本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)生物類免疫檢測(cè)試劑領(lǐng)域，具體涉及一種快速診斷神經(jīng)元特異性烯醇化酶試劑盒及其使用方法。
背景技術(shù)：
：神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specificenolase，NSE)是一種肝糖分解酶，特異性存在于神經(jīng)元、周圍神經(jīng)組織和神經(jīng)內(nèi)分泌組織內(nèi)，其他臟器及腦脊液中的分布水平不及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的1％。當(dāng)神經(jīng)元或神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞發(fā)生缺血、缺氧、中毒或損傷時(shí)，細(xì)胞膜的完整性受到破壞，NSE從損傷的細(xì)胞內(nèi)“漏出”，最先進(jìn)入腦脊液中，通過(guò)破壞的血腦脊液屏障進(jìn)入血液循環(huán)，導(dǎo)致NSE在外周血和腦脊液中的濃度明顯升高，因此NSE是中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害的標(biāo)志物，通過(guò)檢測(cè)血清或腦脊液中NSE的變化，為證實(shí)顱腦損傷的發(fā)生、判斷顱腦損傷的程度、預(yù)測(cè)患者的預(yù)后提供了依據(jù)。此外，NSE在小細(xì)胞肺癌和神經(jīng)母細(xì)胞瘤等內(nèi)分泌腫瘤中顯示出很高的免疫活性，許多研究者相繼證明，NSE用于小細(xì)胞肺癌診斷，是一個(gè)具有高特異性和高靈敏性的腫瘤標(biāo)記物，其特異性高達(dá)80～90％，診斷靈敏度達(dá)80％；當(dāng)應(yīng)用NSE作神經(jīng)母細(xì)胞瘤鑒別診斷時(shí)，其陽(yáng)性率可達(dá)96～100％。因此，通過(guò)檢測(cè)血清中的NSE，對(duì)于小細(xì)胞肺癌和神經(jīng)母細(xì)胞瘤的檢測(cè)療效和預(yù)報(bào)復(fù)發(fā)均具有重要的參考價(jià)值。監(jiān)測(cè)患者血清中NSE含量的動(dòng)態(tài)變化還可作為預(yù)測(cè)癌細(xì)胞是否有腦轉(zhuǎn)移趨勢(shì)的一個(gè)重要指標(biāo)。因此，NSE是監(jiān)測(cè)神經(jīng)系統(tǒng)疾病和腫瘤的重要標(biāo)志物，提供一種能準(zhǔn)確、快速檢測(cè)NSE的方法滿足臨床診斷和科研的需要，具有重要意義。我國(guó)目前獲準(zhǔn)上市的NSE國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口檢測(cè)試劑盒約7個(gè)品種，檢測(cè)原理主要有酶聯(lián)免疫法(ELISA)、化學(xué)發(fā)光免疫法(CLIA)、電化學(xué)發(fā)光免疫法(ECLI)和時(shí)間分辨免疫熒光法(TRFIA)等。其中，傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫分析自動(dòng)化程度不高，操作過(guò)程繁瑣，受人為操作因素影響很大，不利于高通量的全自動(dòng)檢測(cè)，特異性和靈敏性有待提高，已逐漸被其他三種檢測(cè)手段取代。新興的化學(xué)發(fā)光免疫分析、電化學(xué)發(fā)光免疫分析和時(shí)間分辨免疫熒光分析具有靈敏度高、線性范圍寬、分析速度快、操作簡(jiǎn)便、容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的優(yōu)點(diǎn)，是理想的臨床微量生化檢驗(yàn)的分析手段。但目前，具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的國(guó)產(chǎn)NSE檢測(cè)試劑盒較少，且大部分均基于酶聯(lián)免疫分析而設(shè)計(jì)的，涉及上述三種新興檢測(cè)手段的試劑盒更為少見(jiàn)，均依靠國(guó)外進(jìn)口，價(jià)格昂貴，給患者帶來(lái)很大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，不利于基層普及?；诖耍瑖?guó)內(nèi)本領(lǐng)域的學(xué)者致力于NSE試劑盒的研發(fā)，如崔曉丙等人在“神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)時(shí)間分辨免疫熒光免疫分析試劑盒的臨床性能評(píng)價(jià)”(現(xiàn)代醫(yī)學(xué)儀器與應(yīng)用，2008,20(1),4-7)中披露采用自制的時(shí)間分辨免疫熒光免疫分析試劑盒檢測(cè)血清中的NSE，與進(jìn)口Roche電化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)比較，兩者測(cè)定值接近，相關(guān)系數(shù)為0.973，達(dá)到國(guó)外進(jìn)口的水平。