本發(fā)明涉及一種生物法利用海蓬子制備石斑魚用免疫增強(qiáng)劑的方法，屬于飼料添加劑領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
石斑魚屬暖水性底棲生活魚類，主要生活在熱帶、亞熱帶海域的巖礁洞穴及近海大陸架的珊湖礁海區(qū)，少數(shù)生活于溫帶水域，在我國主要分布于南海和東海南部地區(qū)。石斑魚多以群居生活，其種類繁多，我國己記錄的有45種。石斑魚個體較大、肉質(zhì)鮮美，富含多不飽和脂肪酸，其食用價值和保健價值都很高，被認(rèn)為是一種優(yōu)良的海洋經(jīng)濟(jì)魚類。目前，石斑魚在東亞、中東和東南亞等國家深受歡迎，市場需求日益增加，隨著自然資源大幅下降，石斑魚養(yǎng)殖成為保障消費者石斑魚需求的重要手段，逐漸發(fā)展為我國南方最重要的海水養(yǎng)殖對象之一。近些年來，由于高密度水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，導(dǎo)致疾病頻發(fā)，消毒劑和抗生素的廣泛使用，不僅引起動物的內(nèi)源性感染或二重感染，而且導(dǎo)致動物出現(xiàn)抗藥性及免疫功能下降。隨著研究的深入，一種新型的綠色添加劑—免疫增強(qiáng)劑得到廣泛研究。免疫增強(qiáng)劑，主要是作用于非特異性免疫因子來達(dá)到防病、抗病目的。雖然其不在魚體內(nèi)產(chǎn)生免疫記憶，但能夠在短時期內(nèi)顯著提高機(jī)體的抗病能力。因此，日益受到國際養(yǎng)殖業(yè)的重視，成為水產(chǎn)保護(hù)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點。
為了滿足不斷增長的水產(chǎn)品的需求，解決因水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大和生長周期縮減而導(dǎo)致的生理機(jī)能紊亂、疾病頻發(fā)成為水產(chǎn)養(yǎng)殖的重點問題，也是水產(chǎn)飼料產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵。在此背景下，抗生素類飼料添加劑受到熱捧，被廣泛應(yīng)用于飼料業(yè)中，在一定程度上促進(jìn)了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，但是抗生素帶來的高殘留、高污染和抗藥性等問題愈發(fā)的嚴(yán)重。目前已經(jīng)陸續(xù)開發(fā)出微生態(tài)制劑、中草藥免疫增強(qiáng)劑等環(huán)保型飼料添加劑，但仍存在作用功效不確定、受外界環(huán)境影響較大等弊端，特別是對于海水養(yǎng)殖魚類，中草藥免疫增強(qiáng)劑存在適口性差、水污染嚴(yán)重等弊端，因此基于海洋或堿性資源開發(fā)新型免疫增強(qiáng)劑將有利于進(jìn)一步推進(jìn)石斑魚生態(tài)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。
