一種白念珠菌烯醇化酶抗體的檢測試紙的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及抗體檢測技術領域，特別是一種白念珠菌抗體的檢測試紙。
【背景技術】
[0002] 念珠菌為條件致病性真菌，正常情況下可定植于宿主的皮膚、口腔、上呼吸道、陰 道和腸道等部位，不引起疾病。當某些因素如廣譜抗生素大量使用、放療與化療、免疫抑制 劑使用等破壞了宿主免疫系統與念珠菌之間的平衡，念珠菌可侵入組織、血液并生長繁殖， 導致宿主的組織損害、器官功能障礙和炎癥反應等病理改變，此類感染為侵襲性念珠菌病 (invasivecandidiasis, 1C)，致病菌多為白念珠菌。
[0003] 烯醇化酶（enolase，又稱2-磷酸-D-甘油酸水解酶，它催化磷酸甘油向 磷酸烯醇式丙酮酸轉化，是糖酵解過程的限速酶。一直以來認為該酶是一個古老的、保守 的、功能單一的蛋白，然而隨著分子生物學對有免疫原性蛋白的研究日趨發(fā)展，發(fā)現該酶是 1C血清學檢測最重要的靶標分子，檢測人血清中抗白念珠菌烯醇化酶抗體（IgG型）并且以 克隆表達的重組蛋白作為包被原檢測病原體抗血清，采用以上技術用于診斷侵襲性念珠菌 病的ELISA方法已被報道，但這一方法存在操作復雜，技術門檻較高的缺點，使其推廣和應 用受到一定程度的限制。

【發(fā)明內容】
本發(fā)明所要解決的技術問題是克服已有技術之缺陷，提供一種白念珠菌烯醇化酶抗體 的檢測試紙，利用重組白念珠菌烯醇化酶蛋白作為抗原制備膠體金免疫層析試紙，用于檢 測抗稀醇化酶IgG抗體，能夠及時、明確地判斷待測樣品中是否含有抗白念珠菌稀醇化酶 抗體，并具有特異性、靈敏性高，操作簡單快捷的特點。 本發(fā)明所述技術問題是以下述技術方案實現的： 一種白念珠菌烯醇化酶抗體的檢測試紙，它包括依次相互搭接的樣品墊、金標墊、醋酸 纖維素膜和吸水墊，醋酸纖維素膜上設有測試帶和質控帶，所述金標墊包被有金標抗體，測 試帶包被有烯醇化酶重組抗原，質控帶包被有羊抗小鼠IgG抗體。
[0004] 上述白念珠菌烯醇化酶抗體的檢測試紙，所述金標抗體為在金溶液中加入小鼠抗 人IgG抗體，抗體的終濃度為8ug/ml，制成標金溶液；將標金溶液混合牛血清蛋白后以點膜 濃度l〇ul/cm噴涂金標墊。
[0005] 上述白念珠菌烯醇化酶抗體的檢測試紙，所述羊抗小鼠IgG抗體為在濃度為 0.Olmol/L的PB緩沖液中加入羊抗小鼠IgG抗體，抗體終濃度為1.Omg/ml。
[0006] 上述白念珠菌烯醇化酶抗體的檢測試紙，所述烯醇化酶重組抗原的制備包括步驟 如下： A、重組烯醇化酶蛋白：在白念珠菌烯醇化酶基因的核酸序列中設計引物，以PCR技術 擴增目的基因，擴增產物經純化后以內切酶進行雙酶切，得到重組基因轉入表達載體質粒 pET30a，將構建好的表達質粒pET30a-ei?〇l轉染感受態(tài)細胞，以誘導劑IPTG誘導重組蛋白 表達，經收集純化得到白念珠菌烯醇化酶重組蛋白； B、制備烯醇化酶蛋白：將步驟A制得的白念珠菌烯醇化酶重組蛋白在室溫融化后，經 12000r/min高速離心機離心lOmin，取上清液用0.Olmol/L的PB緩沖液稀釋，稀醇化酶蛋 白的終濃度為〇? 8~1. 0mg/ml。