又如賀安等人在“神經(jīng)元特異性烯醇化酶光激化學(xué)發(fā)光免疫分析法的建立”(現(xiàn)代免疫學(xué)，2011,31(1),44-47)中披露采用自制的光激化學(xué)發(fā)光免疫分析快速檢測(cè)試劑盒檢測(cè)血清中的NSE，與進(jìn)口Roche電化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)比較，兩者測(cè)定值接近，相關(guān)系數(shù)為0.979，達(dá)到國(guó)外進(jìn)口的水平。除了上述所述的幾種檢測(cè)手段外，國(guó)內(nèi)學(xué)者也嘗試將不同的技術(shù)手段結(jié)合，開(kāi)發(fā)出使用更為簡(jiǎn)便，具有更高檢測(cè)靈敏度和特異性地試劑盒，如公開(kāi)號(hào)為CN102914650B的中國(guó)專利申請(qǐng)“神經(jīng)元特異性烯醇化酶定量檢測(cè)試劑盒及其制備方法與應(yīng)用”以免疫磁珠微粒與化學(xué)發(fā)光技術(shù)相結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)樣本和試劑一次加入，大大簡(jiǎn)化了檢測(cè)程序，縮短檢測(cè)時(shí)間，并達(dá)到較佳的性能參數(shù)。又如公開(kāi)號(hào)為CN103175964B的中國(guó)專利申請(qǐng)“神經(jīng)元特異性烯醇化酶定量檢測(cè)試劑盒及其制備方法”以化學(xué)交聯(lián)法將NSE單克隆體和多克隆抗體復(fù)合包被粒徑為80-240nm的膠乳顆粒，保證檢測(cè)試劑盒具有高靈敏度及較寬的檢測(cè)線性范圍，且操作簡(jiǎn)便、快速、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好。電化學(xué)發(fā)光免疫法(ECLI)檢測(cè)是在化學(xué)發(fā)光和電化學(xué)基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的一種分析方法，其通過(guò)在電極上施加一定電壓以引發(fā)電化學(xué)反應(yīng)，電化學(xué)反應(yīng)釋放的能量再激發(fā)發(fā)光體，當(dāng)激發(fā)態(tài)發(fā)光體返回基態(tài)時(shí)便產(chǎn)生光發(fā)射，從而可以根據(jù)光發(fā)射強(qiáng)度來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)物的分析。目前基于電化學(xué)發(fā)光免疫分析原理的檢測(cè)儀器已成功商品化，如羅氏診斷公司(RocheDiagnostics)的Roche型電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及其配套試劑盒，采用釕聯(lián)吡啶衍生物作為標(biāo)記探針，磁珠為反應(yīng)載體，并結(jié)合自動(dòng)化的試劑傳輸系統(tǒng)，可快速檢測(cè)多種疾病標(biāo)志物。但基于電化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)用于檢測(cè)NSE的國(guó)產(chǎn)試劑盒的研究相對(duì)較少，不能滿足國(guó)內(nèi)需求。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種快速診斷神經(jīng)元特異性烯醇化酶試劑盒，采用該試劑盒進(jìn)行NSE檢測(cè)具有較高的靈敏度和特異性，且操作簡(jiǎn)單，操作流程短。本發(fā)明另外一個(gè)目的在于提供一種所述快速診斷神經(jīng)元特異性烯醇化酶試劑盒的使用方法。本發(fā)明的上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：本發(fā)明提供了一種快速診斷神經(jīng)元特異性烯醇化酶試劑盒，其包含神經(jīng)元特異性烯醇化酶標(biāo)準(zhǔn)品、反應(yīng)緩沖液、清洗液、脂質(zhì)體復(fù)合物、磁性分離試劑。所述的脂質(zhì)體復(fù)合物為內(nèi)部包裹有聯(lián)吡啶釕Ru(bpy)32+和納米金粒子復(fù)合物，表面包被有抗神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體，所述的納米金粒子為粒徑在2～50nm的類球形納米金。所述的磁性分離試劑由生物素化合的抗神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體和鏈霉親和素包被的磁性微粒制備而成。