海蓬子又稱海蘆筍、海鹿茸、海蟲草、富貴菜等，屬于莉科植物，海蓬子屬，在鹽生植物分類中，屬于莖肉質(zhì)化真鹽生植物，多見于沼澤地、鹽湖旁和及海灘。海蓬子其干燥植株含纖維素5～20％，蛋白質(zhì)9.0％，富含人體必需的8種氨基酸、微量元素和維生素，其中胡蘿卜素含量超過普通蔬菜的40倍，還含有天然的植物保健鹽和天然的植物堿(微角皂苷)，具有降低膽固醇、降壓等功效。海蓬子的種植對改善我國鹽堿環(huán)境具有重要應(yīng)用價值，但目前海蓬子的綜合開發(fā)利用程度較低，制約著海蓬子加工產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益，也直接影響了海蓬子的種植推廣，因此，如果將海蓬子進(jìn)行高值化綜合開發(fā)利用，將對環(huán)境和經(jīng)濟(jì)做出重要貢獻(xiàn)。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述不足，基于循環(huán)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展理念，采用現(xiàn)代生物技術(shù)開發(fā)利用陸生鹽堿植物資源海蓬子制備石斑魚用免疫增強(qiáng)劑，可顯著提高石斑魚的機(jī)體免疫力、改善動物生長性能，降低飼料系數(shù)，減少抗生素大量使用造成的養(yǎng)殖業(yè)污染，且原料來源廣，價格低廉，是一種綠色、環(huán)保、高效的飼料添加劑，研制開發(fā)一種生物法利用海蓬子制備的石斑魚用免疫增強(qiáng)劑。
本發(fā)明上述目的是通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)的：
一種生物法利用海蓬子制備的石斑魚用免疫增強(qiáng)劑，其特征在于由以下質(zhì)量比的原料制成：海蓬子粉30～50份、山藥粉15～20份、杜仲8～12份、絞股藍(lán)8～12份、神曲6～8份、金銀花3～5份、川芎6～8份、甘草6～8份、白花蛇舌草3～5份、穿心蓮5～7份、藍(lán)莓3～5份。
一種生物法利用海蓬子制備的石斑魚用免疫增強(qiáng)劑，其特征在于所述原料組成優(yōu)選為：海蓬子粉40份、山藥粉18份、杜仲10份、絞股藍(lán)10份、神曲7份、金銀花4份、川芎7份、甘草7份、白花蛇舌草4份、穿心蓮6份、藍(lán)莓4份。
本發(fā)明提供一種生物法利用海蓬子制備石斑魚免疫增強(qiáng)劑的工藝，所述海蓬子粉預(yù)處理工藝如下：
(1)粉碎浸泡：將去除雜質(zhì)的海蓬子莖桿粉碎，過100目篩，加入海蓬子質(zhì)量比5％的海藻，然后加入2倍質(zhì)量比純凈水浸泡3～5h；
(2)蒸煮：將浸泡后的海蓬子懸浮液蒸煮1～2h，然后在密封條件下降溫至室溫；
(3)分離：將蒸煮液進(jìn)行固液分離，得海蓬子莖桿粉，分離后的水進(jìn)入步驟(1)進(jìn)行循環(huán)利用；
(4)自然腐熟：控制海蓬子莖桿粉含水量40～50％，控溫30～50℃，自然腐熟30～50d；
(5)二步發(fā)酵酶解：自然腐熟結(jié)束后，加入海蓬子質(zhì)量比2％的纖維素酶和1％的低聚木糖酶，并接種海蓬子質(zhì)量比2～3％的耐鹽嗜堿芽孢桿菌，在28～35℃條件下發(fā)酵3～5d，12小時攪拌一次；發(fā)酵結(jié)束后即得海蓬子發(fā)酵粉。
上述海藻是滸苔、海帶、馬尾藻、鼠尾藻中的一種或幾種的混合物。
本發(fā)明提供一種生物法利用海蓬子制備石斑魚免疫增強(qiáng)劑的工藝，其特征在于包括如下步驟：
(1)混合粉碎：將各原料按比例混合，然后粉碎過100目篩；加入原料質(zhì)量3倍的純凈水；
(2)酶解：加入中草藥原料質(zhì)量比3～5％的纖維素酶、2～3％的低聚木糖酶，在40～60℃條件下控溫酶解4～8h，每隔0.5h攪拌一次；
(3)過濾分離：過濾酶解液，得到酶解液和酶解殘渣；
