本發(fā)明涉及一種源于桔綠木霉的青霉烯醇E1及其在胃癌方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

生物堿是一類由生物次級代謝產(chǎn)生的含氮有機(jī)化合物，自然界中的生物堿種類較多，大多來源于植物，因此又有植物堿之稱。生物堿對人和動物有重要的生理作用，包括平喘鎮(zhèn)咳、降血糖、降血脂、抗菌、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛等，其中以抗菌、抗腫瘤活性最為突出。天然結(jié)構(gòu)生物堿是創(chuàng)新藥物研究中發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物的重要來源，目前應(yīng)用于臨床的生物堿藥物已經(jīng)近百種。研究發(fā)現(xiàn)，一些海洋真菌能夠在次級代謝過程中產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、活性好的生物堿,具有很好的藥用和產(chǎn)業(yè)化前景。

本發(fā)明人研究得知，桔綠木霉（Trichoderma citrinoviride.）IBPT-4 (已于2013年1月25日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址: 武漢 武漢大學(xué)，保藏編號是：CCTCC NO：M 2013055) 的發(fā)酵產(chǎn)物的粗提取物有很好的腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性，遂對其活性成分進(jìn)行研究，該桔綠木霉（Trichoderma citrinoviride.）IBPT-4在專利號201310208563.5中已公開。研究發(fā)現(xiàn)所示生物堿類化合物針對胃癌具有抗腫瘤活性，目前尚未見該化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)及針對胃癌細(xì)胞增殖抑制活性的報(bào)道，因此市場上也尚未見有與此相關(guān)的藥物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種源于桔綠木霉的青霉烯醇E1及其在胃癌方面的應(yīng)用。

本發(fā)明首先涉及到一株桔綠木霉（Trichoderma citrinoviride.）IBPT-4，該菌株已于2013年1月25日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址: 武漢 武漢大學(xué)，保藏編號是：CCTCC NO：M 2013055。

所述菌株的用途在于，將桔綠木霉（Trichoderma citrinoviride.）IBPT-4進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，菌絲體和發(fā)酵液提取物經(jīng)分離得到具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性的化合物為青霉烯醇E1。

該化合物結(jié)構(gòu)式為：

。

其結(jié)構(gòu)特征是：含有一個五環(huán)酰胺的分子骨架、含有一個羰基連接一條十碳飽和脂肪長鏈、N上連接一個甲基、分子存在兩個羥基基團(tuán)。

本發(fā)明還保護(hù)了所述的化合物在制備針對胃癌細(xì)胞增殖抑制藥物中的用途，及該化合物在制備抗胃癌藥物中的用途。

本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)：研究所示該化合物是一個結(jié)構(gòu)新穎的生物堿，所述生物堿類化合物具有顯著的抗胃癌活性，目前尚未見該化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)及針對胃癌細(xì)胞增殖抑制活性的報(bào)道，因此市場上也尚未見有與此相關(guān)的藥物。

附圖說明

圖1為青霉烯醇E1主要的COSY和HMBC信號。

具體實(shí)施方式

在如下的實(shí)施例中所指的化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)：

。

實(shí)施例1該化合物的發(fā)酵生產(chǎn)及分離精制

1發(fā)酵生產(chǎn)

生產(chǎn)菌的發(fā)酵培養(yǎng)：按培養(yǎng)微生物的常規(guī)方法，取桔綠木霉（Trichoderma citrinoviride.）IBPT-4 (已于2013年1月25日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址: 武漢 武漢大學(xué)，保藏編號是：CCTCC NO：M 2013055) 適量，接種到PDA固體斜面培養(yǎng)基上在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天。

取斜面培養(yǎng)4天的桔綠木霉（Trichoderma citrinoviride.）IBPT-4適量，接種到裝有400mL培養(yǎng)液 [ 培養(yǎng)液組成(克/升)：甘露醇20.0，酵母膏3.0，麥芽糖20.0，味精10.0，葡萄糖10.0，KH₂PO₄ 0.5 ，MgSO₄ 0.3，NaCL 6.0 定容 ] 的1000mL錐形瓶中，28℃靜止培養(yǎng)30天后，獲得菌絲體和發(fā)酵液。

