一種提高丙酮酸產量和生產強度的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種提高丙酮酸產量和生產強度的方法，屬于發(fā)酵工程技術領域。
【背景技術】
[0002] 丙酮酸(pyruvate)是生物代謝的中間產物，處于各代謝途徑的中間環(huán)節(jié)，如:是糖 酵解的終產物;通過脫氫脫羧反應轉化為TCA循環(huán)的起始物質乙酰-CoA;在丙酮酸羧化酶作 用下生成TCA循環(huán)的中間產物草酰乙酸;通過轉氨基作用生成丙氨酸等，同時也是非常重要 的酮酸之一。由于丙酮酸是多種物質的合成前體，目前社會對丙酮酸的需求量日益增加，其 廣泛的應用于日化，食品，醫(yī)療，農業(yè)等行業(yè)。
[0003]丙酮酸的生產方法主要有化學合成法和微生物發(fā)酵法兩大類?；瘜W合成法主要有 酒石酸法、乳酸乙酷空氣氧化法、經基丙酮法、電化學合成法、乳酸催化氧化法。目前丙酮酸 的生產正在以前的化工合成轉向通過微生物發(fā)酵制備。微生物發(fā)酵法相對于化工合成有更 多的優(yōu)點，如原料的轉化率高，污染小，成本低等優(yōu)點。
[0004]目前，微生物發(fā)酵法生產丙酮酸作為一種替代性的綠色環(huán)保方法成為了國內外研 究的熱門。而要通過微生物發(fā)酵獲得高產丙酮酸，其中最關鍵是要有一株高產并且高生產 強度的丙酮酸菌株。目前對高產丙酮酸菌株的改造主要集中在對代謝途徑中的某些關鍵酶 進行過表達和一些旁路途徑進行敲出。

【發(fā)明內容】

[0005]為了解決上述問題，本發(fā)明提供一種通過過表達線粒體丙酮酸載體蛋白來增強丙 酮酸發(fā)酵的生產強度和產量的方法。
[0006]本發(fā)明的第一個目的是提供一種提高丙酮酸產量和生產強度的方法，所述方法是 在丙酮酸生產菌株中過表達線粒體丙酮酸載體蛋白。
[0007] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法，是表達NCBI上GeneID:852800的線粒體 丙酮酸載體蛋白MPC1。
[0008]在本發(fā)明的一種實施方式中，所述生產菌株是以缺失了Ura基因的光滑球擬酵母 T.glabrataCCTCCM202019為宿主表達NCBI上GeneID:852800的MPC1 而得到的。
[0009]在本發(fā)明的一種實施方式中，所述過表達是以酵母表達質粒pY26(購自德而寶公 司）為載體。
[0010] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種丙酮酸產量和生產強度提高的重組菌，所述重組 菌過表達線粒體丙酮酸載體蛋白MPC1。
[0011] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述重組菌，是以缺失了Ura基因的T.glabrata CCTCCM202019為宿主、酵母表達質粒pY26為載體表達NCBI上GeneID:852800的MPC1。
[0012] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述重組菌的構建:將目的片段MPC1經過限制性內 切酶EcoRI和XamI雙酶切消化后，并將MPC1克隆到EcoRI/XamI雙酶切消化的表達質粒 pY26中，得到重組酵母表達質粒pY26-MPCl，將重組質粒通過電擊轉化的方法轉入到受體菌 T.glabrataCCTCCM202019(TglT)，在不含尿嘧啶的培養(yǎng)基中進行篩選，得到線粒體丙酮 酸載體蛋白過量表達的重組菌Tglf(pY26-MPC1)。
[0013] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述MPC1基因是以釀酒酵母菌株N85基因組為模板 擴增得到的。
[0014] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述酵母表達質粒PY26為大腸桿菌-酵母之間的穿 梭載體，在大腸桿菌中選擇標記為amp^而在酵母中選擇標記為尿嘧啶缺陷型互補。
[0015]本發(fā)明的第三個目的是提供一種利用所述重組菌發(fā)酵生產丙酮酸的方法，是將重 組菌活化后接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，在30°C，220rpm條件下進行發(fā)酵培養(yǎng)。
