一種琥珀酸的生物制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，公開了一種琥珀酸的生物制備方法，與傳統(tǒng)的方法 相比，具有產(chǎn)量高，生長周期短，培養(yǎng)基簡單。利用本發(fā)明生產(chǎn)的琥珀酸用于醫(yī)藥、生物工 程、塑料、生物化工等行業(yè)。
【背景技術(shù)】
[0002] 琥珀酸為四碳二元酸，可以用作食品的調(diào)味劑，磺胺、維生素等藥物的合成原料， 也可以用于油漆、染料的合成，制作化工清洗劑以及用于合成可降解的生物塑料等，需求十 分廣泛。目前世界各國規(guī)定用于食品的琥珀酸只能夠使用發(fā)酵法制得的產(chǎn)品，嚴(yán)禁使用化 工方法合成的產(chǎn)品。
[0003] 傳統(tǒng)的化工合成方法為從丁烷通過順式丁烯二酐生產(chǎn)，而丁烷是通過石油裂解方 法制造的。隨著石油資源的枯竭，其生產(chǎn)成本越來越高。
[0004] 生物發(fā)酵法是以葡萄糖為原料，通過細(xì)菌的代謝在常溫、常壓下制備琥珀酸。這種 方法較化工方法所獲得的琥珀酸的成本至少便宜20%以上。隨著從生物質(zhì)如秸桿、樹葉、鋸 末等農(nóng)林廢棄物制造葡萄糖技術(shù)的發(fā)展，生物發(fā)酵法制造琥珀酸的成本會進(jìn)一步降低，其 生產(chǎn)成本會更進(jìn)一步降低。
[0005] 美國能源部組織專家和學(xué)者對可以作為基礎(chǔ)化工原料且能夠從生物質(zhì)原料中轉(zhuǎn) 化生產(chǎn)的化合物進(jìn)行了遴選，最后選定了 12種具有戰(zhàn)略性意義的化合物作為21世紀(jì)生物 化工原料研究和開發(fā)的重點，琥珀酸名列其中。所選定的化合物可以利用現(xiàn)有的以化石能 源為基礎(chǔ)的化工設(shè)施進(jìn)行進(jìn)一步加工，即不需要進(jìn)行大的固定資產(chǎn)投資，就可以進(jìn)行生產(chǎn)。
[0006] 2015年全世界塑料的產(chǎn)量預(yù)計將達(dá)到2億9千7百萬噸，全世界約8%的石油及 天然氣等化工能源用于塑料的生產(chǎn)。我國塑料的產(chǎn)量占全世界產(chǎn)量的23. 5%。隨著化工能 源的枯竭及伴隨的價格增長，和化工能源消耗所導(dǎo)致的溫室氣體效應(yīng)等一系列問題，使人 們越來越重視利用可再生能源如生物質(zhì)、陳化糧淀粉等來加工塑料。這種以生物質(zhì)為載體 的塑料，可以在環(huán)境中降解不造成白色污染。在生物質(zhì)的生產(chǎn)過程中均伴有二氧化碳的利 用，可以降低大氣中二氧化碳的濃度，減少溫室氣體效應(yīng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 發(fā)明的目的在于提供一種琥珀酸的生物制備方法，與傳統(tǒng)的方法相比，具有產(chǎn)量 高，生長周期短，培養(yǎng)基簡單的特點。利用本發(fā)明生產(chǎn)的琥珀酸用于醫(yī)藥、生物工程、塑料、 生物化工等行業(yè)。
[0008] 為了達(dá)到上述目的，對糖酵解、三羧酸循環(huán)和磷酸戊糖通路進(jìn)行了改造，使葡萄糖 進(jìn)入細(xì)菌后，絕大部分轉(zhuǎn)化為琥珀酸，并在這一過程中利用二氧化碳，使其骨架整合到琥珀 酸，提1? 了廣量。
[0009] 為了達(dá)到上述目的，需要對代謝通路中的一些基因進(jìn)行敲除，有些基因需要增加 其表達(dá)量，而且由于一些涉及細(xì)菌的主要代謝通路，需要分階段進(jìn)行調(diào)整。
[0010] 本發(fā)明提供的方法構(gòu)建的菌株具有產(chǎn)量高、生長周期短、培養(yǎng)基簡單等特點，生產(chǎn) 的琥珀酸可用于醫(yī)藥、生物工程、環(huán)境保護(hù)、塑料、生物化工等行業(yè)。
【具體實施方式】
[0011] 以下實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離 本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明 的范圍。
[0012] 若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。 實施例中，所涉及到的百分比（％)，若未特別指出，液體之間的百分比為體積百分比，固 體之間的百分比為重量百分比，固體與液體之間的百分比為重量體積比（10 %即表示每 100ml液體中含固體10g)。
[0013] 以構(gòu)建可以生產(chǎn)大腸桿菌的琥珀酸酸為例，說明本發(fā)明的【具體實施方式】。
[0014] 一 .磷酸烯醇式丙酮酸消耗和調(diào)控途徑基因的敲除：
[0015] 1.丙酮酸激酶基因的條件敲除敲除：