(4)超聲波輔助浸提：向酶解殘渣中加入3～5倍的純凈水，在超聲波輔助作用下，100℃條件下回流浸提20～30min，超聲功率400w，頻率25kHz；超聲功率400w，頻率25kHz；
(5)過濾分離：過濾浸提液，得到浸提液和浸提殘渣；
(6)發(fā)酵液制備：向步驟(5)中的浸提殘渣中加入5倍質(zhì)量比的純凈水，并加入殘渣質(zhì)量比3.0～5.0％葡萄糖、2.0～3.0％酵母膏、0.3～0.5％磷酸二氫鉀、0.02％MgSO4、0.01％CaCl2，pH調(diào)至7.0～7.2；
(7)好氧發(fā)酵：選用液體發(fā)酵罐，裝液量體積比為60～70％，接種地衣芽孢桿菌和產(chǎn)朊假絲酵母菌，接種量分別為2～4％、1～2％，控制發(fā)酵溫度28～37℃，轉(zhuǎn)速150～300rpm；在此發(fā)酵條件下發(fā)酵12～24h；
(8)厭氧發(fā)酵：好氧發(fā)酵結(jié)束后，接種乳酸桿菌和兩歧雙歧桿菌，接種量均為2～4％，發(fā)酵溫度28～37℃，控溫厭氧發(fā)酵12～24h；
(9)合并：將步驟(3)中的酶解液、步驟(5)中的浸提液和步驟(8)中的發(fā)酵液合并；
(10)低溫濃縮：在低溫條件下將步驟(9)合并后的增強(qiáng)劑溶液進(jìn)行濃縮；
(11)吸附干燥：濃縮后用1～1.5倍質(zhì)量比的麩皮吸附，在40～60℃鼓風(fēng)干燥機(jī)中干燥，水分控制在8～10％；
(12)粉碎：將干燥后的產(chǎn)品用粉碎機(jī)60目過篩粉碎，即得石斑魚用免疫增強(qiáng)劑。
本發(fā)明提供一種生物法利用海蓬子制備的石斑魚用免疫增強(qiáng)劑，具有預(yù)防、保健、治療和調(diào)節(jié)免疫等多種功效，是替代抗生素藥物的理想、綠色、環(huán)保、安全、新型飼料添加劑。該發(fā)明免疫增強(qiáng)劑一是可以高效調(diào)理石斑魚腸道健康，標(biāo)本兼治，固本培元，保持腸道微生態(tài)平衡和最佳免疫狀態(tài)，提高營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收率，提高動物機(jī)體免疫力；二是可抑制和阻止病原大腸菌、梭狀芽孢桿菌、沙門氏菌等有害菌的發(fā)生，增加腸道益生菌，維持健康的腸道菌群；三是增強(qiáng)免疫作用，通過刺激腸道內(nèi)免疫系細(xì)胞，增加局部抗體的形成，增加巨噬細(xì)胞活性；四是免疫增強(qiáng)劑進(jìn)入腸內(nèi)抵制有害菌，降低惡臭及有害成分形成，使排出的糞便消除惡臭，在保護(hù)養(yǎng)殖環(huán)境的同時提高石斑魚肉質(zhì)品質(zhì)。
本發(fā)明提供一種生物法利用海蓬子制備的石斑魚用免疫增強(qiáng)劑，所述石斑魚用免疫增強(qiáng)劑產(chǎn)品在水產(chǎn)飼料全價料中使用的質(zhì)量比例為0.1～0.5％：或所述的飼料添加劑在預(yù)混料、濃縮料以全價料中所需的比例添加使用。
本發(fā)明提供一種生物法利用海蓬子制備的石斑魚用免疫增強(qiáng)劑，其優(yōu)勢在于：一是按照中草藥君臣佐使的配伍原則，以陸生鹽堿植物海蓬子為君藥，輔以山藥粉、杜仲、絞股藍(lán)為臣藥，以神曲、金銀花、川芎、白花蛇舌草、穿心蓮、藍(lán)莓為佐藥，以甘草為使藥，共行相輔相成之功效；尤其是海蓬子富含天然的植物保健鹽和天然的植物堿(微角皂苷)，對海水養(yǎng)殖魚類較傳統(tǒng)中草藥保健功效更佳；二是免疫增強(qiáng)劑制備過程中采用了“酶解提取+超聲波輔助浸提+多菌種好氧厭氧發(fā)酵二步發(fā)酵”的生產(chǎn)工藝，與現(xiàn)