[0016]在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基（/L):葡萄糖120g，尿素3.86g，MgS〇4 · 7H20 0 · 8g，KH2P〇42g，CH3C00Na3g，微量元素液 10ml，維生素液 10ml，初始pH= 5 · 5;所 述微量元素液:MnCl2 · 4H20 12g，F(xiàn)eS〇4 · 7H20 2g，CaCl2 · 2H20 2g，CuS〇4 · 5H20 0.05g， ZnCl20.5g，用2mol/L的HC1溶解后定容至1L;所述維生素液：生物素0.004g，硫胺素 0.75mg，吡哆醇0.04g，煙酸0.8g，用2mol/L的HC1溶解后定容至1L。
[0017]在本發(fā)明的一種實施方式中，所述接種的接種量為10%。
[0018] 有益效果：
[0019] 本發(fā)明方法可提高丙酮酸產量和生產強度的；相對于對照菌株(Tgir(pY26))，本 發(fā)明構建的重組菌株Tglf(pY26-MPCl)的細胞干重、葡萄糖消耗速率、丙酮酸的產量和丙酮 酸生產強度分別提高了 24.9%、28.2%、91.9%和94.1 %的。
【具體實施方式】
[0020] 菌株和質粒：光滑球擬酵母（T.glabrataCCTCCM202019，TgU-)其為煙酸、生物 素、硫胺素、鹽酸吡哆醇，尿嘧啶5種營養(yǎng)缺陷型菌株（即在T.glabrataCCTCCM202019的基 礎上敲除了Ura基因）。酵母表達質粒pY26為大腸桿菌-酵母之間的穿梭載體，在大腸桿菌中 選擇標記為amp"，而在酵母中選擇標記為尿嘧啶缺陷型互補。
[0021] 細胞干重的測定:取一定量的菌懸液于10mL容量瓶中，加入2mL鹽酸(2mol/L)溶解 懸液中的碳酸鈣，加去離子水定容到10mL，充分混勻，用UV7500型可見光分光光度計，于 660nm處測定0D值，利用細胞干重標準曲線計算出細胞干重。
[0022]丙酮酸和葡萄糖的測定:高效液相色譜(HPLC)。儀器:Agilent1260高效液相色譜 儀（配紫外可見檢測器、示差折光檢測器和工作站），色譜條件：色譜柱:AminexHPX-87H ionexchangecolumn，流動相：5mMH2SO4,流速:0.6mL/min，柱溫：40°C，進樣量：10yL，紫外 檢測器波長：210nm(檢測丙酮酸），示差折光檢測器:檢測葡萄糖，樣品制備：lmL發(fā)酵液于 12，000rpm下離心5min，上清經過適當?shù)南♂屘幚砗徒?.22yL濾膜過濾后，進行高效液相色 譜分析。
[0023]培養(yǎng)基:種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖30g，植物蛋白胨10g，磷酸二氫鉀1.0g，七水硫 酸鎂〇.5g，固體培養(yǎng)基添加20g瓊脂。115°C滅菌15min。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖120g，尿素 3 · 86g，MgS〇4 · 7H20 0 · 8g，KH2P〇42g，CH3⑶ONa3g，微量元素液（過濾除菌）10ml，維生素液 (過濾除菌）l〇ml，于115°C下滅菌ISminjOg/L的碳酸|丐(單獨滅菌)被添加用來調節(jié)pH。微 量元素液：MnCl2 · 4H20 12g，F(xiàn)eS〇4 · 7H20 2g，CaCl2 · 2H20 2g，CuS〇4 · 5H20 0.05g，ZnCl2 0.5g，用2mol/L的HC1溶解后定容至1L。維生素液：生物素0.004g，硫胺素0.75mg，吡哆醇 ο. 〇4g，煙酸0.8g，用2mol/L的HC1溶解后定容至1L。
[0024] 實施例1:釀酒酵母MPC1的擴增與表達質粒的構建
[0025] 以釀酒酵母基因組為模板，PCR擴增得到目的基因MPC1片段，通過瓊脂糖凝膠電泳 得到約400bp的特異片段，目的基因MPC1經過限制性內切酶EcoRI和XamI雙酶切消化后， 濃縮純化，將MPCUMPC2基因定向克隆到表達質粒pY26中，得到重組酵母表達質粒pY26-MPC1，將上述重組表達質粒轉化到感受態(tài)細胞JM109并涂布在含有氨芐青霉素的LB平板上 進行擴增。
[0026]實施例2:重組菌的構建與鑒定
[0027]由于上述重組質粒上帶有Ura3基因，將上述重組酵母質粒分別電擊轉化到受體菌T.glabrata(Ura-)(即缺失了Ura基因的T.glabrataCCTCCM202019)，得到在不加尿嘧啶 的基礎培養(yǎng)基上正常生長的重組菌TgU_(pY26-MPCl)
[0028] 實施例3:重組菌與對照菌對照發(fā)酵實驗
