本發(fā)明涉及一種具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架及其制備方法，屬于骨組織工程支架制備領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

骨損傷疾病是在臨床醫(yī)學(xué)中較為普遍的損傷。隨著組織工程學(xué)的發(fā)展，改善了傳統(tǒng)骨修復(fù)手段所存在的弊端。其中，支架材料在骨組織工程領(lǐng)域中具有相對重要的地位，利用三維支架為細胞的生長、繁殖和骨骼組織的修復(fù)提供了良好的根本和條件。單純的一種物質(zhì)并沒有辦法滿足組織工程對支架材料的需求，因此就需要將具有多元特性的不同材料進行復(fù)合，通過將這些材料的特性進行相互混合形成全新的、能夠滿足實際應(yīng)用的復(fù)合材料，這也是當前支架材料研究中的熱點。

隨著組織工程領(lǐng)域的飛速發(fā)展，羥基磷灰石是現(xiàn)如今被認為最具潛力和有醫(yī)學(xué)應(yīng)用可能性的骨組織代替材料，但由于缺乏抗疲勞性能與生物活性不足等因素，應(yīng)用有一定的限制。

絲素是一種源于蠶絲的天然高分子材料，隨著對其獨特氨基酸組成及結(jié)晶結(jié)構(gòu)等理化特性研究的深入，尤其是近年來蠶絲多用途開發(fā)向高新技術(shù)的滲透，國內(nèi)外對絲素的應(yīng)用正從傳統(tǒng)的紡織領(lǐng)域積極向化妝品、食品等領(lǐng)域擴展，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的探索，如利用絲素蛋白來制造藥物緩釋劑、生物傳感器、隱形眼鏡及皮膚、血管等人工器官等，受到廣泛關(guān)注，已取得了一系列的基礎(chǔ)研究成果，顯示了巨大的應(yīng)用潛力，可是未見有將其用于骨支架的報道。

將絲素蛋白與羥基磷灰石機械混合形成的復(fù)合支架已有報道，但所用的絲素蛋白與羥基磷灰石機械混合形成的復(fù)合材料是通過粒濾、發(fā)泡、冷凍干燥等方法制備而成，該復(fù)合材料存在結(jié)構(gòu)單一，孔徑不均等技術(shù)問題，因此用該復(fù)合材料制備復(fù)合支架存在很大問題，包括支架形狀結(jié)構(gòu)難以控制、支架孔隙連通率低、造孔材料難以清除等。

而本發(fā)明首先由原位礦化過程在絲素蛋白分子上沉積羥基磷灰石獲得有機無機復(fù)合的均一粉體材料，接著利用三維打印技術(shù)有效成型該復(fù)合的均一粉體形成具有可定制形狀結(jié)構(gòu)的支架，從而滿足骨組織工程支架的要求。

綜上，三維打印技術(shù)可以通過改變切層的網(wǎng)格填充方式和孔隙大小來調(diào)節(jié)支架材料的孔隙率和孔結(jié)構(gòu)，制備出具有高孔隙率、較好的孔連通性，可控的力學(xué)性能的骨修復(fù)復(fù)合材料支架，從而有利于成骨誘導(dǎo)、分化，細胞黏附、遷移、增殖，創(chuàng)建適應(yīng)成骨相關(guān)細胞生長需要的微環(huán)境。

因此，與現(xiàn)有技術(shù)的同類產(chǎn)品進行對比，本發(fā)明利用的三維打印技術(shù)能夠更好的滿足骨組織工程支架“一結(jié)構(gòu)，一支架”的要求。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是為了解決上述絲素蛋白與羥基磷灰石機械混合形成的復(fù)合材料存在的結(jié)構(gòu)單一，孔徑不均等技術(shù)問題，首先提供一種絲素蛋白/羥基磷灰石白色復(fù)合粉體，該絲素蛋白/羥基磷灰石白色復(fù)合粉體具有粒徑均一等特點。

本發(fā)明的目的之二是為了解決傳統(tǒng)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架形狀結(jié)構(gòu)難以控制、支架孔隙連通率低、造孔材料難以清除等技術(shù)問題，而利用上述的絲素蛋白/羥基磷灰石白色復(fù)合粉體制備一種具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架，該具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架，由于利用三維打印技術(shù)，有效地控制最終所得的復(fù)合支架的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，得到具有高孔隙率、較好的孔連通性，可控的力學(xué)性能的骨修復(fù)復(fù)合材料支架，即最終所得的復(fù)合支架具有孔徑可調(diào)，形貌可控，“一結(jié)構(gòu)，一支架”的優(yōu)點，從而提高復(fù)合支架的生物學(xué)性能，從而有利于成骨誘導(dǎo)、分化，細胞黏附、遷移、增殖?？朔爽F(xiàn)有技術(shù)中存在的結(jié)構(gòu)問題。