有的中草藥飼料添加劑產(chǎn)品相比作用效果更顯著；三是免疫增強(qiáng)劑具有海蓬子、中草藥和益生菌等的多重優(yōu)點，可以高效調(diào)理石斑魚腸道健康，標(biāo)本兼治，固本培元，保持腸道微生態(tài)平衡和最佳免疫狀態(tài)，提高營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收率，提高動物機(jī)體免疫力，提高養(yǎng)殖收益，降低養(yǎng)殖風(fēng)險；四是該產(chǎn)品可替代抗生素使用，對石斑魚無不良影響，使用安全，不存在藥物殘留和耐藥性等問題，有著廣闊的市場前景。
具體實施方式
實施例1：
一種生物法利用海蓬子制備的石斑魚用免疫增強(qiáng)劑，具體制備步驟如下：
(1)粉碎浸泡：將去除雜質(zhì)的海蓬子莖桿粉碎，過100目篩，加入海蓬子質(zhì)量比5％的滸苔，然后加入2倍質(zhì)量比純凈水浸泡4h；
(2)蒸煮：將浸泡后的海蓬子懸浮液蒸煮1.5h，然后在密封條件下降溫至室溫；
(3)分離：將蒸煮液進(jìn)行固液分離，得海蓬子莖桿粉，分離后的水進(jìn)入步驟(1)進(jìn)行循環(huán)利用；
(4)自然腐熟：控制海蓬子莖桿粉含水量40～50％，控溫30～50℃，自然腐熟40d；
(5)二步發(fā)酵酶解：自然腐熟結(jié)束后，加入海蓬子質(zhì)量比2％的纖維素酶和1％的低聚木糖酶，并接種海蓬子質(zhì)量比2.5％的耐鹽嗜堿芽孢桿菌，在28～35℃條件下發(fā)酵4d，12小時攪拌一次；發(fā)酵結(jié)束后即得海蓬子發(fā)酵粉；
(6)混合粉碎：將各原料按海海蓬子粉40份、山藥粉18份、杜仲10份、絞股藍(lán)10份、神曲7份、金銀花4份、川芎7份、甘草7份、白花蛇舌草4份、穿心蓮6份、藍(lán)莓4份比例混合，然后粉碎過100目篩；加入原料質(zhì)量3倍的純凈水；
(7)酶解：加入中草藥原料質(zhì)量比4％的纖維素酶、2.5％的低聚木糖酶，在40～60℃條件下控溫酶解6h，每隔0.5h攪拌一次；
(8)過濾分離：過濾酶解液，得到酶解液和酶解殘渣；
(9)超聲波輔助浸提：向酶解殘渣中加入4倍的純凈水，在超聲波輔助作用下，100℃條件下回流浸提25min，超聲功率400w，頻率25kHz；超聲功率400w，頻率25kHz；
(10)過濾分離：過濾浸提液，得到浸提液和浸提殘渣；
(11)發(fā)酵液制備：向步驟(10)中的浸提殘渣中加入5倍質(zhì)量比的純凈水，并加入殘渣質(zhì)量比4.0％葡萄糖、2.5％酵母膏、0.4％磷酸二氫鉀、0.02％MgSO4、0.01％CaCl2，pH調(diào)至7.0～7.2；
(12)好氧發(fā)酵：選用液體發(fā)酵罐，裝液量體積比為60～70％，接種地衣芽孢桿菌和產(chǎn)朊假絲酵母菌，接種量分別為3％、1.5％，控制發(fā)酵溫度28～37℃，轉(zhuǎn)速150～300rpm；在此發(fā)酵條件下發(fā)酵18h；
(13)厭氧發(fā)酵：好氧發(fā)酵結(jié)束后，接種乳酸桿菌和兩歧雙歧桿菌，接種量均為3％，發(fā)酵溫度28～37℃，控溫厭氧發(fā)酵18h；
(14)合并：將步驟(8)中的酶解液、步驟(10)中的浸提液和步驟(13)中的發(fā)酵液合并；
(15)低溫濃縮：在低溫條件下將步驟(14)合并后的增強(qiáng)劑溶液進(jìn)行濃縮；
(16)吸附干燥：濃縮后用1～1.5倍質(zhì)量比的麩皮吸附，在40～60℃鼓風(fēng)干燥機(jī)中干燥，水分控制在8～10％；