2 浸膏的獲得

用紗布將菌絲體和發(fā)酵液分離。將發(fā)酵液與乙酸乙酯1:2（v/v）萃取兩次，萃取液減壓蒸餾至干，得到發(fā)酵液的乙酸乙酯浸膏。菌絲體則以含70wt%-80wt%丙酮的水溶液超聲破碎3次，除去殘?jiān)鼘⑶逡汉喜⒑鬁p壓濃縮去除丙酮，用按體積比為1:2加入乙酸乙酯萃取兩次，減壓濃縮至干得菌絲體浸膏。將菌絲體和發(fā)酵液浸膏合并后得到提取物總浸膏。

3 化合物的分離精制

該浸膏通過100-200目硅膠拌樣后，以石油醚：二氯甲烷：甲醇為洗脫液用減壓硅膠色譜柱梯度洗脫。洗脫液經(jīng)過活性跟蹤，得到活性組分B (二氯甲烷-甲醇v/v 50:1洗脫物)，然后以石油醚：二氯甲烷：甲醇梯度組分為洗脫劑，進(jìn)一步通過加壓硅膠柱層析梯度洗脫，得到的活性亞組分B1(二氯甲烷-甲醇為20:1的洗脫物)以氯仿-甲醇(v/v1:2)為溶劑進(jìn)行Sephadex LH-20凝膠柱層析，最后通過半制備液相色譜(1010型ODS-A，10×250 mm，5μm)：分離流速為5 mL/min，流動相為85%乙腈含0.1% TFA，得到所示化合物（32.1 mg，t_R20.7min）。

化合物 淡黃色油狀物，高分辨質(zhì)譜HRESI-MS在m/z 324.2161處給出分子離子峰[M – H]^–，(Calcd for C₁₈H₃₀NO₄, 324.2175)，提示分子量為325，結(jié)合波譜信息推測分子式為C₁₈H₃₁NO₄。 ¹H和¹³C-NMR等NMR數(shù)據(jù)見表1。

表1化合物的¹H和¹³C-NMR數(shù)據(jù)(500 MHz，in CDCl₃)^a)

a) 本表信號歸屬基于DEPT、HMQC及HMBC圖譜解析結(jié)果。碳信號的種類利用DEPT方法確定。

實(shí)施例2 體外抗腫瘤活性的測試

1 實(shí)驗(yàn)樣品及實(shí)驗(yàn)方法

被測樣品溶液的配制 測試樣品為上述實(shí)施1中分離精制的化合物純品。精密稱取適量樣品，用甲醇配制成所需濃度的溶液，供測活性。

細(xì)胞系及細(xì)胞的繼代培養(yǎng)采用胃癌細(xì)胞系，胃癌細(xì)胞用含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37℃于通入5% 二氧化碳的培養(yǎng)箱中繼代培養(yǎng)。

細(xì)胞增殖抑制活性測試方法

四氮唑鹽（MTT）法 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)至每毫升2×10⁵個細(xì)胞，按每孔200微升接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37℃通入5% CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時。每孔加入2微升樣品液或空白溶液，培養(yǎng)24小時后，每孔加MTT液（MTT的每毫升5毫克生理鹽水溶液）10微升，繼續(xù)培養(yǎng)4小時,37℃、2000轉(zhuǎn)/分鐘離心8分鐘，吸去上清。每孔加入DMSO各100微升，在微量振蕩器上振蕩15分鐘，至結(jié)晶完全溶解后，利用MD公司產(chǎn)SPECTRAMAX Plus 型酶標(biāo)儀測定每孔在570nm處的吸光值（OD）值。在同一塊96孔板中樣品的每個濃度均設(shè)置三孔，另設(shè)三孔空白對照和無細(xì)胞調(diào)零孔（如果藥物有顏色要做相應(yīng)藥物濃度無細(xì)胞調(diào)零）。各孔OD值先做相應(yīng)無細(xì)胞調(diào)零，再取三孔平均OD值按IR (%) = (OD_空白對照-OD_樣品)/OD_空白對照 × 100%式計(jì)算每個濃度下細(xì)胞增殖抑制率 (IR%)。

2. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

細(xì)胞增殖抑制活性測試結(jié)果

在MTT法測試中，根據(jù)不同濃度的該化合物的胃癌細(xì)胞增殖抑制率，應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC₅₀值。結(jié)果見表2。

表2 化合物對胃癌細(xì)胞增殖的抑制活性

3. 結(jié)論

化合物具有明顯的胃癌細(xì)胞增殖抑制作用，可作為制備胃癌細(xì)胞增殖抑制劑或抗胃癌藥物用于抗腫瘤的研究。