本發(fā)明的技術(shù)方案

一種絲素蛋白/羥基磷灰石白色復(fù)合粉體，通過包括如下步驟的方法制備而成：

（1）、蠶繭去除蠶蛹，清理蠶繭表面雜物

將蠶繭浸入濃度為0.5g/l的na2co3水溶液中，100℃水煮60min進行脫膠，取出脫膠后所得的蠶絲，用去離子水洗滌3次，然后60℃真空干燥，得到蠶絲，室溫下干燥保存?zhèn)溆茫?/p>

蠶繭和濃度為0.5g/l的na2co3水溶液的用量，按蠶繭：濃度為0.5g/l的na2co3水溶液為4.3g：500ml的比例計算；

（2）、蠶絲溶液的制備

首先，將cacl2、ch3ch2oh和去離子水按摩爾比計算，即cacl2：ch3ch2oh：去離子水為1：2：8的比例進行混合均勻，得到三元混合溶液；

然后將步驟（1）所得的蠶絲溶于上述所得的三元混合溶液中，75℃水浴加熱，充分攪拌直至蠶絲完全溶解，得到絲素溶液，溶解蠶絲所用的三元混合溶液的量，按制備蠶絲所用的蠶繭：三元混合溶液為1g:8ml的比例計算；

或?qū)⒉襟E（1）所得的蠶絲溶于9.3mol/l的libr水溶液，75℃水浴加熱，充分攪拌直至蠶絲完全溶解，然后利用透析袋（截留分子量：8000-14000）進行透析得到絲素溶液；

溶解所用的9.3mol/l的libr水溶液的量，按制備蠶絲所用的蠶繭：9.3mol/l的libr水溶液為1g:15ml的比例計算；

（3）、(nh4)2hpo4水溶液的配置

首先將(nh4)2hpo4溶于去離子水中，得到濃度為0.5mol/l的(nh4)2hpo4水溶液；然后，采用注射泵控制滴加速率為0.5ml/min的速率將0.5mol/l的(nh4)2hpo4水溶液逐滴加入步驟（2）所得絲素溶液中，滴加過程控制轉(zhuǎn)速為800rpm，溫度為75℃，滴加過程中通過滴加質(zhì)量百分比濃度為26%的氨水維持絲素溶液的ph為9.5-10.5，待(nh4)2hpo4水溶液滴加完，繼續(xù)控制攪拌轉(zhuǎn)速800rpm持續(xù)攪拌24h得到乳濁液；

上述滴加(nh4)2hpo4水溶液的量，按(nh4)2hpo4水溶液中的(nh4)2hpo4：制備絲素溶液所用的蠶絲的質(zhì)量比計算，即(nh4)2hpo4：蠶絲為1.85：1；

（4）、將步驟（3）所得的乳濁液控制轉(zhuǎn)速為400rpm進行離心，所得的沉淀用去離子水洗滌4次后，控制溫度為-90℃進行冷凍干燥，過400-800目篩子，得到絲素蛋白/羥基磷灰石白色復(fù)合粉體，其粒徑在19-38微米之間，然后密封保存?zhèn)溆谩?/p>

利用上述的絲素蛋白/羥基磷灰石白色復(fù)合粉體制備一種絲素蛋白/羥基磷灰石白色復(fù)合粉體復(fù)合支架，具體包括如下步驟：

（1）、在上述所得的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合粉體中加入粘結(jié)劑，攪拌均勻后得到打印墨水，密封保存?zhèn)溆茫?/p>

粘結(jié)劑的加入量，按絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合粉體：粘結(jié)劑的質(zhì)量比為3.0~10.0：1的計算；

所述的粘結(jié)劑為聚乙烯醇、海藻酸鈉、聚己內(nèi)酯、聚乳酸、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、3-羥基丁酸與3-羥基己酸的共聚酯或泊洛沙姆的水溶液，優(yōu)選為質(zhì)量百分比濃度為10-15%的聚乙烯醇水溶液，所述的聚乙烯醇的分子量為146000-186000，或優(yōu)選為質(zhì)量百分比濃度為10%的海藻酸鈉水溶液，所述的海藻酸鈉的分子量為216；