(17)粉碎：將干燥后的產(chǎn)品用粉碎機(jī)60目過篩粉碎，即得石斑魚用免疫增強(qiáng)劑。
實施例2：
一種生物法利用海蓬子制備的石斑魚用免疫增強(qiáng)劑，具體制備步驟如下：
(1)粉碎浸泡：將去除雜質(zhì)的海蓬子莖桿粉碎，過100目篩，加入海蓬子質(zhì)量比5％的海帶，然后加入2倍質(zhì)量比純凈水浸泡5h；
(2)蒸煮：將浸泡后的海蓬子懸浮液蒸煮2h，然后在密封條件下降溫至室溫；
(3)分離：將蒸煮液進(jìn)行固液分離，得海蓬子莖桿粉，分離后的水進(jìn)入步驟(1)進(jìn)行循環(huán)利用；
(4)自然腐熟：控制海蓬子莖桿粉含水量40～50％，控溫30～50℃，自然腐熟30d；
(5)二步發(fā)酵酶解：自然腐熟結(jié)束后，加入海蓬子質(zhì)量比2％的纖維素酶和1％的低聚木糖酶，并接種海蓬子質(zhì)量比3％的耐鹽嗜堿芽孢桿菌，在28～35℃條件下發(fā)酵5d，12小時攪拌一次；發(fā)酵結(jié)束后即得海蓬子發(fā)酵粉；
(6)混合粉碎：將各原料按海蓬子粉50份、山藥粉15份、杜仲12份、絞股藍(lán)8份、神曲8份、金銀花3份、川芎8份、甘草6份、白花蛇舌草5份、穿心蓮5份、藍(lán)莓5份比例混合，然后粉碎過100目篩；加入原料質(zhì)量3倍的純凈水；
(7)酶解：加入中草藥原料質(zhì)量比5％的纖維素酶、3％的低聚木糖酶，在40～60℃條件下控溫酶解4h，每隔0.5h攪拌一次；
(8)過濾分離：過濾酶解液，得到酶解液和酶解殘渣；
(9)超聲波輔助浸提：向酶解殘渣中加入5倍的純凈水，在超聲波輔助作用下，100℃條件下回流浸提20min，超聲功率400w，頻率25kHz；超聲功率400w，頻率25kHz；
(10)過濾分離：過濾浸提液，得到浸提液和浸提殘渣；
(11)發(fā)酵液制備：向步驟(10)中的浸提殘渣中加入5倍質(zhì)量比的純凈水，并加入殘渣質(zhì)量比5.0％葡萄糖、2.0％酵母膏、0.5％磷酸二氫鉀、0.02％MgSO4、0.01％CaCl2，pH調(diào)至7.0～7.2；
(12)好氧發(fā)酵：選用液體發(fā)酵罐，裝液量體積比為60～70％，接種地衣芽孢桿菌和產(chǎn)朊假絲酵母菌，接種量分別為4％、2％，控制發(fā)酵溫度28～37℃，轉(zhuǎn)速150～300rpm；在此發(fā)酵條件下發(fā)酵12h；
(13)厭氧發(fā)酵：好氧發(fā)酵結(jié)束后，接種乳酸桿菌和兩歧雙歧桿菌，接種量均為4％，發(fā)酵溫度28～37℃，控溫厭氧發(fā)酵12h；
(14)合并：將步驟(8)中的酶解液、步驟(10)中的浸提液和步驟(13)中的發(fā)酵液合并；
(15)低溫濃縮：在低溫條件下將步驟(14)合并后的增強(qiáng)劑溶液進(jìn)行濃縮；
(16)吸附干燥：濃縮后用1～1.5倍質(zhì)量比的麩皮吸附，在40～60℃鼓風(fēng)干燥機(jī)中干燥，水分控制在8～10％；
(17)粉碎：將干燥后的產(chǎn)品用粉碎機(jī)60目過篩粉碎，即得石斑魚用免疫增強(qiáng)劑。
實施例3：
一種生物法利用海蓬子制備的石斑魚用免疫增強(qiáng)劑，具體制備步驟如下：
(1)粉碎浸泡：將去除雜質(zhì)的海蓬子莖桿粉碎，過100目篩，加入海蓬子質(zhì)量比5％的馬尾藻，然后加入2倍質(zhì)量比純凈水浸泡3h；
(2)蒸煮：將浸泡后的海蓬子懸浮液蒸煮1h，然后在密封條件下降溫至室溫；
(3)分離：將蒸煮液進(jìn)行固液分離，得海蓬子莖桿粉，分離后的水進(jìn)入步驟(1)進(jìn)行循環(huán)利用；