[0007] 本發(fā)明采用膠體金免疫層析技術（goldimmunochromagraphyassay，GICA)用重 組的白念珠菌烯醇化酶制備免疫層析檢測試紙，可以檢測人血清樣品中是否存在抗烯醇化 酶IgG抗體，作為篩查和診斷侵襲性念珠菌的輔助指標。用膠體金層析試紙進行檢測，操作 簡單，診斷速度快，結果清晰易于判斷，可直接、定性地檢測待測樣品中的IgG抗體，無需復 雜的實驗技能和特殊設備，同時檢測試紙具有試劑穩(wěn)定、易于保存的特點。這種無創(chuàng)傷、簡 易的檢測手段可用于臨床侵襲性念珠菌高?；颊吆涂梢苫颊叩目焖僭\斷篩查，特別適于在 基層衛(wèi)生單位和野外條件使用。本發(fā)明具有如下突出優(yōu)點： 1、敏感性好，特異性較高，待測樣品如血清或血漿的用量只需i〇〇yL即可進行檢測。 利用膠體金層析試紙條對侵襲性念珠菌患者及健康人群的血清樣品進行實際檢測顯示， 在具有統計學意義的條件下，侵襲性念珠菌病患者的檢出率可達到65%以上，檢測特異性 95%以上。
[0008] 2、操作簡便快捷，檢測速度快，成本低，可由無專業(yè)背景人員直接進行操作，并可 在30分鐘內得出檢測結果。
[0009] 膠體金免疫層析試紙的測試效果依賴于烯醇化酶蛋白的工作濃度和金標墊的包 被濃度等參數，而且念珠菌為正常的人體寄生菌，健康個體未發(fā)生感染時血液中亦存在少 量的抗念珠菌烯醇化酶抗體，而發(fā)生感染時，該抗體滴度大幅度升高，因此確定烯醇化酶蛋 白的工作(包被）濃度是層析試紙測試效果的關鍵參數，過高的工作濃度可引起假陽性率增 高，從健康人血清中檢出烯醇化酶抗體；而工作濃度過低可能引起假陰性率增高，無法從念 珠菌感染患者血清中檢測出烯醇化酶抗體。本發(fā)明經過不斷試驗反復摸索得出上述關鍵參 數的濃度范圍，從而減少了產生假陽性信號和假陰性信號而造成誤判的可能性，提高了測 試的靈敏性和準確度。
【附圖說明】
[0010] 圖1是本發(fā)明膠體金試紙結構示意圖； 圖2是本發(fā)明白念珠菌烯醇化酶重組蛋白的SDS-PAGE凝膠電泳及WB驗證圖。
[0011] 圖中各標號清單為：1、吸水墊，2、硝酸纖維素膜，3、金標墊，4、樣品墊，5、樣品，6、 測試帶，7、質控帶。
【具體實施方式】
[0012] 下面結合附圖對本發(fā)明作進一步詳細說明。 本發(fā)明將重組白念珠菌烯醇化酶蛋白為抗原的膠體金免疫層析試紙用于檢測烯醇化 酶IgG抗體，制備的過程包括白念珠菌烯醇化酶重組蛋白的獲得和膠體金免疫層析試紙的 制備。其中烯醇化酶重組蛋白是通過構建原核表達質粒pET30a_mol、轉化并發(fā)酵培養(yǎng)、蛋 白純化而獲得的；將純化的蛋白以磷酸鹽緩沖液（PBS)充分透析，用Westernblot分析驗 證獲得的蛋白與1C小鼠血清發(fā)生強烈的免疫反應。在確定重組烯醇化酶蛋白工作濃度、羊 抗小鼠免疫球蛋白的包被濃度及金標墊的包被參數后，制備膠體金免疫層析試紙。
[0013] -、白念珠菌烯醇化酶重組蛋白的獲得 1. 1菌株和質粒 菌株：白念珠菌ATCCMYA-2876 (SC5314)，美國標準生物品收藏中心； 質粒：pET30a表達質粒，德國merckmillipore公司； 表達宿主菌：大腸埃希菌AcWiBL21 (DE3)，北京全式金生物公司。
[0014] 1.2引物設計 根據白念珠菌SC5314的烯醇化酶基因序列mol(GenBank登錄號：NW_139596)，利用PrimerPremier5. 0軟件設計特異性引物，并在引物中加入限制性內切酶酶切位點及若干 保護堿基。
[0015]引物Eno1F:CCGGATCCATGTCTTACGCCACTAAAATC(下劃線為內切酶BamHI酶切位 點）， 引物Enol_R:GCCTCGAGTTACAATTGAGAAGCCTTTTG(下劃線為內切酶XholI酶切位點）。