或所述的粘結(jié)劑為聚己內(nèi)酯溶于三氯甲烷而得的有機溶液，聚己內(nèi)酯和三氯甲烷的用量，按質(zhì)量比體積計算，聚己內(nèi)酯：三氯甲烷為1：3的比例計算，其中聚己內(nèi)酯的平均分子量為8000；

（2）、將步驟（1）得到的打印墨水裝進三維打印機的料筒中，針頭直徑為100~1000微米，優(yōu)選為400微米，啟動三維打印程序，調(diào)節(jié)氣壓為2.5~4.0bar，打印速度為3.0~8.0mm/s，墨水相鄰兩層走向夾角為0°~180°，孔徑為50~1200微米，將打印墨水以層層堆積的方式沉積在載物平臺的玻璃培養(yǎng)皿中，然后控制溫度為-90℃進行冷凍干燥，得到絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架；

本發(fā)明的各實施例中僅以45°~190°，孔徑為400微米進行舉例說明，但并不限制墨水相鄰兩層走向夾角為0°~180°，孔徑為50~1200微米的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架的制備；

所述的三位打印程序是通過cad、ug或solidworks等三維繪圖軟件繪制而成的具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架圖形。

本發(fā)明的有益效果

本發(fā)明的一種具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架，首先通過原位礦化過程在絲素蛋白分子上沉積羥基磷灰石，獲得有機無機復(fù)合的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合粉體，所得復(fù)合粉體材料的粒徑均一，通過控制絲素蛋白、氯化鈣和磷酸氫二銨在分散相中的比例，可以調(diào)控所得復(fù)合粉體的微觀結(jié)構(gòu)。進一步，通過三維打印技術(shù)將該粒徑均一的復(fù)合粉體材料制備成具有特定結(jié)構(gòu)的復(fù)合支架，因此所得的復(fù)合支架具有“一結(jié)構(gòu)，一支架”的技術(shù)效果。

進一步，本發(fā)明的一種具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架的制備方法，由于可以通過三維打印技術(shù)改變切層的網(wǎng)格填充方式和孔隙大小，因此可以方便的調(diào)節(jié)復(fù)合支架的孔隙率和孔結(jié)構(gòu)，從而制備出具有高孔隙率、較好的孔連通性，可控的力學(xué)性能的骨修復(fù)復(fù)合材料支架，從而有利于成骨誘導(dǎo)、分化，細胞黏附、遷移、增殖，創(chuàng)建適應(yīng)成骨相關(guān)細胞生長需要的微環(huán)境。

附圖說明

圖1a、實施例1所得的具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架掃描電鏡照片；

圖1b、實施例2所得的具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架掃描電鏡照片；

圖1c、實施例3所得的具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架掃描電鏡照片；

圖2、實施例1所得的具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架的光學(xué)照片；

圖3、實施例2所得的具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架的光學(xué)照片；

圖4a、圖4b、實施例6所得的具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架的光學(xué)照片。

具體實施方式

為了使本領(lǐng)域技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明的實施例做詳細說明，但并不限制本發(fā)明。

本發(fā)明的實施例中所用的三維打印機是第四代3-dbioplotter?(envisiontecgmbh,germany)，本發(fā)明所用的三維打印程序可由autocad、ug、solidworks等三維繪圖軟件繪制。

實施例1

一種具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架，通過包括如下步驟的方法制備而成：

（1）、蠶繭去除蠶蛹，清理蠶繭表面雜物

將4.3g蠶繭浸入500ml的濃度為0.5g/l的na2co3水溶液中，100℃水煮60min進行脫膠，取出脫膠后所得的蠶絲，用去離子水洗滌3次，然后60℃真空干燥24h，得到蠶絲，室溫下干燥保存?zhèn)溆茫?/p>

（2）、蠶絲溶液的制備

首先，將11.10gcacl2、9.20gch3ch2oh和14.4g去離子水按摩爾比計算，即cacl2：ch3ch2oh：去離子水為1：2：8的比例進行混合均勻，得到三元混合溶液；

