一種基于電化學(xué)系統(tǒng)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)還原力再生發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及一種基于電化學(xué)系統(tǒng)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)還原力再生發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的方法，屬 于生物化工技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0003] 對(duì)于不同碳源和產(chǎn)物而言，還原力供給和消耗水平并不總是一致，如1分子葡萄糖 和1分子甘油經(jīng)糖酵解途徑轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇式丙酮酸時(shí)，均產(chǎn)生2分子NADH，若終產(chǎn)物為還 原性較強(qiáng)的丁二酸或乙醇，當(dāng)以葡萄糖為唯一碳源時(shí)，用于產(chǎn)物合成的還原力明顯不足，降 低了還原性產(chǎn)物的收率，而以甘油為碳源時(shí)，又會(huì)因?yàn)檫€原力過(guò)剩，菌體生長(zhǎng)停滯。為了平 衡胞內(nèi)輔酶代謝，恢復(fù)菌體生長(zhǎng)的同時(shí)增加還原型產(chǎn)物的收率，基因工程改造的方法最先 被使用。Sanchez等（Journal of Biotechnology, 2005，117(4): 395-405)通過(guò)在大腸 桿菌內(nèi)過(guò)量表達(dá)來(lái)自酵母菌菌株的甲酸脫氫酶，增加了胞內(nèi)NADH總量，還原性產(chǎn)物乙醇的 量明顯增加，同時(shí)副產(chǎn)物積累量有所減少。
[0004] 隨著代謝工程和合成生物學(xué)的迅猛發(fā)展，通過(guò)對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行基因工程改造，可 以極大地促進(jìn)目標(biāo)代謝產(chǎn)物的合成，增加產(chǎn)量和收率。但是，在改造的同時(shí)，細(xì)胞的原有代 謝途徑受到影響，代謝不平衡會(huì)阻礙目標(biāo)代謝物產(chǎn)量的進(jìn)一步提升，尤其是還原型產(chǎn)物合 成過(guò)程中輔酶不平衡的問(wèn)題。通過(guò)引入輔酶相關(guān)代謝途徑，如引入1，3_丙二醇或NAD+合成 途徑以降低胞內(nèi)還原力水平，或以還原性較高的底物為碳源以增加胞內(nèi)還原力水平，均可 以在一定程度上調(diào)控胞內(nèi)的輔酶平衡。但是代謝工程改造的同時(shí)會(huì)增加菌體的代謝負(fù)荷， 對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)物合成造成負(fù)面影響。
[0005] 在電化學(xué)系統(tǒng)中，通過(guò)對(duì)陰陽(yáng)兩級(jí)或陰極施加某一特定的電壓，體系中游離的電 子載體可以從陰極電極獲得電子被還原，處于還原態(tài)的電子載體會(huì)通過(guò)某種方式進(jìn)入細(xì)胞 周知空間，釋放電子用于胞內(nèi)代謝及NADH的再生，增加胞內(nèi)的還原力水平。這樣既可以避免 因基因工程改造引起的菌株生長(zhǎng)問(wèn)題，又可以增加胞內(nèi)還原力的供給。曹占平等(化工學(xué) 報(bào)，2012,63(12) :4042-4047)通過(guò)電化學(xué)系統(tǒng)輔助微生物降解五氯酚時(shí)發(fā)現(xiàn)，電化學(xué)輔助 微生物體系中存在著細(xì)胞與電極之間的電子傳遞，胞內(nèi)NADH的增多有利于五氯酚的降解。
[0006] 但是，不同的代謝物所需的還原力以及所需的電化學(xué)調(diào)控手段存在差異。在2,3_ 丁二醇的合成過(guò)程中，供給還原力的同時(shí)應(yīng)該考慮電子及輔酶代謝平衡對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影 響，而對(duì)于1，4_ 丁二醇，增加了的還原力在很大范圍內(nèi)并不會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi)輔酶代謝不平衡現(xiàn) 象，反而是越多的還原力越有利于其合成(Frontiers in Microbiology, 2015，6: 575-592)。