[0016] pykAUp GCCGA GCGGCCGCtttcggattaggctcttcagc
[0017] pykADn tattatcgcgatctgttgctgg
[0018] pykAUp1 ccagcaacagatcgcgataataTAGTCTAGAggatcAGATCTagtaagtacgttgccggat g
[0019] pykADn1 GCCGAGCGGCCGCaaagttccgtgatcccattct
[0020] 2.葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白基因 ptsl的敲除：
[0021] PtsIUp GCCGA GCGGCCGCccgcattgtttgccgatctcttca
[0022] PtsIDn aagcagagctttaccgaaagcgat
[0023] PtsIUp1 atcgctttcggtaaagctctgcttTAGTCTAGAggatcAGATCTcggacgagttaatgacg ctggtt
[0024] PtsIDnl GCCGA GCGGCCGCacgctaccggacagtttgatcagt
[0025] 3.檸檬酸合成酶基因的條件敲除：
[0026] gltAUp GCCGA GCGGCCGCcatgtggcgaatacctacga
[0027] gltADn cctggatcactgttcaggataa
[0028] gltAUpl ttatcctgaacagtgatccaggtagtctagaggatcagatctgctgaacgacccgtacttt at
[0029] gltADn1 GCCGAGCGGCCGCgctatgatgctcccggtttat
[0030] 4. MgsA基因的敲除：
[0031] MgsAUp GCCGA GCGGCCGCtacccagctcatcaaccaggtcaa
[0032] MgsADn cgcaatatgtttccgcgcaggtaa
[0033] MgsAUp1 ttacctgcgcggaaacatattgcgTAGtaatccagtcgccgcatttcaacg
[0034] MgsADn1 GCCGA GCGGCCGCcaaaccggaagagcgcattctgat
[0035] 5. 6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因的條件敲除：
[0036] gndUp GCCGA GCGGCCGCggcttcgtgaaagccagata
[0037] gndDn gcctggaatgttcgcaaataag
[0038] gndUpl cttatttgcgaacattccaggcTAGTCTAGAggatcAGATCTccaggcacagcgtgactatt t
[0039] gndDnl GCCGA GCGGCCGCcggtaaacagcatcgggatatt
[0040] 二.基因敲除的基本過程：
[0041] 1.以大腸桿菌染色體DNA為模板，建立如下PCR反應(yīng)：
[0042]
[0043] 以獲得上游片段；
[0044]
[0045] 以獲得下游片段。
[0046] 反應(yīng)程序：98°C 15秒，50°C 15秒，68°C 1分鐘，循環(huán)35次；最后在68°C延伸10分 鐘。
[0047] 2.進(jìn)行重疊 PCR以獲得編碼序列缺失的PCR片段，建立如下反應(yīng)：
[0048]
[0049] 以獲得編碼序列缺失的片段。
[0050] 反應(yīng)程序：98°C 15秒，50°C 15秒，68°C 1分鐘，循環(huán)35次；最后在68°C延伸10分 鐘。
[0051] 3.編碼序列缺失片段用Notl酶切插入pDS132NT質(zhì)粒中，獲得對應(yīng)的可以用于雜 交的質(zhì)粒。
[0052] 4.所獲得的pDS132NT質(zhì)粒與BL21菌株雜交，經(jīng)過LB培養(yǎng)基循環(huán)后，獲得經(jīng)PCR 證實基因片段缺失的菌落，從而建立對應(yīng)基因缺失的菌株。
[0053] 5.重復(fù)上述過程，直到所有需要敲除的基因完成為止，進(jìn)而獲得 BL21 Δ PykA Δ ptsl Δ gndA Δ gltA Δ MgsA 編碼基因缺失的菌株。
[0054] 三.琥珀酸合成途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)量增加：
[0055] 1.靜止期rpoS基因啟動子的人工合成
[0056] Ggatctctagaaatcggcggaaccaggcttttgcttgaatgttccgtcaagggatcacgggtaggagcc accttcatatggatc
[0057] 用Xbal和Ndel酶切，插入用同樣酶切處理的pET_32a中，獲得的質(zhì)粒命名為 pET-32a rpoS.
