一種5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域、分子生物學(xué)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種新型的抗 草甘麟的5-帰醇丙麗莽草酸-3-磯酸合成酶巧-enolpyruv}^ shikimate-3-phosphate synthase, EPSPS)，W及編碼上述合成酶的核酸序列，包含該序列或其編碼片段的核酸構(gòu)建 體，攜有該序列或其編碼片段或攜有所述核酸構(gòu)建體的載體，W及用所述構(gòu)建體或載體轉(zhuǎn) 化的宿主細胞。另外，本發(fā)明也涉及上述新型5-帰醇丙麗莽草酸-3-磯酸合成酶，編碼該 合成酶的核酸序列、核酸構(gòu)建體，重組表達載體W及用所述構(gòu)建體或載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞 的使用。
【背景技術(shù)】
[0002] 在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上廣泛使用除草劑進行雜草防治，但是除草劑常常在殺滅農(nóng)作物中雜 草的同時會對農(nóng)作物本身產(chǎn)生危害，而且會傷害許多商業(yè)作物和雙子葉植物，如大豆、棉 花、馬鈴墓、油菜。利用轉(zhuǎn)基因方法可W將抗除草劑基因?qū)朕r(nóng)作物，從而使該農(nóng)作物獲得 除草劑耐受能力，因此使用除草劑能夠選擇性地殺滅雜草。在農(nóng)田中噴灑除草劑只會殺滅 雜草但是不會對轉(zhuǎn)基因的農(nóng)作物產(chǎn)生藥害，送樣的系統(tǒng)被稱為除草劑-抗除草劑的作物配 套系統(tǒng)。
[0003] 目前，一些抗除草劑基因已經(jīng)被成功地應(yīng)用于除草劑-抗除草劑的作物配套系 統(tǒng)。例如抗2,4-二氯苯氧己酸的tfdA基因，抗漠苯臘的BXN基因和抗草了麟的bar基因 和pat基因等。導(dǎo)入上述除草劑的植物細胞W及植株已被證明具有抗相應(yīng)除草劑的功能。
[0004] 草甘麟屬有機磯類內(nèi)吸傳導(dǎo)型滅生性除草劑，可W殺死雜草和植物。由于草甘麟 有效且生產(chǎn)成本低，對環(huán)境保護好，理化性質(zhì)穩(wěn)定并具有高效、廣譜、低毒、低殘留、易分解、 不破壞±壤環(huán)境和對大多數(shù)植物具有強滅生性等優(yōu)點，目前已是世界范圍內(nèi)應(yīng)用最為廣 泛、非常重要的一種除草劑。但部分細菌的5-帰醇丙麗莽草酸-3-磯酸合成酶已發(fā)現(xiàn)對草 甘麟具有抗性，因此通過基因工程被分離獲得，經(jīng)過轉(zhuǎn)基因技術(shù)表達細菌的抗草甘麟功能 而獲得抗草甘麟的能力。但是為了抗性基因的多樣性，生產(chǎn)應(yīng)用中仍然需要新的抗草甘麟 基因和W此為基礎(chǔ)的抗草甘麟植物。然而，一種細菌的EPSPS是否抗草甘麟W及抗性的高 低，是不能通過EPSPS的氨基酸序列預(yù)測的。本發(fā)明提供一種新型抗草甘麟基因，該基因具 有很高的抗草甘麟能力，可W用來產(chǎn)生抗草甘麟植物，也可作為微生物和植物細胞培育中 的篩選標記。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明是一種新型的抗草甘麟5-帰醇丙麗莽草酸-3-磯酸合成酶W及編碼此酶 的核酸序列，用于轉(zhuǎn)到寄主包括植物中，使得寄主特別是植物能耐受草甘麟，并且可W利 用本發(fā)明的5-帰醇丙麗莽草酸-3-磯酸合成酶清除受草甘麟污染的資源。