因此，必須根據(jù)目標(biāo)代謝產(chǎn)物的性質(zhì)和合成途徑，將增加了的還原力水平控制在一定 的水平，在提高還原性產(chǎn)物收率的同時(shí)，又不會(huì)因還原力過(guò)高而抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種基于電化學(xué)系統(tǒng)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)還原力再生發(fā)酵產(chǎn)丁二酸 的方法，將電化學(xué)系統(tǒng)引入微生物發(fā)酵體系中用于調(diào)控胞內(nèi)輔酶平衡，包括增加還原力總 量(NAD(H))及平衡輔酶代謝(NADH/NAD+)，在不達(dá)到抑制細(xì)胞生長(zhǎng)閥值的情況下，提高產(chǎn)物 丁二酸的產(chǎn)量。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下： 一種基于電化學(xué)系統(tǒng)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)還原力再生發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的方法，包括菌種活化、種 子培養(yǎng)、厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸三步驟，厭氧發(fā)酵采用電化學(xué)發(fā)酵，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加電子 載體，并在陰極施加相應(yīng)的電壓值，所述電子載體的濃度為0.01-0.5 mmol/L。
[0009] 所述電子載體為中性紅或者核黃素。
[0010] 在陰極施加的陰極電壓值通過(guò)循環(huán)伏安法在-0.1 V到IV之間進(jìn)行掃描確定，掃描 速度為5-10 mV/s。
[0011] 所述電化學(xué)發(fā)酵中陽(yáng)極電解液為磷酸鹽緩沖液，所述磷酸鹽緩沖液中添加氯化鈉 (0.1mol/L)以增加電解液的導(dǎo)電率，pH 6.5-7.5，濃度0.1-0.5111〇1/1。
[0012] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基為一水合檸檬酸3 g · L-SNa^POa · 12H20 4 g · L-SKH2P04 8 g · L_1,(NH4)2HP〇4 8 g · L_1,NH4C1 0.2 g · L_1,(NH4)2S〇4 0.75 g · L_1,MgS〇4 · 7H20 1 g · L-SCaCh · 2H20 10.0 mg · L-SZnSCk · 7H20 0.5 mg · L-SCuCh · 2H20 0.25 mg · L-S MnS04 · H20 2.5 mg · rSCoCb · 6H2O 1.75 mg · Γ1 ,H3B03 0.12 mg · L_1,A12(S04 )3 1.77 mg · L-^NasMoCU · 2H2O 0.5 mg · L-S朽1 檬酸鐵 16.1 mg · L-S生物素2 mg · L-S維生素 Bi 20 mg · L-S 葡萄糖30-40g/L。
[0013]電化學(xué)發(fā)酵時(shí)，陰極室內(nèi)填充的發(fā)酵培養(yǎng)基中包含不同濃度的電子載體，并在陰 極施加相應(yīng)的電壓值。當(dāng)電子載體為中性紅(NR)時(shí)，濃度為0.05mmol/L，陰極施加電壓為-0.65 V。當(dāng)電子載體為核黃素(VB2)時(shí)，濃度為0.1mm〇l/L，陰極施加電壓為-0.21 V。
[0014]所述磷酸鹽緩沖液中添加氯化鈉以增加電解液的導(dǎo)電率，pH 7 · 0，濃度0 · lmo 1/L。
[0015] 所述菌株為任意可在厭氧條件下生長(zhǎng)并可發(fā)酵積累丁二酸的菌株，包括但不限于 大腸埃希氏菌(Escherichia coli)AFPlll。
[0016] 所述電化學(xué)發(fā)酵中，采用氣密性良好的H-Cell微生物電解池裝置，選用石墨碳?xì)?作為陰陽(yáng)兩極電極，Ag/AgCl (飽和KC1)作為參比電極，發(fā)酵培養(yǎng)基和磷酸鹽緩沖液分別作 為陰極和陽(yáng)極電解液，并通過(guò)電子載體介導(dǎo)電子由電極向菌體的傳遞，通過(guò)外加電子載體 的協(xié)助，將電子從陰極電極傳遞至細(xì)胞內(nèi)部用于NADH再生。
[0017] 陰極電勢(shì)的施加采用一步調(diào)控或者分階段調(diào)控的方法。本發(fā)明所述一步調(diào)控為將 種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基同時(shí)向陰極室施加電壓;本發(fā)明所述分階段調(diào)控為接種之后立刻 通電，時(shí)長(zhǎng)5-8小時(shí)，以便將氧化態(tài)電子載體轉(zhuǎn)化為還原態(tài);之后停止通電，每3小時(shí)取樣，當(dāng) 菌體濃度開(kāi)始增長(zhǎng)時(shí)，菌株由停滯期迅速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)再次通電以促進(jìn)胞內(nèi)NADH 的再生。