本發(fā)明提供的試劑盒為夾心法電化學(xué)發(fā)光免疫分析法與磁性微粒分離技術(shù)相結(jié)合的一種檢測(cè)方法，基本原理為：利用脂質(zhì)體將發(fā)光物質(zhì)(Ru(bpy)32+和納米金粒子復(fù)合物)進(jìn)行包裹，并進(jìn)行脂質(zhì)體表面抗體化結(jié)合，制備脂質(zhì)體復(fù)合物；利用生物素與鏈霉親和素的相互作用，將生物素化的抗體與鏈霉親和素包被的磁性微粒進(jìn)行絡(luò)和，制備磁性分離試劑；將脂質(zhì)體復(fù)合物、待測(cè)物質(zhì)(抗原)、磁性分離試劑混合，在室溫下充分反應(yīng)，形成磁性微粒-抗原-脂質(zhì)體復(fù)合物的“三明治”結(jié)構(gòu)，在外磁場(chǎng)的作用下，磁性微粒-抗原-脂質(zhì)體復(fù)合物吸附于電極表面，加入反應(yīng)緩沖液，使脂質(zhì)體復(fù)合物釋放出發(fā)光物質(zhì)，所述的發(fā)光物質(zhì)再次吸附于電極表面，開(kāi)啟電壓后，發(fā)光底物及反應(yīng)參與物在電極表面失去電子而被氧化。電子供體失去一個(gè)H+而成為強(qiáng)還原劑，將發(fā)光底物還原為激發(fā)態(tài)，隨即釋放光子而恢復(fù)為基態(tài)的發(fā)光底物。這一過(guò)程在電極表面周而復(fù)始地進(jìn)行，不斷地發(fā)出光子而常保持底物濃度的恒定。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的快速診斷神經(jīng)元特異性烯醇化酶試劑盒中，所述的脂質(zhì)體復(fù)合物的制備包括以下步驟：(1)按質(zhì)量比為(4～10):1的比例分別取Ru(bpy)32+和納米金粒子，利用靜電吸附作用，將帶正電荷的Ru(bpy)32+吸附于帶負(fù)電荷的納米金粒子上，制得Ru(bpy)32+和納米金粒子復(fù)合物；(2)將Ru(bpy)32+和納米金粒子復(fù)合物溶于Tris緩沖溶液中，制成質(zhì)量濃度為2％的溶液，所述的Tris-HCl緩沖溶液含有10mM三羥甲基氨基甲烷和15mM氯化鈉，pH為7.2；(3)取二硬脂酰磷脂酰膽堿、膽固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，混合，溶于5mL的氯仿中，超聲處理5min，然后在28℃，0.1MPa的條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去氯仿，靜置30min，然后加入1mLRu(bpy)32+和納米金粒子復(fù)合物溶液，在60℃水浴中振蕩反應(yīng)約1h，得脂質(zhì)體懸浮液，將脂質(zhì)體懸浮液超聲處理3min，然后使用注射器式濾器調(diào)整脂質(zhì)體的粒徑至90～100nm，得到內(nèi)部包裹有Ru(bpy)32+和納米金粒子復(fù)合物的脂質(zhì)體；(4)取1mL內(nèi)部包裹有Ru(bpy)32+和納米金粒子復(fù)合物的脂質(zhì)體與1mL質(zhì)量濃度為2％的1,5-戊二醛溶液混合，室溫下反應(yīng)2h，然后用10mMpH7.2的PBS溶液進(jìn)行透析12～24h，以除去多余的1,5-戊二醛，然后在4℃下，加入抗神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體，所述抗體在體系中的終濃度為10μg/mL，孵育12h，加入2％(w/v)BSA，繼續(xù)孵育12h，以阻斷脂質(zhì)體表面上的非特異性位點(diǎn)，將得到的脂質(zhì)體復(fù)合物置于4℃保存，即得。其中，所述步驟(3)中二硬脂酰磷脂酰膽堿、膽固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的摩爾比為20:10:4。本發(fā)明通過(guò)大量的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，使用脂質(zhì)體包裹發(fā)光物質(zhì)Ru(bpy)32+體系的穩(wěn)定性好，但檢測(cè)靈敏度有待提高，通過(guò)大量的試驗(yàn)最終確定，將發(fā)光物質(zhì)Ru(bpy)32+吸附于粒徑為2～50nm的納米金粒子上，形成Ru(bpy)32+和納米金粒子復(fù)合物，可顯著增強(qiáng)發(fā)光強(qiáng)度，提高檢測(cè)靈敏度。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的快速診斷神經(jīng)元特異性烯醇化酶試劑盒中，所述的生物素化合的抗神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體的制備包括以下步驟：取抗神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體溶于pH為7.2的PBS緩沖液中，制成濃度為1.0～2.0mg/mL的溶液；另取EZ-LinkSulfo-NHS-LC-biotin溶于pH為7.2的PBS緩沖液中，制成濃度為10～50mM的溶液；然后取1mL濃度為1.0～2.0mg/mL的抗神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體溶液與25μL的濃度為10～50mM的EZ-LinkSulfo-NHS-LC-biotin溶液混合，置于室溫中反應(yīng