t檢定評(píng)估群組之間的顯著差異(將本發(fā)明的化合物與經(jīng)生理食鹽水治療者相比較)。
上文是以說(shuō)明而非限制的方式提供。其它說(shuō)明性II型糖尿病嚙齒動(dòng)物模型已加以描述[Moller DE，Nature(2001)414821-7和其中的參考文獻(xiàn)；和Reed MJ等人，Diabetes，Obesity and Metabolism(1999)175-86和其中的參考文獻(xiàn)；其各自的公開內(nèi)容都是以全文引用的方式并入本文]。
所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，在不偏離本發(fā)明精神的情況下可對(duì)本文所述的說(shuō)明性實(shí)例進(jìn)行多種修改、添加、取代和變化，且因此認(rèn)為所述修改、添加、取代和變化是處于本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。上文所參考的所有文獻(xiàn)(包括(但不限于)印刷出版物和臨時(shí)專利申請(qǐng)案和正式專利申請(qǐng)案)都是以全文引用的方式并入本文中。
序列表<110>艾尼納制藥公司<120>治療代謝相關(guān)病癥的GPR43和其調(diào)節(jié)劑<130>82.wol<160>11<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>993<212>DNA<213>智人<400>1atgctgccgg actggaagag ctccttgatc ctcatggctt acatcatcat cttcctcact 60ggcctccctg ccaacctcct ggccctgcgg gcctttgtgg ggcggatccg ccagccccag120cctgcacctg tgcacatcct cctgctgagc ctgacgctgg ccgacctcct cctgctgctg180ctgctgccct tcaagatcat cgaggctgcg tcgaacttcc gctggtacct gcccaaggtc240gtctgcgccc tcacgagttt tggcttctac agcagcatct actgcagcac gtggctcctg300gcgggcatca gcatcgagcg ctacctggga gtggctttcc ccgtgcagta caagctctcc360cgccggcctc tgtatggagt gattgcagct ctggtggcct gggttatgtc ctttggtcac420tgcaccatcg tgatcatcgt tcaatacttg aacacgactg agcaggtcag aagtggcaat480gaaattacct gctacgagaa cttcaccgat aaccagttgg acgtggtgct gcccgtgcgg540ctggagctgt gcctggtgct cttcttcatc cccatggcag tcaccatctt ctgctactgg600cgttttgtgt ggatcatgct ctcccagccc cttgtggggg cccagaggcg gcgccgagcc660gtggggctgg ctgtggtgac gctgctcaat ttcctggtgt gcttcggacc ttacaacgtg720tcccacctgg tggggtatca ccagagaaaa agcccctggt ggcggtcaat agccgtggtg780ttcagttcac tcaacgccag tctggacccc ctgctcttct atttctcttc ttcagtggtg840cgcagggcat ttgggagagg gctgcaggtg ctgcggaatc agggctcctc cctgttggga900cgcagaggca aagacacagc agaggggaca aatgaggaca ggggtgtggg tcaaggagaa960gggatgccaa gttcggactt cactacagag tag 993<210>2<211>330<212>PRT<213>智人<400>2
Met Leu Pro Asp Trp Lys Ser Ser Leu Ile Leu Met Ala Tyr Ile Ile1 5 10 15Ile Phe Leu Thr Gly Leu Pro Ala Asn Leu Leu Ala Leu Arg Ala Phe20 25 30Val Gly Arg Ile Arg Gln Pro Gln Pro Ala Pro Val His Ile Leu Leu35 40 45Leu Ser Leu Thr Leu Ala Asp Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Phe50 55 60Lys Ile Ile Glu Ala Ala Ser Asn Phe Arg Trp Tyr Leu Pro Lys Val65 70 75 80Val Cys Ala Leu Thr Ser Phe Gly Phe Tyr Ser Ser Ile Tyr Cys Ser85 90 95Thr Trp Leu Leu Ala Gly Ile Ser Ile Glu Arg Tyr Leu Gly Val Ala100 105 110Phe Pro Val Gln Tyr Lys Leu Ser Arg Arg Pro Leu Tyr Gly Val Ile115 120 125Ala Ala Leu Val Ala Trp Val Met Ser Phe Gly His Cys Thr Ile Val130 135 140Ile Ile Val Gln Tyr Leu Asn Thr Thr Glu Gln Val Arg Ser Gly Asn145 150 155 160Glu Ile Thr Cys Tyr Glu Asn Phe Thr Asp Asn Gln Leu Asp Val Val165 170 175Leu Pro Val Arg Leu Glu Leu Cys Leu Val Leu Phe Phe Ile Pro Met180 185 190Ala Val Thr Ile Phe Cys Tyr Trp Arg Phe Val Trp Ile Met Leu Ser195 200 205Gln Pro Leu Val Gly Ala Gln Arg Arg Arg Arg Ala Val Gly Leu Ala210 215 220Val Val Thr Leu Leu Asn Phe Leu Val Cys Phe Gly Pro Tyr Asn Val225 230 235 240Ser His Leu Val Gly Tyr His Gln Arg Lys Ser Pro Trp Trp Arg Ser245 250 255