(4)自然腐熟：控制海蓬子莖桿粉含水量40～50％，控溫30～50℃，自然腐熟50d；
(5)二步發(fā)酵酶解：自然腐熟結(jié)束后，加入海蓬子質(zhì)量比2％的纖維素酶和1％的低聚木糖酶，并接種海蓬子質(zhì)量比2％的耐鹽嗜堿芽孢桿菌，在28～35℃條件下發(fā)酵5d，12小時攪拌一次；發(fā)酵結(jié)束后即得海蓬子發(fā)酵粉；
(6)混合粉碎：將各原料按海蓬子粉30份、山藥粉20份、杜仲8份、絞股藍(lán)12份、神曲6份、金銀花5份、川芎6份、甘草8份、白花蛇舌草3份、穿心蓮7份、藍(lán)莓3份比例混合，然后粉碎過100目篩；加入原料質(zhì)量3倍的純凈水；
(7)酶解：加入中草藥原料質(zhì)量比3％的纖維素酶、2％的低聚木糖酶，在40～60℃條件下控溫酶解8h，每隔0.5h攪拌一次；
(8)過濾分離：過濾酶解液，得到酶解液和酶解殘渣；
(9)超聲波輔助浸提：向酶解殘渣中加入3倍的純凈水，在超聲波輔助作用下，100℃條件下回流浸提30min，超聲功率400w，頻率25kHz；超聲功率400w，頻率25kHz；
(10)過濾分離：過濾浸提液，得到浸提液和浸提殘渣；
(11)發(fā)酵液制備：向步驟(10)中的浸提殘渣中加入5倍質(zhì)量比的純凈水，并加入殘渣質(zhì)量比3.0％葡萄糖、3.0％酵母膏、0.3％磷酸二氫鉀、0.02％MgSO4、0.01％CaCl2，pH調(diào)至7.0～7.2；
(12)好氧發(fā)酵：選用液體發(fā)酵罐，裝液量體積比為60～70％，接種地衣芽孢桿菌和產(chǎn)朊假絲酵母菌，接種量分別為2％、1％，控制發(fā)酵溫度28～37℃，轉(zhuǎn)速150～300rpm；在此發(fā)酵條件下發(fā)酵24h；
(13)厭氧發(fā)酵：好氧發(fā)酵結(jié)束后，接種乳酸桿菌和兩歧雙歧桿菌，接種量均為2％，發(fā)酵溫度28～37℃，控溫厭氧發(fā)酵24h；
(14)合并：將步驟(8)中的酶解液、步驟(10)中的浸提液和步驟(13)中的發(fā)酵液合并；
(15)低溫濃縮：在低溫條件下將步驟(14)合并后的增強(qiáng)劑溶液進(jìn)行濃縮；
(16)吸附干燥：濃縮后用1～1.5倍質(zhì)量比的麩皮吸附，在40～60℃鼓風(fēng)干燥機(jī)中干燥，水分控制在8～10％；
(17)粉碎：將干燥后的產(chǎn)品用粉碎機(jī)60目過篩粉碎，即得石斑魚用免疫增強(qiáng)劑。
以下以驗證試驗說明本申請取得的技術(shù)效果：
表1試驗分組表
表2試驗結(jié)果
上述試驗結(jié)果表明，本申請免疫增強(qiáng)劑取得了顯著的技術(shù)效果，較現(xiàn)有市售中草藥免疫增強(qiáng)劑差異顯著(P<0.01),且試驗結(jié)果表明改變原料組成會顯著降低產(chǎn)品效果(P<0.01)。
以上實施例僅用于說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其進(jìn)行限制；盡管參照前述實施例對被發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，但對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，依然可以對前述實施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而對這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明所要求保護(hù)的技術(shù)方案的精神和范圍。