)1～2h，再使用PD-10的凝膠過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾，即得生物素化合的抗神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的快速診斷神經(jīng)元特異性烯醇化酶試劑盒中，所述的鏈霉親和素包被的磁性微粒的制備包括以下步驟：取0.5mg金磁微粒，磁性分離棄上清，加入150～200μg鏈霉親和素，加入0.1mol/LpH為7.4的Tris-HCl緩沖液0.5mL，置振蕩器中室溫條件下反應(yīng)1～2h，去上清，用含1mmol/LEDTA且濃度為0.1mol/L、pH為7.4的Tris-HCl清洗液反復(fù)清洗，制得鏈霉親和素包被的磁性微粒。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的快速診斷神經(jīng)元特異性烯醇化酶試劑盒中，所述的磁性分離試劑的制備包括以下步驟：取1mL生物素化合的抗神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體與200μg的鏈霉親和素包被的磁性微粒混合，在室溫條件下，100r/min反應(yīng)1～2h，反應(yīng)結(jié)束后，磁性分離，去上清，加入pH為7.4的Tris-HCl緩沖液反復(fù)洗滌多次，然后加入1mL濃度為0.2～0.4mM的D-生物素水溶液，室溫下反應(yīng)30min，以充分阻斷未與生物素化合的抗神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體結(jié)合的鏈霉親和素位點(diǎn)，反應(yīng)結(jié)束后，磁性分離，去上清，用pH為7.4的Tris-HCl緩沖液反復(fù)洗滌多次以除去多余的D-生物素，加入含2％(w/v)BSA、0.1％(v/v)吐溫-20、pH為7.2的PBS溶液復(fù)溶，即得磁性分離試劑。本發(fā)明將鏈霉親和素包被的磁性微粒，并用生物素標(biāo)記捕獲抗體，利用生物素和鏈霉親和素的相互作用，將生物素標(biāo)記抗體和鏈霉親和素包被的磁性微粒免疫結(jié)合，延長(zhǎng)抗體在磁性微粒上的臂展和正確定向，整體上提高了試劑盒的靈敏度，制得的磁性分離試劑穩(wěn)定性良好，保存有效期延長(zhǎng)。進(jìn)一步地，本發(fā)明所述的反應(yīng)緩沖液的組成為：0.1mol/L三丙胺、0.1mol/L磷酸二氫鉀、0.1mol/L氯化鈉、0.1％(v/v)吐溫-20、1％(v/v)TritonX-100，pH為7.0～7.2。所述的清洗液為含0.1％(v/v)吐溫-20、0.1mol/L氯化鈉，且濃度為0.05mol/L、pH為7.2的磷酸鹽緩沖溶液。上述的反應(yīng)緩沖液中磷酸二氫鉀主要起緩沖作用，維持反應(yīng)體系的pH值，添加吐溫-20和TritonX-100可增強(qiáng)發(fā)光作用，提高發(fā)光效率，減少三丙胺的用量，提高試劑盒的使用安全性。本發(fā)明還提供了神經(jīng)元特異性烯醇化酶系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，所述的神經(jīng)元特異性烯醇化酶標(biāo)準(zhǔn)品的制備包括以下步驟：使用含0.1mol/L磷酸二氫鉀、0.1mol/L氯化鈉、2％(w/v)BSA、0.1％(v/v)吐溫-20的溶液將神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗原配制成濃度分別為5，25，75，150，300，600ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)液，即得。作為優(yōu)選，本發(fā)明試劑盒還可進(jìn)一步包含質(zhì)控品，所述質(zhì)控品的配制同標(biāo)準(zhǔn)品，所述質(zhì)控品中神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗原的濃度分別為75ng/ml和300ng/ml。進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了一種所述的神經(jīng)元特異性烯醇化酶試劑盒的使用方法，其包括以下步驟：(1)使用含2％(w/v)BSA的PBS緩沖液將脂質(zhì)體復(fù)合物按1:5的比例進(jìn)行稀釋；(2)取25μL稀釋后的脂質(zhì)體復(fù)合物、25μL磁性分離試劑、50μL待測(cè)樣本或神經(jīng)元特異性烯醇化酶標(biāo)準(zhǔn)品，混合，在室溫條件下渦旋1h，充分反應(yīng)，形成磁性微粒-抗原-脂質(zhì)體復(fù)合物，將反應(yīng)液吸入電化學(xué)反應(yīng)池中，所述的磁性微粒-抗原-脂質(zhì)體復(fù)合物通過(guò)磁性吸附于電極表面，加入100μL清洗液輕輕潤(rùn)洗電極表面3次，去清洗液，然后加入500μL反應(yīng)緩沖液，使脂質(zhì)體內(nèi)聯(lián)吡啶釕Ru(bpy)32+和納米金粒子復(fù)合物溶出，溶出的聯(lián)吡啶釕Ru(bpy)32+和納米金粒子復(fù)合物通過(guò)磁性再次吸附于電極表面，電化學(xué)工作站通電，啟動(dòng)ECL反應(yīng)，通過(guò)光電倍增管收集電化學(xué)發(fā)光信號(hào)；(3)測(cè)定梯度濃度的神經(jīng)元特異性烯醇化酶標(biāo)準(zhǔn)液的發(fā)光強(qiáng)度變化值，根據(jù)發(fā)光強(qiáng)度變化值對(duì)數(shù)與相應(yīng)的濃度對(duì)數(shù)繪制反應(yīng)曲線，計(jì)算待測(cè)標(biāo)本中神經(jīng)元特異性烯醇化酶的濃度。