本發(fā)明屬于丙酮酸的制備技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種酶法轉(zhuǎn)化L-丙氨酸制備丙酮酸的方法。

背景技術(shù)：

丙酮酸（焦性葡萄酸）是參與整個生物體基本代謝的中間產(chǎn)物之一。丙酮酸參與生物體的糖代謝、膠質(zhì)、氨基酸、蛋白質(zhì)等的生化合成、代謝、醇的發(fā)酵等，可以通過乙酰COA和三羧酸循環(huán)實現(xiàn)體內(nèi)糖、脂肪和氨基酸之間的相互轉(zhuǎn)化，在三大營養(yǎng)物質(zhì)的代謝聯(lián)系中起著重要的樞紐作用。

丙酮酸在生產(chǎn)領(lǐng)域具有重要的作用，是生產(chǎn)色氨酸、苯丙氨酸和維生素B的主要原料，也是合成L-多巴的原料，在有機(jī)合成和生化研究領(lǐng)域具有重要作用。

目前中國主要依賴進(jìn)口丙酮酸類產(chǎn)品，市場上主要采用的是發(fā)酵法、化學(xué)合成法、酶轉(zhuǎn)化法。日本在生產(chǎn)左旋丙酮酸方面處于國際領(lǐng)先地位，主要采用的是生物發(fā)酵的方法，但發(fā)酵法制取丙酮酸轉(zhuǎn)化率往往較低，因為丙酮酸在糖代謝中處于最活躍的中心節(jié)點，在細(xì)胞中很容易轉(zhuǎn)化為其他化合物, 因此很難累積，而且，丙酮酸作為發(fā)酵產(chǎn)物混合物的一種成分，往往是相當(dāng)?shù)蜐舛鹊?，從?fù)雜的發(fā)酵液中分離提取丙酮酸，一般是難以進(jìn)行的，費用也較昂貴?；瘜W(xué)合成的方法主要采用乳酸氧化法，以乳酸為原料，氧化脫氫一步法生產(chǎn)丙酮酸。但乳酸直接制取丙酮酸非常困難,根據(jù)工藝不同必須選用合適的催化劑?？梢赃x擇的催化劑有磷酸鐵、鉬酸碲鹽、銀、釩等。但缺點是成本較高，約6萬元每噸。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是針對上述存在的缺陷而提供一種酶法轉(zhuǎn)化L-丙氨酸制備丙酮酸的方法，具有成本低廉、純度高、無污染的優(yōu)點。

本發(fā)明采用酶法轉(zhuǎn)化L-丙氨酸制備丙酮酸的方法，利用固定化的L-氨基酸氧化酶轉(zhuǎn)化L-丙氨酸制備丙酮酸。

本發(fā)明的利用酶法轉(zhuǎn)化L-丙氨酸制備丙酮酸的方法，其詳細(xì)步驟為：

步驟1、向濕菌體溶液中加入丙烯酰胺單體和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺，在加速劑四甲基乙二胺和催化劑過硫酸銨的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀的固定化酶凝膠，進(jìn)而制取固定化的L-氨基酸氧化酶；

步驟2、以L-丙氨酸作為反應(yīng)底物，在上述固定化的L-氨基酸氧化酶的作用下氧化脫氨得到L-丙酮酸。

濕菌體為含有L-氨基酸氧化酶的大腸桿菌體。

濕菌體溶液為濕菌體硅油-水溶液

硅油-水溶液的濃度為80%。

步驟1中，制取濕菌體溶液的方法為：將濕菌體均勻的分散在硅油-水溶液中，在超聲波細(xì)胞破碎機(jī)進(jìn)行低溫破碎，過濾去除菌體殘片，即得到濕菌體溶液。

步驟1中，所述丙烯酰胺單體加入量為所述濕菌體溶液重量的200%-600%，所述交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺加入量為濕菌體溶液重量的2.5%-5%，所述加速劑四甲基乙二胺加入量為濕菌體溶液重量的5%-8%，所述催化劑過硫酸銨的加入量為濕菌體溶液重量的2%-5%。

步驟1中，將三維網(wǎng)狀的固定化酶凝膠攪拌均勻，用水洗滌凝膠，過濾后得固體，即為固定化的L-氨基酸氧化酶。

步驟2中，氧化脫氨時，控制反應(yīng)溫度、溶氧量、調(diào)節(jié)pH，所述控制反應(yīng)溫度為25℃-35℃，所述pH為6.0-7.5，所述溶氧量為410-450mg/L。