[0016] 合成的引物以適量滅菌去離子水溶解，濃度為20mmol/L，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0017] 1. 3白念珠菌SC5314的培養(yǎng)與基因組DNA提取 將凍存的白念珠菌SC5314經科馬嘉真菌鑒定培養(yǎng)基培養(yǎng)后，挑取單個綠色菌落于酵 母膏胨葡萄糖液體培養(yǎng)基（YH)培養(yǎng)基)擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度35°C，通入5%C02進行培 養(yǎng)12小時。 將擴大培養(yǎng)后的菌液離心，將菌體沉淀以山梨醇緩沖液重新懸浮(重懸)，在室溫下孵 育lOmin，離心去上清液。通過溶細胞酶處理后用真菌DNA提取試劑盒（OMEGA公司）提取 白念珠菌DNA。提取方法為：用470ML山梨醇緩沖液重懸沉淀，加入25ML真菌破壁酶(北 京Solarbio公司）和5MLb-巰基乙醇，30°C水浴4h，離心分別收集沉淀，用DNA提取試劑 盒提取DNA。用紫外分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳鑒定其純度。
[0018] 1. 4聚合酶鏈式反應（PCR)擴增基因 以提取的白念珠菌DNA為模板，進行PCR擴增(無細胞分子克隆，模擬天然DNA復制的過 程，在體外擴增特異性DNA片段)，得到白念珠菌烯醇化酶的全長基因。PCR反應體系為： 2XPCRmix 25 ML (為DNA聚合酶、dNTP及電泳時所需loadingbuffer的成分） 白念珠菌SC5314DNA 1ML 引物Enol_F(20mmol/L) 1. 5ML 引物Enol_R(2〇mmol/L) 1. 5ML 去離子水 21PL Total volume 50M-L 使用PCRmix反應體系的試劑盒為大連TaKaRa公司Prime-STAR籩MaxDNA polymerasePCRmix，反應參數為 95°C預變性 5min，95°C變性lmin，55°C退火lmin，72°C延 伸lmin，循環(huán)30次，最后72°C延伸10min，擴增產物于4°C保存?zhèn)溆茫⒂铆傊悄z電泳 觀察擴增產物（PCR產物）片段長度和純度。
[0019] 1. 5表達載體pET30a-e/?ol的構建和鑒定 對PCR產物進行回收純化后，用BamHI內切酶和XhoI內切酶（Fermentas公司）對 pET30a質粒和純化回收的PCR產物進行雙酶切，經瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(北京 天根公司）回收雙酶切產物，雙酶切產物用T4連接酶（Fermentas公司)連接，轉化感受態(tài)大 腸埃希菌AcWiBL21 (DE3)。以50Pg/mL卡那霉素LB平板篩選陽性克隆，經PCR與酶 切鑒定后測序。上述DNA的回收、酶切、連接反應、細胞轉化和陽性細胞克隆的篩選與鑒定 均參照《分子克隆實驗指南》中所述的條件或按照試劑盒制造廠商所建議的條件進行。
[0020] 1. 6Enol重組蛋白的誘導表達純化、鑒定 誘導：挑取鑒定后含重組質粒pET30a-ei?ol單個菌落，37°C活化過夜。轉移至50)^g/mL卡那霉素LB液體培養(yǎng)基中，35°C溫度下180rpm震蕩培養(yǎng)，待其A600=0. 4~0. 6時，在菌液 中加入的誘導劑0.lmol/LIPTG誘導培養(yǎng)5h，加入的誘導劑終濃度為0. 1mM/L。離心棄上 清液收集菌體。
[0021] 純化：為保證包被蛋白成分單一，降低非特異性結合，純化重組烯醇化酶蛋白。將 收集的菌體以1/