[0058] 2.磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的擴(kuò)增
[0059] ppcF ggatccatatgaacgaacaatattccgcattgcgtagt
[0060] ppcR ttagccggtattacgcatacctgcc
[0061] 建立以下PCR反應(yīng)：
[0062]
[0063] 以獲得ppc基因片段。
[0064] 反應(yīng)程序：98°C 15秒，50°C 15秒，68°C 1分鐘，循環(huán)35次；最后在68°C延伸10分 鐘。
[0065] 3.磷酸烯醇式丙酮酸激酶基因的擴(kuò)增
[0066] ppsAF ggcaggtatgcgtaataccggctaataagaaggagatatacaatgtccaacaatggctcgtca ccg
[0067] ppsAR ggatcggatcctggttaagcctggctgaactgaagaaataa
[0068] 建立以下PCR反應(yīng)：
[0069]
[0070]
[0071] 以獲得ppsA基因片段。
[0072] 反應(yīng)程序：98°C 15秒，50°C 15秒，68°C 1分鐘，循環(huán)35次；最后在68°C延伸10分 鐘。
[0073] 4.含有上述關(guān)鍵基因的操縱子的構(gòu)建
[0074] ppcFndel atgaacgaacaatattccgcattgcgtagt
[0075] ppsAR tggttaagcctggctgaactgaagaaataa
[0076] 建立以下PCR反應(yīng)：
[0077]
[0078] 以獲得ppc-ppsA基因片段，該片段在ppsA基因起始密碼子的前面含有核糖體結(jié) 合位點，以利于PPsA的翻譯。
[0079] 反應(yīng)程序：98°C 15秒，50°C 15秒，68°C 3分鐘，循環(huán)25次；最后在68°C延伸10分 鐘。
[0080] 5.操縱子在大腸桿菌染色體基因位點上的整合
[0081] 所獲得的ppc-ppsA基因片段用Ndel和BamHI酶切，插入用同樣酶切處 理的pET_32arpoS中，所獲得的質(zhì)粒命名為pET_32a rpoS ppc-ppsA.該質(zhì)粒Xbal 和BamHI酶切處理，插入用Xbal和Bglll酶切處理的pDS132NT Λ ptsl質(zhì)粒中，獲 得pDS132NTAptsI: :rpoSppc-ppsA質(zhì)粒。重復(fù)上述雜交過程中，最后獲得E.coli BL21 APykAA gndAA gltAAMgsAAptsI ： ：rpoSppc-ppsA〇
[0082] 四：Ε· coli BL21 APykAA gndAA gltAAMgsAAptsI : :rpoSppc_ppsA 菌株的發(fā)酵 實驗：
[0083] 用下列培養(yǎng)基發(fā)酵該菌株，以葡萄糖為底物，氨水維持pH在6. 8,測定琥珀酸的產(chǎn) 量為1.6-1.8M/M葡萄糖。
[0084] 每升培養(yǎng)基含磷酸二氫鈉6. 5克，磷酸氫二鉀1. 7克，碳酸鈣10克，硫酸鎂1克， 微量元素混合液1毫升，適當(dāng)?shù)南輨┤绌? 05%食用油。起始葡萄糖10克，隨后流加50% 的葡萄糖。發(fā)酵周期為36小時。
【主權(quán)項】
1. 一種琥珀酸的生物制備方法，其通過對消耗琥珀酸的丙酮酸激酶、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白 ptsl、檸檬酸合成酶以及調(diào)控基因mgsA和6-磷酸葡萄糖脫氫酶的基因進(jìn)行敲除和生產(chǎn)琥 珀酸的基因磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶擴(kuò)增來完成。2. 如權(quán)利要求書1，丙酮酸激酶、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白ptsl、檸檬酸合成酶以及調(diào)控基因 mgsA和6-磷酸葡萄糖脫氫酶的敲除是通過同源重組的方式來完成的。3. 如權(quán)利要求書1，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的擴(kuò)增是通 過同源重組的方式在敲除葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白ptsl的同時來完成的。4. 如權(quán)利要求書3,磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的擴(kuò)增是通 過靜止期表達(dá)的rpoS基因的啟動子來完成。5. 如權(quán)利要求書1，所構(gòu)建的菌株其發(fā)酵培養(yǎng)基中需要加入碳酸鈣來調(diào)節(jié)pH、提供反 應(yīng)所需的碳酸氫根離子和使琥珀酸形成沉淀，促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。6. -種琥珀酸的生物制備方法，其包括權(quán)利要求1-5所述的步驟。
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，公開了一種琥珀酸的生物制備方法，與傳統(tǒng)的方法相比，具有產(chǎn)量高，生長周期短，培養(yǎng)基簡單。利用本發(fā)明生產(chǎn)的琥珀酸用于醫(yī)藥、生物工程、塑料、生物化工等行業(yè)。
【IPC分類】C12P7/46, C12N15/70
【公開號】CN105483166
【申請?zhí)枴緾N201410553670
【發(fā)明人】李明
【申請人】天水綠健生物技術(shù)有限責(zé)任公司
【公開日】2016年4月13日
【申請日】2014年10月9日