[0006] 本發(fā)明一個目的是涉及編碼草甘麟耐受型EPSI^基因的核酸序列（SEQ ID No:2)， W及其編碼的氨基酸序列（SEQ ID No:l)，并克隆了其基因片段。該基因片段的序列與現(xiàn)有 技術(shù)中的±壤桿菌CP4 (Agrobacterium sp. CP4)抗草甘麟的5-帰醇丙麗莽草酸-3-磯酸 合成酶基因序列存在差異性，通過同源性比對，結(jié)果只有53. 7%的同源性（圖1)。證實了 該基因是新發(fā)明的。
[0007] 本發(fā)明還有一個目的是提供一種由上述核酸序列與使上述核酸序列在相應(yīng)宿主 細胞中表達所必需的調(diào)控序列可操作地連接而形成的核酸構(gòu)建體。所述調(diào)控序列具體可任 選包括啟動子、增強子、前導(dǎo)序列、聚腺巧酸化信號、W及轉(zhuǎn)錄和翻譯的起始和終止序列。
[0008] 本發(fā)明還有一個目的是提供一種含有上述核酸序列或核酸構(gòu)建體的載體。
[0009] 本發(fā)明還同時提供了一種轉(zhuǎn)基因植物細胞、部分宿主生物和完整的宿主生物，其 包含上述核酸序列。該植物細胞可W在適當(dāng)?shù)臈l件下表達上述核酸序列所編碼的蛋白，并 使該蛋白具有EPSPS酶活性W及降解草甘麟的能力，從而使該轉(zhuǎn)化的植物細胞具有草甘麟 耐受性。
[0010] 本發(fā)明還有一個目的是提供上述植物細胞及其后代細胞，送些細胞中含有上述核 酸序列或其編碼片段、核酸構(gòu)建體或載體，并且送些細胞具有草甘麟耐受性。
[0011] 本發(fā)明還有一個目的是提供一個在田間利用此類5-帰醇丙麗莽草酸-3-磯酸合 成酶轉(zhuǎn)化的植物和使用草甘麟的除草方法。在植物的生長過程中，噴灑草甘麟。由于此類 5-帰醇丙麗莽草酸-3-磯酸合成酶基因轉(zhuǎn)化的植物具有草甘麟耐受性，噴灑的草甘麟可W 殺死雜草，但不殺死5-帰醇丙麗莽草酸-3-磯酸合成酶基因轉(zhuǎn)化的植物。因此利用草甘麟 可W選擇性地控制植物生長中的雜草，不影響轉(zhuǎn)化了的植物的生長。
[0012] 本發(fā)明還有一個目的是進一步提供了清除草甘麟對一些材料的污染的方法。此方 法包括利用本發(fā)明的微生物W及此類微生物的提取物或其產(chǎn)物，如分解草甘麟的5-帰醇 丙麗莽草酸-3-磯酸合成酶，能分解草甘麟，使其不對環(huán)境產(chǎn)生危害。
[0013] 本發(fā)明還有一個目的是利用草甘麟耐受性的選擇性標記基因篩選轉(zhuǎn)化的植物細 胞或植物的方法。此方法包括用本發(fā)明的此類核酸轉(zhuǎn)化至其中一部分植物細胞中，在含有 草甘麟的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使得轉(zhuǎn)化的植物細胞可W生長；而非轉(zhuǎn)化的植物細胞不能生長。此 方法也包括轉(zhuǎn)化本發(fā)明的此類核酸的植物的篩選，其中成功轉(zhuǎn)化的植物在噴灑草甘麟時可 W生長，而未轉(zhuǎn)化的植物不能生長。
[0014] 本發(fā)明的其他目的還可W體現(xiàn)在W下對本發(fā)明的詳細描述W及具體實施例中。
[0015] 本發(fā)明提供了從±壤及污水中分離的一種菌株，它能破壞除草劑草甘麟的活性， 避免在噴灑草甘麟時對宿主包括植物產(chǎn)生有害影響。此外，本發(fā)明還提供了一種從該菌中 分離的5-帰醇丙麗莽草酸-3-磯酸合成酶，發(fā)揮著重要的作用，該酶發(fā)揮其降解草甘麟的 能力。