[0029] 挑取重組菌TgU-(pY26_MPCl)和含有空質粒pY26的T.glabrata(Ura-)的單菌落于 種子培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)18_24h，以10 %的接種量，將上述活化培養(yǎng)好的種子液接種到發(fā)酵 培養(yǎng)基中，在30°C，220rpm條件下進行發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵結果如表1所示，重組菌的細胞干重、 葡萄糖消耗速率、丙酮酸的產量和丙酮酸生產強度相對于對照菌(TglT(pY26))分別提高了 24·9%、28·2%、91·9%和 94.1%。
[0030] 表1重組菌TgU_(pY26-MPCl)與對照菌TgU_(pY26)的發(fā)酵對比
[0031]
[0032] 雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范 圍應該以權利要求書所界定的為準。
【主權項】
1. 一種丙酮酸產量和生產強度提高的重組菌，其特征在于，所述重組菌過表達線粒體 丙酮酸載體蛋白MPC1。2. 根據(jù)權利要求1所述的重組菌，其特征在于，所述重組菌是以缺失了Ura基因的光滑 球擬酵母T.glabrataCCTCCM202019為宿主表達NCBI上GeneID:85280(^^]MPC1。3. 根據(jù)權利要求1所述的重組菌，其特征在于，所述過表達是以酵母表達質粒pY26為載 體。4. 根據(jù)權利要求1所述的重組菌，其特征在于，所述重組菌的構建:將目的片段MPC1經 過限制性內切酶EcoRI和XamI雙酶切消化后，并將MPC1定向克隆到表達質粒ρΥ26中，得到 重組酵母表達質粒PY26-MPC1，將重組質粒通過電擊轉化的方法轉入到尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型 受體菌中，在不含尿嘧啶的培養(yǎng)基中進行篩選，得到線粒體丙酮酸載體蛋白過量表達的重 組菌TgU-(pY26-MPCl)。5. -種提高丙酮酸產量和生產強度的方法，其特征在于，所述方法是在丙酮酸生產菌 株中過表達線粒體丙酮酸載體蛋白。6. 根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法是表達NCBI上GeneID: 852800的 線粒體丙酮酸載體蛋白MPC1。7. 權利要求1-4任一所述重組菌在發(fā)酵生產丙酮酸方面的應用。8. 根據(jù)權利要求7所述的應用，其特征在于，所述應用是將重組菌活化后接種至發(fā)酵培 養(yǎng)基，在30°C，220rpm條件下進行發(fā)酵培養(yǎng)。9. 根據(jù)權利要求8所述的應用，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基1L中含有:葡萄糖120g，尿 素3·86g，MgS〇4·7H20 0·8g，KH2P〇42g，CH3C00Na3g，微量元素液 10ml，維生素液 10ml，初始pH = 5.5;所述微量元素液:MnCl2 · 4H20 12g，F(xiàn)eS〇4 · 7H20 2g，CaCl2 · 2H20 2g，CuS〇4 · 5H20 0.05g，ZnCl2〇.5g，用2mol/L的HC1溶解后定容至1L;所述維生素液:生物素0.004g，硫胺素 0.75mg，吡哆醇0.04g，煙酸0.8g，用2mol/L的HC1溶解后定容至1L。10. 權利要求1-4任一所述重組菌生產的丙酮酸在日化、食品、制備藥物、農業(yè)領域的應 用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提高丙酮酸產量和生產強度的方法，屬于發(fā)酵工程技術領域。本發(fā)明通過在光滑球擬酵母菌株中過表達線粒體丙酮酸載體蛋白，加強丙酮酸進入線粒體，進一步加強菌體的生長，從而提高生長偶聯(lián)型產物丙酮酸的產量和生產強度，通過基因工程技術，將來源于釀酒酵母的MPC1基因過了表達于TgU-中，獲得了一株高產丙酮酸的工程菌株TgU-(pY26-MPC1)，相對于對照菌株TgU-(pY26)，工程菌TgU-(pY26-MPC1)的細胞干重、葡萄糖消耗速率、丙酮酸的產量和丙酮酸生產強度相對于對照菌(TgU-(pY26))分別提高了24.9％、28.2％、91.9％和94.1％。
【IPC分類】C12R1/88, C12N1/19, C12P7/40
【公開號】CN105462868
【申請?zhí)枴緾N201510907318
【發(fā)明人】周景文, 陳堅, 羅正山, 堵國成, 劉松, 方芳
【申請人】江南大學
【公開日】2016年4月6日
【申請日】2015年12月10日