本發(fā)明試劑盒中提及的各種緩沖溶液，除另有注明外，均為市售產(chǎn)品，未提及的試劑盒的外包裝以及各試劑組分的獨(dú)立包裝容器等均可以按照所屬領(lǐng)域的常規(guī)操作進(jìn)行，符合相關(guān)行業(yè)規(guī)定即可。本發(fā)明的方法中未詳細(xì)提及的操作步驟也可參照所屬領(lǐng)域的常規(guī)操作進(jìn)行，所用檢測(cè)儀器設(shè)備，如電化學(xué)分析儀的使用按說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于：(1)與常規(guī)的電化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)方法比較，本發(fā)明以?shī)A心法電化學(xué)發(fā)光免疫分析法與磁性微粒分離技術(shù)相結(jié)合，形成磁性微粒-抗原(待測(cè)物)-脂質(zhì)體復(fù)合物的“三明治”結(jié)構(gòu)，大大提高了檢測(cè)的特異性和靈敏度，降低變異系數(shù)，與干擾物質(zhì)交叉反應(yīng)小，具有較寬的檢測(cè)線性范圍，檢測(cè)結(jié)果可靠。(2)分別采用本發(fā)明提供的試劑盒與Roche型電化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒對(duì)經(jīng)元特異性烯醇化酶進(jìn)行檢測(cè)，兩者測(cè)定值接近，相關(guān)系數(shù)為0.984，達(dá)到國(guó)外進(jìn)口的水平，但成本遠(yuǎn)低于進(jìn)口試劑，適合大規(guī)模推廣和應(yīng)用。(3)本發(fā)明將發(fā)光物質(zhì)聯(lián)吡啶釕Ru(bpy)32+和納米金粒子進(jìn)行復(fù)合，顯著增強(qiáng)發(fā)光強(qiáng)度，提高檢測(cè)靈敏度，并將形成的復(fù)合物包裹于脂質(zhì)體內(nèi)部，顯著提高檢測(cè)的穩(wěn)定性。(4)采用本發(fā)明提供的試劑盒對(duì)神經(jīng)元特異性烯醇化酶進(jìn)行檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)少，大大提高檢測(cè)的效率。(5)本發(fā)明提供的試劑盒中各試劑穩(wěn)定性好，儲(chǔ)存時(shí)間較長(zhǎng)，且毒性低，對(duì)操作人員的健康影響小。具體實(shí)施方式以下通過(guò)具體實(shí)施方式進(jìn)一步描述本發(fā)明，但本發(fā)明不僅僅限于以下實(shí)施例。實(shí)施例1本發(fā)明檢測(cè)試劑盒的組成與制備本發(fā)明所述的試劑盒包括以下組分：試劑a：神經(jīng)元特異性烯醇化酶標(biāo)準(zhǔn)品試劑b：反應(yīng)緩沖液試劑c：脂質(zhì)體復(fù)合物試劑d：磁性分離試劑試劑e：清洗液作為優(yōu)選，本發(fā)明試劑盒還可進(jìn)一步包含質(zhì)控品，所述質(zhì)控品的配制同標(biāo)準(zhǔn)品。所述的脂質(zhì)體復(fù)合物為內(nèi)部包裹有聯(lián)吡啶釕Ru(bpy)32+和納米金粒子復(fù)合物，表面包被有抗神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體，其中，所述的納米金粒子為粒徑在2～50nm的類球形納米金。所述的磁性分離試劑由生物素化合的抗神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體和鏈霉親和素包被的磁性微粒制備而成。本發(fā)明試劑盒中各試劑的制備包括以下步驟：(1)神經(jīng)元特異性烯醇化酶標(biāo)準(zhǔn)品制備原料廠家磷酸二氫鉀深圳卓越生物科技有限公司氯化鈉深圳卓越生物科技有限公司BSASigma-Aldrich西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司吐溫-20上海麥克林生化科技有限公司神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗原天健生物制藥(天津)有限公司制備方法：使用含0.1mol/L磷酸二氫鉀、0.1mol/L氯化鈉、2％(w/v)BSA、0.1％(v/v)吐溫-20的溶液將神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗原配制成濃度分別為5，25，75，150，300，600ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)液，即得。