Ile Ala Val Val Phe Ser Ser Leu Asn Ala Ser Leu Asp Pro Leu Leu260 265 270Phe Tyr Phe Ser Ser Ser Val Val Arg Arg Ala Phe Gly Arg Gly Leu275 280 285Gln Val Leu Arg Asn Gln Gly Ser Ser Leu Leu Gly Arg Arg Gly Lys290 295 300Asp Thr Ala Glu Gly Thr Asn Glu Asp Arg Gly Val Gly Gln Gly Glu305 310 315 320Gly Met Pro Ser Ser Asp Phe Thr Thr Glu325 330<210>3<211>24<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物<400>3ctctggtggc ctgggttatg tcct24<210>4<211>24<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物<400>4cctgcgcacc actgaagaag agaa24<210>5<211>23<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物<400>5gttatcccgc cggccactgt atg 23<210>6<211>22<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物<400>6gcgcaccacg gaggaggaga ag 22<210>7<211>6<212>PRT<213>人工<220>
<223>肽<400>7Thr Leu Glu Ser Ile Met1 5<210>8<211>5<212>PRT<213>人工<220>
<223>肽<400>8Glu Tyr Asn Leu Val1 5<210>9<211>5<212>PRT<213>人工<220>
<223>肽<400>9Asp Cys Gly Leu Phe1 5<210>10<211>36<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物<400>10gatcaagctt ccatggcgtg ctgcctgagc gaggag36<210>11<211>53<212>DNA
<213>人工<220>
<223>引物<400>11gatcggatcc ttagaacagg ccgcagtcct tcaggttcag ctgcaggatg gtg5權(quán)利要求
1.一種用于鑒別代謝穩(wěn)定化合物的方法，其包含a)使候選化合物與GPR43接觸，和b)測(cè)定GPR43功能性是否受到調(diào)節(jié)，其中對(duì)GPR43功能性的調(diào)節(jié)表明所述候選化合物是代謝穩(wěn)定化合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述GPR43為人類GPR43。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述測(cè)定包含第二信使分析。
4.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法所鑒別的代謝穩(wěn)定化合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的化合物，其中所述代謝穩(wěn)定化合物為GPR43激動(dòng)劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的化合物，其中所述代謝穩(wěn)定化合物為GPR43反向激動(dòng)劑或拮抗劑。
7.一種用于制備組合物的方法，其包含鑒別代謝穩(wěn)定化合物，隨后使所述化合物與載劑混合，其中所述化合物是通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法鑒別。
8.一種醫(yī)藥組合物，其包含權(quán)利要求4所述的化合物、基本上由權(quán)利要求4所述的化合物組成或由權(quán)利要求4所述的化合物組成。
9.一種在有需要的個(gè)體治療或預(yù)防代謝相關(guān)病癥的方法，其包含向所述個(gè)體投與有效量的根據(jù)權(quán)利要求8所述的化合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述代謝相關(guān)病癥為低血糖癥、衰老、胰島素抵抗、葡萄糖耐受性異常、糖尿病、高血糖癥、高胰島素血癥、高脂血癥、高甘油三酯血癥、高膽固醇血癥、血脂異常、肥胖癥、X綜合癥、動(dòng)脈粥樣硬化、心臟病、中風(fēng)、高血壓或末梢血管疾病。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其另外包含向所述個(gè)體投與有效量的用于治療糖尿病、血脂病癥或肥胖癥的藥劑與有效量的根據(jù)權(quán)利要求8所述的化合物的組合。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述個(gè)體為哺乳動(dòng)物。
13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述個(gè)體為人類。
14.一種用于制造藥物的方法，所述藥物包含用作代謝穩(wěn)定化合物的根據(jù)權(quán)利要求8所述的化合物。
15.一種用于制造藥物的方法，所述藥物包含用于治療代謝相關(guān)病癥的根據(jù)權(quán)利要求8所述的化合物。
16.一種用于鑒別代謝穩(wěn)定化合物的方法，其包含a)使候選化合物與GPR43接觸，和b)測(cè)定GPR43功能性是否降低，其中GPR43功能性的降低表明所述候選化合物是代謝穩(wěn)定化合物。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述GPR43為人類GPR43。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述測(cè)定包含第二信使分析。
19.一種根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法所鑒別的代謝穩(wěn)定化合物。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的化合物，其中所述代謝穩(wěn)定化合物為GPR43反向激動(dòng)劑。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的化合物，其中所述代謝穩(wěn)定化合物為GPR43拮抗劑。