[0016] 本發(fā)明提供了一種抗草甘麟的EPSPS基因，并對該EPSPS基因克隆，對其進行序 列測定，如序列表中SEQ ID No:2所示。本發(fā)明的EPSPS基因序列與上述提到的±壤桿菌 CP4 (Agrobacterium sp. CP4)的5-帰醇丙麗莽草酸-3-磯酸合成酶基因氨基酸序列只有 53. 7%的同源性，核酸序列差異明顯。
[0017] 本發(fā)明還提供了上述核巧酸序列的變體，例如在該序列的基礎(chǔ)上進行任何改動， 如剪切、插入或替換一個或多個核巧酸，通過檢測鑒定，如果所得新的核酸序列能編碼具有 EPSPS活性的蛋白，郝么就屬于本發(fā)明的內(nèi)容。
[0018] 本發(fā)明還同時提供了上述基因編碼的草甘麟蛋白，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列如序列 表中沈Q ID No:1所示。
[0019] 本發(fā)明中抗草甘麟的蛋白質(zhì)也可W用人工方法引入一個或多個變異而獲得保持 有抗草甘麟能力的變異分子，比如對該序列進行剪切、插入或替換一個或多個氨基酸殘基， 通過篩選獲得具有抗草甘麟能力的新的蛋白質(zhì)分子，屬于本發(fā)明的內(nèi)容。
[0020] 將本發(fā)明編碼EPSPS的核巧酸序列與相對于該序列同源或異源的其它序列可操 作地連接，就構(gòu)成本發(fā)明的核酸構(gòu)建體。本發(fā)明的抗草甘麟基因的核酸片段可W進一步構(gòu) 建包含表達構(gòu)件的植物轉(zhuǎn)化質(zhì)粒。送個表達構(gòu)件包括啟動子、抗草甘麟基因和終止子。
[0021] 送個抗草甘麟基因表達構(gòu)件可W通過植物的轉(zhuǎn)化被整合到植物的基因組中，從而 穩(wěn)定遺傳和表達。該表達構(gòu)件可W通過農(nóng)桿菌或基因槍等方法導(dǎo)入植物的未成熟胚、成熟 胚、未分化的愈傷組織或原生質(zhì)體中表達。
[0022] 利用本發(fā)明的基因所編碼的蛋白質(zhì)序列，可W設(shè)計和人工合成密碼子優(yōu)化的有利 于在植物中表達的核巧酸序列。只要該序列具有草甘麟耐受性，就屬于本發(fā)明的范圍。利 用DM2. 0等軟件對該基因的序列進行密碼子優(yōu)化，利用生物學(xué)軟件DNAMAN等對優(yōu)化后的 序列作限制性酶切分析，對含有常見酶切位點的密碼子進行同義修飾，消除常用酶切位點。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明的方法，可將本發(fā)明的核酸構(gòu)建體，或者直接將本發(fā)明的分離的核酸 序列導(dǎo)入載體，用該載體轉(zhuǎn)化特定的宿主細胞，從而表達本發(fā)明的EPSPS酶并使得該重組 宿主細胞獲得草甘麟耐受性。或者不通過載體轉(zhuǎn)化，而是直接將本發(fā)明的分離的核酸序 列，或本發(fā)明的核酸構(gòu)建體用常規(guī)方法，如電穿孔等導(dǎo)入宿主細胞，同樣可W表達本發(fā)明的 EPSPS酶并賦予該細胞草甘麟耐受性。如此所獲得的載體和重組宿主細胞，W及獲得該細胞 的方法，都包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
[0024] 本發(fā)明所提供的對植物進行改造的方法是；利用序列表中SEQ ID No:2所示的或 與其具有同源性的基因或?qū)υ摶蛐蛄羞M行植物密碼子優(yōu)化的基因轉(zhuǎn)化植物細胞，再將轉(zhuǎn) 化后的植物細胞培育成相應(yīng)植株，從而使送些轉(zhuǎn)基因植物獲得抗草甘麟的能力。植物可選 大豆、棉花、油菜、水稻、玉米、小麥、大麥、高梁、馬鈴墓、甘藍、白菜和青椒等。
[0025] 本發(fā)明涉及了常用草甘麟耐受性的選擇性標記