(2)反應(yīng)緩沖液原料廠家三丙胺Sigma-Aldrich西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司TritonX-100Sigma-Aldrich西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司其他試劑的來(lái)源見(jiàn)上表。制備方法：以配制100ml反應(yīng)緩沖液為例：取1.43g三丙胺、1.36g磷酸二氫鉀、0.58g氯化鈉溶于100ml水中，加入0.1ml吐溫-20、1mlTritonX-100，攪拌均勻，調(diào)節(jié)pH為7.2，即得反應(yīng)緩沖液。(3)清洗液原料廠家磷酸二氫鈉深圳卓越生物科技有限公司磷酸氫二鈉深圳卓越生物科技有限公司其他試劑的來(lái)源見(jiàn)上表。制備方法：以配制100ml清洗液為例：①取0.599g磷酸二氫鈉溶于100ml水中，制成濃度為0.05mol/L的磷酸二氫鈉溶液，另取0.710g磷酸氫二鈉溶于100ml水中，制成濃度為0.05mol/L的磷酸氫二鈉溶液，分別取0.05mol/L的磷酸二氫鈉溶液28ml，0.05mol/L的磷酸氫二鈉溶液72ml，混合，制得濃度為0.05mol/L、pH為7.2的磷酸鹽緩沖溶液。②取0.58g氯化鈉、0.1ml吐溫-20，加入100ml濃度為0.05mol/L、pH為7.2的磷酸鹽緩沖溶液，攪拌均勻即得。(4)脂質(zhì)體復(fù)合物原料廠家聯(lián)吡啶釕上海譜振生物科技有限公司納米金膠體南京先豐納米材料科技有限公司二硬脂酰磷脂酰膽堿Avantipolarlipids,lnc膽固醇Avantipolarlipids,lnc二硬脂酰磷脂酰乙醇胺Avantipolarlipids,lnc神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體上海谷研科技有限公司Tris-HCl緩沖溶液南京森貝伽生物科技有限公司1,5-戊二醛上海阿拉丁生化科技股份有限公司制備方法：①按質(zhì)量比為6:1的比例分別取Ru(bpy)32+和納米金粒子，利用靜電吸附作用，將帶正電荷的Ru(bpy)32+吸附于帶負(fù)電荷的納米金粒子上，制得Ru(bpy)32+和納米金粒子復(fù)合物；②將Ru(bpy)32+和納米金粒子復(fù)合物溶于Tris緩沖溶液中，制成質(zhì)量濃度為2％的溶液，所述的Tris緩沖溶液含有10mM三羥甲基氨基甲烷和15mM氯化鈉，pH為7.2；③按摩爾比為20:10:4分別稱取二硬脂酰磷脂酰膽堿、膽固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，混合，溶于5mL的氯仿中，超聲處理5min，然后在28℃，0.1MPa的條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去氯仿，靜置30min，然后加入1mLRu(bpy)32+和納米金粒子復(fù)合物溶液，在60℃水浴中振蕩反應(yīng)約1h，得脂質(zhì)體懸浮液，將脂質(zhì)體懸浮液超聲處理3min，然后使用注射器式濾器調(diào)整脂質(zhì)體的粒徑至90nm，得到內(nèi)部包裹有Ru(bpy)32+和納米金粒子復(fù)合物的脂質(zhì)體；④取1mL內(nèi)部包裹有Ru(bpy)32+和納米金粒子復(fù)合物的脂質(zhì)體與1mL質(zhì)量濃度為2％的1,5-戊二醛溶液混合，室溫下反應(yīng)2h，然后用10mMpH7.2的PBS溶液進(jìn)行透析12h，以除去多余的1,5-戊二醛，然后在4℃下，加入抗神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體，所述抗體在體系中的終濃度為10μg/mL，孵育12h，加入2％(w/v)BSA，繼續(xù)孵育12h，以阻斷脂質(zhì)體表面上的非特異性位點(diǎn)，將得到的脂質(zhì)體復(fù)合物置于4℃保存，即得。(5)磁性分離試劑原料廠家PBS緩沖液南京森貝伽生物科技有限公司EZ-LinkSulfo-NHS-LC-biotin皮爾斯生物技術(shù)有限公司金磁微粒西安金磁納米生物技術(shù)有限公司鏈霉親和素德國(guó)默克公司D-生物素皮爾斯生物技術(shù)有限公司制備方法：①生物素化合的抗神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體的制備：取抗神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體溶于pH為7.2的PBS緩沖液中，制成濃度為1.0mg/mL的溶液；另取EZ-LinkSulfo-NHS-LC-biotin溶于pH為7.2的PBS緩沖液中，制成濃度為10mM的溶液；然后取1mL濃度為1.0mg/mL的抗神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體溶液與25μL的濃度為10mM的EZ-LinkSulfo-NHS-LC-biotin溶液混合，置于室溫中反應(yīng)2h，再使用PD-10的凝膠過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾，即得生物素化合的抗神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體。