本發(fā)明具有以下特點：

（1）固定化酶催化的最適反應(yīng)溫度為30℃-35℃；

（2）固定化酶催化的最適pH為6.5；

（3）極易將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開；

（4）固定酶的使用效率高，成本降低。

本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明的酶法轉(zhuǎn)化L-丙氨酸制備丙酮酸的方法，以L-氨基酸為底物，利用制備的固定化酶，進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，獲得產(chǎn)物丙酮酸。固定化酶極易于產(chǎn)物丙酮酸、底物L(fēng)-氨基酸分開，底物轉(zhuǎn)化率高，雜質(zhì)少，成本低，生產(chǎn)每噸丙酮酸成本大約1.3萬元，反應(yīng)條件溫和，容易控制。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)的說明。

實施例1：將濕菌體80g均勻的分散在80%硅油-水溶液100ml中，在750W赫茲的超聲波中，低溫15℃進(jìn)行破碎，采用3s-2s-3s的方式進(jìn)行破碎15分鐘，向菌體溶液中加入2倍量的丙烯酰胺單體和2.5%的交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺，在加速劑四甲基乙二胺（加入量5%）和催化劑過硫酸銨（加入量2%）的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀的固定化酶凝膠，之后攪拌均勻，用水洗滌凝膠，過濾后得固體，即為固定化酶。

將L-丙氨酸89g溶解在純化水中，配置成8.9%溶液，升溫至30℃，向反應(yīng)液中加入固定化酶19g，酶活774U，控制溶氧410-450mg/L，反應(yīng)PH在6.0，反應(yīng)3h后取樣，經(jīng)高效液相檢測上清液丙酮酸濃度（80g/L）和L-丙氨酸(≤0.5g/L)剩余，當(dāng)L-丙氨酸剩余小于等于0.5g/L時，認(rèn)為反應(yīng)完全，所得料液降溫至室溫，過濾去除固定化酶，將料液濃縮至含丙酮酸30%，向料液中加入活性炭10g，攪拌脫色30分鐘，脫碳過膜后，繼續(xù)減壓濃縮得無色粘稠液體106g，即為丙酮酸粗品,轉(zhuǎn)化率≥99%，純度≥98%。

實施例2：將濕菌體90g均勻的分散在80%硅油-水溶液100ml中，在800W赫茲的超聲波中，低溫15℃進(jìn)行破碎，采用3s-2s-3s的方式進(jìn)行破碎15分鐘，向菌體溶液中加入5倍量的丙烯酰胺單體和4%交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺，在加速劑四甲基乙二胺（加入量6%）和催化劑過硫酸銨（加入量4%）的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀的固定化酶凝膠，之后攪拌均勻，用水洗滌凝膠，過濾后得固體，即為固定化酶。

將L-丙氨酸95g溶解在純化水中，配置成9.5%溶液，升溫至32℃，向反應(yīng)液中加入固定化酶22g，酶活879U，控制反應(yīng)PH在6.5，溶氧410-450mg/L，反應(yīng)5h取樣，經(jīng)高效液相檢測上清液丙酮酸濃度（86g/L）和L-丙氨酸（≤0.5g/L）剩余，當(dāng)L-丙氨酸剩余小于等于0.5g/L時，認(rèn)為反應(yīng)完全，所得料液降溫至室溫，過濾去除固定化酶，將料液濃縮至含丙酮酸30%，向料液中加入活性炭10g，攪拌脫色30分鐘，脫碳過膜后，繼續(xù)減壓濃縮得無色粘稠液體115g，即為丙酮酸粗品，轉(zhuǎn)化率≥99%，純度≥98%。

實施例3：將濕菌體100g均勻的分散在80%硅油-水溶液100ml中，在850W赫茲的超聲波中，低溫15℃進(jìn)行破碎，采用3s-2s-3s的方式進(jìn)行破碎15分鐘，向菌體溶液中加入6倍量的丙烯酰胺單體和5%的交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺，在加速劑四甲基乙二胺（加入量8%）和催化劑過硫酸銨(加入量5%)的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀的固定化酶凝膠，之后攪拌均勻，用水洗滌凝膠，過濾后得固體，即為固定化酶。

將L-丙氨酸100g溶解在純化水中，配置成10%溶液，升溫至35℃，向反應(yīng)液中加入固定化酶25g，酶活987U，控制反應(yīng)PH在7.5，溶氧410-450mg/L，反應(yīng)5h取樣，經(jīng)高效液相檢測上清液丙酮酸濃度（92g/L）和L-丙氨酸剩余（≤0.5g/L），當(dāng)L-丙氨酸剩余小于等于0.5g/L時，認(rèn)為反應(yīng)完全，所得料液降溫至室溫，過濾去除固定化酶，將料液濃縮至含丙酮酸30%，向料液中加入活性炭10g，攪拌脫色30分鐘，脫碳過膜后，繼續(xù)減壓濃縮得無色粘稠液體120g，即為丙酮酸粗品，轉(zhuǎn)化率≥99%，純度≥98%。