22.一種用于制備組合物的方法，其包含鑒別代謝穩(wěn)定化合物，隨后使所述化合物與載劑混合，其中所述化合物是通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法鑒別。
23.一種醫(yī)藥組合物，其包含權(quán)利要求19所述的化合物、基本上由權(quán)利要求19所述的化合物組成或由權(quán)利要求19所述的化合物組成。
24.一種在有需要的個(gè)體治療或預(yù)防代謝相關(guān)病癥的方法，其包含向所述個(gè)體投與有效量的根據(jù)權(quán)利要求23所述的化合物。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述代謝相關(guān)病癥為胰島素抵抗、葡萄糖耐受性異常、糖尿病、高血糖癥、高胰島素血癥、高脂血癥、高甘油三酯血癥、高膽固醇血癥、血脂異常、肥胖癥、X綜合癥、動(dòng)脈粥樣硬化、心臟病、中風(fēng)、高血壓或末梢血管疾病。
26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述代謝相關(guān)病癥為胰島素抵抗、葡萄糖耐受性異?；蛱悄虿　?br> 27.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其另外包含向所述個(gè)體投與有效量的用于治療糖尿病、血脂病癥或肥胖癥的藥劑與有效量的根據(jù)權(quán)利要求23所述的化合物的組合。
28.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述個(gè)體為哺乳動(dòng)物。
29.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述個(gè)體為人類。
30.一種用于制造藥物的方法，所述藥物包含用作代謝穩(wěn)定化合物的根據(jù)權(quán)利要求23所述的化合物。
31.一種用于制造藥物的方法，所述藥物包含用于治療代謝相關(guān)病癥的根據(jù)權(quán)利要求23所述的化合物。
32.一種用于治療或預(yù)防代謝相關(guān)病癥的方法，其包含向有此需要的個(gè)體投與有效量的GPR43調(diào)節(jié)劑。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述代謝相關(guān)病癥為低血糖癥或衰老。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述調(diào)節(jié)劑為激動(dòng)劑。
35.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述代謝相關(guān)病癥為胰島素抵抗、葡萄糖耐受性異常、糖尿病、高血糖癥、高胰島素血癥、高脂血癥、高甘油三酯血癥、高膽固醇血癥、血脂異常、肥胖癥、X綜合癥、動(dòng)脈粥樣硬化、心臟病、中風(fēng)、高血壓或末梢血管疾病。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述調(diào)節(jié)劑為反向激動(dòng)劑或拮抗劑。
37.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其另外包含向所述個(gè)體投與有效量的用于治療糖尿病、血脂病癥或肥胖癥的藥劑與有效量的GPR43反向激動(dòng)劑或拮抗劑的組合。
38.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述代謝相關(guān)病癥為胰島素抵抗、葡萄糖耐受性異?；蛱悄虿?。
39.一種用于治療或預(yù)防可通過(guò)降低GPR43功能來(lái)治療或預(yù)防的病癥的方法，其包含向有此需要的個(gè)體投與有效量的GPR43反向激動(dòng)劑或拮抗劑。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述病癥為代謝相關(guān)病癥。
41.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述代謝相關(guān)病癥為胰島素抵抗、葡萄糖耐受性異常、糖尿病、高血糖癥、高胰島素血癥、高脂血癥、高甘油三酯血癥、高膽固醇血癥、血脂異常、肥胖癥、X綜合癥、動(dòng)脈粥樣硬化、心臟病、中風(fēng)、高血壓或末梢血管疾病。
42.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述代謝相關(guān)病癥為胰島素抵抗、葡萄糖耐受性異?；蛱悄虿?。
43.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述代謝相關(guān)病癥為II型糖尿病。
44.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其另外包含向所述個(gè)體投與有效量的用于治療糖尿病、血脂病癥或肥胖癥的藥劑與有效量的GPR43反向激動(dòng)劑或拮抗劑的組合。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鑒別代謝穩(wěn)定化合物的方法，其是通過(guò)a)使候選化合物與GPR43接觸，和b)測(cè)定GPR43功能性是否受到調(diào)節(jié)，其中對(duì)GPR43功能性的調(diào)節(jié)表明所述候選化合物是代謝穩(wěn)定化合物。此外，本發(fā)明涉及一種用于鑒別代謝穩(wěn)定化合物的方法，其包含a)使候選化合物與GPR43接觸，和b)測(cè)定GPR43功能性是否增加，其中GPR43功能性的增加表明所述候選化合物是代謝穩(wěn)定化合物。另外，本發(fā)明涉及一種用于鑒別代謝穩(wěn)定化合物的方法，其包含a)使候選化合物與GPR43接觸，和b)測(cè)定GPR43功能性是否降低，其中GPR43功能性的降低表明所述候選化合物是代謝穩(wěn)定化合物。
文檔編號(hào)G01N33/68GK101023357SQ200580031818
公開日2007年8月22日 申請(qǐng)日期2005年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月22日
發(fā)明者詹姆斯·N·倫納德, 亞龍·哈卡克 申請(qǐng)人:艾尼納制藥公司