②鏈霉親和素包被的磁性微粒的制備：取0.5mg金磁微粒，磁性分離棄上清，加入150μg鏈霉親和素，加入0.1mol/LpH為7.4的Tris-HCl緩沖液0.5mL，置振蕩器中室溫條件下反應(yīng)2h，去上清，用含1mmol/LEDTA且濃度為0.1mol/L、pH為7.4的Tris-HCl清洗液反復(fù)清洗，制得鏈霉親和素包被的磁性微粒。③磁性分離試劑的制備：取1mL生物素化合的抗神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體與200μg的鏈霉親和素包被的磁性微?；旌?，在室溫條件下，100r/min反應(yīng)2h，反應(yīng)結(jié)束后，磁性分離，去上清，加入pH為7.4的Tris-HCl緩沖液反復(fù)洗滌多次，然后加入1mL濃度為0.2mM的D-生物素水溶液，室溫下反應(yīng)30min，以充分阻斷未與生物素化合的抗神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體結(jié)合的鏈霉親和素位點(diǎn)，反應(yīng)結(jié)束后，磁性分離，去上清，用pH為7.4的Tris-HCl緩沖液反復(fù)洗滌多次以除去多余的D-生物素，加入含2％(w/v)BSA、0.1％(v/v)吐溫-20、pH為7.2的PBS溶液復(fù)溶，即得磁性分離試劑。實(shí)施例2采用本發(fā)明檢測(cè)試劑盒進(jìn)行神經(jīng)元特異性烯醇化酶檢測(cè)(1)待測(cè)樣本的準(zhǔn)備：樣本的采集參照常規(guī)操作，具體為將采集的靜脈血加入至試管或肝素抗凝管中，離心，取上清部分進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；(2)使用含2％(w/v)BSA的PBS緩沖液將脂質(zhì)體復(fù)合物按1:5的比例進(jìn)行稀釋；(3)取25μL稀釋后的脂質(zhì)體復(fù)合物、25μL磁性分離試劑、50μL待測(cè)樣本或神經(jīng)元特異性烯醇化酶標(biāo)準(zhǔn)品，混合，在室溫條件下渦旋1h，充分反應(yīng)，形成磁性微粒-抗原-脂質(zhì)體復(fù)合物，將反應(yīng)液吸入電化學(xué)反應(yīng)池中，所述的磁性微粒-抗原-脂質(zhì)體復(fù)合物通過(guò)工作電極下面的磁鐵吸附于電極表面，加入100μL清洗液輕輕潤(rùn)洗電極表面3次，去清洗液，然后加入500μL反應(yīng)緩沖液，使脂質(zhì)體內(nèi)聯(lián)吡啶釕Ru(bpy)32+和納米金粒子復(fù)合物溶出，溶出的聯(lián)吡啶釕Ru(bpy)32+和納米金粒子復(fù)合物通過(guò)磁性再次吸附于電極表面，電化學(xué)工作站通電，啟動(dòng)ECL反應(yīng)，通過(guò)光電倍增管收集電化學(xué)發(fā)光信號(hào)；(4)測(cè)定梯度濃度的神經(jīng)元特異性烯醇化酶標(biāo)準(zhǔn)液的發(fā)光強(qiáng)度變化值，根據(jù)發(fā)光強(qiáng)度變化值對(duì)數(shù)與相應(yīng)的濃度對(duì)數(shù)繪制反應(yīng)曲線，計(jì)算待測(cè)標(biāo)本中神經(jīng)元特異性烯醇化酶的濃度。對(duì)比例1檢測(cè)試劑盒的組成與制備對(duì)比例1檢測(cè)試劑盒的組成和制備與實(shí)施例1檢測(cè)試劑盒的組成和制備基本相同，區(qū)別在于，所述的脂質(zhì)體復(fù)合物為內(nèi)部不含粒徑在2～50nm的類球形納米金，僅包裹有聯(lián)吡啶釕Ru(bpy)32+，表面包被有抗神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體。實(shí)施例3本發(fā)明檢測(cè)試劑盒的方法學(xué)檢定按照本領(lǐng)域中常規(guī)的制造和檢定規(guī)程對(duì)實(shí)施例1制得的檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢定，結(jié)果如下：①線性關(guān)系以自制試劑盒中參考標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，信號(hào)值計(jì)數(shù)的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，由雙對(duì)數(shù)數(shù)學(xué)模型Log-Log函數(shù)處理，測(cè)得NSE試劑盒劑量-反應(yīng)曲線線性相關(guān)系數(shù)為r＝0.9983，表明自制試劑盒在濃度為5-600ng/ml的范圍內(nèi)具有良好的劑量反應(yīng)線性關(guān)系。