[0018]前期通電將氧化性中性紅還原，減少毒性作用，被還原之后停止通電，降低胞內(nèi)還 原力，回復(fù)菌株生長(zhǎng)能力，到達(dá)對(duì)數(shù)期后再次通電，促進(jìn)還原力再生，增加丁二酸的合成通 過(guò)電化學(xué)手段的調(diào)控，胞內(nèi)NADH的量有所增加，分階段條件下，NADH的增加與細(xì)胞生長(zhǎng)、丁 二酸的合成過(guò)程相平衡，丁二酸產(chǎn)量最高。
[0019] 所述菌株為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)AFPlll，厭氧條件下于電化學(xué)裝置 中發(fā)酵時(shí)，通過(guò)采用兩階段發(fā)酵模式，在電子載體的協(xié)助下胞內(nèi)NADH總量有所提高，胞內(nèi)還 原力(NADH/NAD+)水平增加了 2倍多，有利于還原型產(chǎn)物丁二酸的高效合成。
[0020] 本發(fā)明所述的菌種活化、種子培養(yǎng)步驟是常規(guī)的菌種活化方法及種子培養(yǎng)方法， 本發(fā)明中將大腸埃希氏菌(Escherichia coli)AFPlll菌株經(jīng)固體平板培養(yǎng)基活化后，37 °C，有氧條件下培養(yǎng)12-14小時(shí)后轉(zhuǎn)接于種子培養(yǎng)基，在37°C，200轉(zhuǎn)/分鐘的條件下培養(yǎng)6-8 小時(shí)得到種子液； 將所述種子液按照10%(v/V)的接種量接種于所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，添加不同濃度的電子 載體，充二氧化碳，并在37°C厭氧培養(yǎng)48小時(shí)考察不同電子載體濃度下菌株生長(zhǎng)情況。
[0021] 優(yōu)選地，所述充二氧化碳均為向裝置中通入無(wú)菌二氧化碳2分鐘，以保證培養(yǎng)時(shí)的 厭氧環(huán)境。
[0022] 優(yōu)選地，在分階段調(diào)控策略實(shí)施中，當(dāng)菌體進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)開(kāi)始通電，增加胞內(nèi) 還原力(NADH/NAD+)的同時(shí)，平衡細(xì)胞生長(zhǎng)和丁二酸合成。
[0023] 優(yōu)選地，所述固體平板培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基的配方為:蛋白胨10 g·!/1，酵母粉 5 g · L-SNaCl 5 g · L-S瓊脂粉 15-20 g · L-、
[0024] 本發(fā)明通過(guò)采用電化學(xué)調(diào)控手段，動(dòng)態(tài)調(diào)控了胞內(nèi)還原力水平，與不通電條件下 產(chǎn)丁二酸實(shí)驗(yàn)相比，其有益效果在于： 本發(fā)明所用大腸埃希氏菌(Escherichia coli)AFPlll菌株可以在發(fā)酵培養(yǎng)基中，以葡 萄糖為唯一碳源在純厭氧條件下生長(zhǎng)、合成并積累丁二酸:在厭氧條件下發(fā)酵48小時(shí)后丁 二酸積累量可達(dá)l〇.38g/L;當(dāng)進(jìn)行電化學(xué)發(fā)酵時(shí)，在一步施加-0.65V的電壓并添加有 0.05mmo 1 /L中性紅的條件下，胞內(nèi)NADH總量提高28.75%，NADH/NAD+提高了 67.50%，證明電 化學(xué)可以應(yīng)用于胞內(nèi)NADH的再生。但是胞內(nèi)過(guò)高的還原力會(huì)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，丁二酸產(chǎn)量降 低，因此，采用分階段調(diào)控策略平衡胞內(nèi)還原力水平。在分階段發(fā)酵調(diào)控過(guò)程中，前期NADH/ NAD+處于較低的水平，后期施加-0.65V將NADH/NAD+提高到1.21，相比一階段電化學(xué)調(diào)控時(shí) 有所下降，在此種發(fā)酵模式下丁二酸積累量達(dá)到最大值，產(chǎn)量達(dá)到15.06g/L，相比對(duì)照實(shí)驗(yàn) 組丁二酸產(chǎn)量增加了45.09%。由此可見(jiàn)，通過(guò)電化學(xué)手段可以調(diào)控胞內(nèi)輔酶總量及比例，可 以提高還原性產(chǎn)物丁二酸的產(chǎn)量，因此本發(fā)明方法具有重大的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