②最低檢出限重復(fù)測(cè)定零校準(zhǔn)品(或樣本稀釋液)不少于10次，計(jì)算出反應(yīng)量的均值(x)和標(biāo)準(zhǔn)差(s)，將(x+2s)的反應(yīng)量代入劑量-反應(yīng)曲線，計(jì)算出相應(yīng)濃度值，即為最低檢出限，所得自制試劑盒的最低檢出限為0.01ng/ml。③精密度以自制試劑盒中3個(gè)不同濃度的參考標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)定(高、中、低濃度分別為25ng/ml、150ng/ml、600ng/ml)，各設(shè)10個(gè)復(fù)孔。分別對(duì)同一批次和不同批次的自制試劑盒中3個(gè)不同濃度的參考標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行重復(fù)測(cè)定10次。結(jié)果自制試劑盒的批內(nèi)變異系數(shù)(CV％)為1.4～2.8％，批間變異系數(shù)(CV％)為3.2～5.7％，符合試劑盒檢定規(guī)程要求，精密度良好。④特異性以人非神經(jīng)元烯醇化酶(NNE)1000ng/ml和脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2(Lp-PLA2)500ng/ml作為待測(cè)樣品，用自制的NSE試劑盒測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果分別為0.18ng/ml、0.06ng/ml，無(wú)明顯的交叉反應(yīng)，表明自制的試劑盒對(duì)檢測(cè)NSE特異性高。⑤穩(wěn)定性將自制的檢測(cè)試劑盒置于37℃分別熱處理0天、3天、5天和7天，在不同的處理時(shí)間之后分別測(cè)定NSE校準(zhǔn)品，各時(shí)間點(diǎn)的試劑盒信號(hào)值變化不大，線性關(guān)系良好，表明本發(fā)明檢測(cè)試劑盒具有良好的熱穩(wěn)定性。實(shí)施例4本發(fā)明檢測(cè)試劑盒與進(jìn)口Roche型電化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒測(cè)定結(jié)果比較分別采用本發(fā)明自制的試劑盒和羅氏診斷公司(RocheDiagnostics)的Roche型電化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒同時(shí)對(duì)30份樣本進(jìn)行檢測(cè)。用自制試劑盒檢測(cè)血清中的NSE的分析靈敏度、精密度、穩(wěn)定性和線性范圍的結(jié)果，與國(guó)外Roche型電化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒比較均無(wú)明顯差異，結(jié)果見(jiàn)下表。并以自制試劑盒測(cè)定的結(jié)果為橫坐標(biāo)，Roche試劑盒測(cè)定的結(jié)果為縱坐標(biāo)做回歸分析，相關(guān)方程為：Y＝0.836X+0.492，相關(guān)系數(shù)r＝0.984。結(jié)果表明本發(fā)明自制試劑盒測(cè)定結(jié)果與Roche試劑盒測(cè)定結(jié)果具有高度相關(guān)性，兩者的最低檢測(cè)限相當(dāng)，但本發(fā)明自制試劑盒的線性范圍較寬，且批間、批內(nèi)精密度較優(yōu)。實(shí)施例5對(duì)比例1試劑盒和本發(fā)明實(shí)施例1制得的試劑盒對(duì)神經(jīng)元特異性烯醇化酶進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果比較對(duì)比例1試劑盒的使用方法參考實(shí)施例2具體的步驟。分別采用對(duì)比例1試劑盒和實(shí)施例1試劑盒同時(shí)對(duì)肺癌患者血清樣本40份(NSE陽(yáng)性率為100％)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)下表。結(jié)果表明，對(duì)比例1制得的試劑盒對(duì)血清中NSE檢測(cè)的靈敏度降低，檢測(cè)的線性范圍縮窄，批內(nèi)和批間精密度降低，將發(fā)光物質(zhì)Ru(bpy)32+吸附于粒徑為2～50nm的納米金粒子上，形成Ru(bpy)32+和納米金粒子復(fù)合物，可顯著提高檢測(cè)靈敏度和檢測(cè)精密度，使檢測(cè)具有較寬的線性范圍。以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出的是，上述優(yōu)選實(shí)施方式不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明的限制，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)當(dāng)以權(quán)利要求所限定的范圍為準(zhǔn)。對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3