然后將步驟（1）所得的蠶絲全部溶于上述所得的三元混合溶液中，75℃水浴加熱，充分攪拌直至完全溶解，得到絲素溶液；

溶解所用的三元混合溶液的量，按制備蠶絲所用的蠶繭：三元混合溶液為1g:8ml的比例計算；

（3）、(nh4)2hpo4水溶液的配置

首先將7.92g(nh4)2hpo4溶于120ml去離子水中，得到濃度為0.5mol/l的(nh4)2hpo4水溶液；

然后，采用注射泵控制滴加速率為0.5ml/min的速率將上述所得的0.5mol/l的(nh4)2hpo4水溶液逐滴加入步驟（2）所得絲素溶液中，滴加過程控制轉(zhuǎn)速為800rpm，溫度為75℃，過程中通過滴加濃度為26%的氨水維持絲素溶液的ph為9.5-10.5，待(nh4)2hpo4水溶液滴加完，繼續(xù)控制攪拌轉(zhuǎn)速800rpm持續(xù)攪拌24h得到乳濁液；

上述滴加(nh4)2hpo4水溶液的量，按(nh4)2hpo4水溶液中的(nh4)2hpo4：制備絲素溶液所用的蠶絲的質(zhì)量比計算，即(nh4)2hpo4：蠶絲為1.85：1；

（4）、將步驟（3）所得的乳濁液控制轉(zhuǎn)速為400rpm進行離心，所得的沉淀用去離子水洗滌4次后，控制溫度為-90℃進行冷凍干燥，過400目篩子，得到絲素蛋白/羥基磷灰石白色復(fù)合粉體，其粒徑均一，均小于38微米，然后密封保存?zhèn)溆茫?/p>

（5）、在步驟（4）得到的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合粉體中加入粘結(jié)劑，控制攪拌轉(zhuǎn)速為500rpm攪拌2h后得到打印墨水，密封保存?zhèn)溆茫?/p>

粘結(jié)劑的加入量，按絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合粉體：粘結(jié)劑的質(zhì)量比為3.0：1的計算；

所述的粘結(jié)劑為質(zhì)量百分比濃度為15%的聚乙烯醇水溶液，所述的聚乙烯醇的分子量為146000-186000；

質(zhì)量百分比濃度為15%的聚乙烯醇水溶液的配制：即將7.5g分子量為146000-186000的聚乙烯醇溶于42.5g的去離子水中，控制溫度為90℃水浴加熱磁力攪拌至完全溶解即得質(zhì)量百分比濃度為15%的聚乙烯醇水溶液；

（6）、將步驟（5）得到的打印墨水裝進三維打印機的料筒中，針頭直徑為400微米；啟動三維打印程序，調(diào)節(jié)氣壓為2.5~3.0bar,打印速度為4.0~6.0mm/s，墨水相鄰兩層走向夾角為60°，孔徑為800微米，將打印墨水以層層堆積的方式沉積在載物平臺的玻璃培養(yǎng)皿中，然后進行冷凍干燥，得到具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架；

所述的三位打印程序是通過solidworks制圖技術(shù)繪制而成的具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架圖形。

采用feiquanta450型場發(fā)射掃描電鏡，對上述所得的具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架進行掃描，所得的sem圖如圖1a所示，從圖1a中可以看出通過三維打印技術(shù)制備的復(fù)合支架層與層之間，線與線之間均存在一定的空隙，具有高孔隙率，支架表面具有一定的粗糙度有利于細胞的黏附、遷移、增殖。

采用華為手機加外置魚眼鏡頭，對上述所得的具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架進行拍攝，所得的光學(xué)照片如圖2所示，從圖2中可以看出支架結(jié)構(gòu)完好，線與線之間間距均勻，孔徑分布良好。由此表明了支架孔隙率高，支架結(jié)構(gòu)完整。

實施例2

一種具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架，通過包括如下步驟的方法制備而成：

（1）、蠶繭去除蠶蛹，清理蠶繭表面雜物

將4.3g蠶繭浸入500ml的濃度為0.5g/l的na2co3水溶液中，100℃水煮60min進行脫膠，取出脫膠后所得的蠶絲，用去離子水洗滌3次，然后60℃真空干燥24h，得到蠶絲，室溫下干燥保存?zhèn)溆茫?/p>

（2）、蠶絲溶液的制備

首先，將11.10gcacl2、9.20gch3ch2oh和14.4g去離子水按摩爾比計算，即cacl2：ch3ch2oh：去離子水為1：2：8的比例進行混合均勻，得到三元混合溶液；

然后將步驟（1）所得的蠶絲全部溶于上述所得的三元混合溶液中，75℃水浴加熱，充分攪拌直至完全溶解，得到絲素溶液；

溶解所用的三元混合溶液的量，按制備蠶絲所用的蠶繭：三元混合溶液為1g:8ml的比例計算；

（3）、(nh4)2hpo4水溶液的配置

首先將7.92g(nh4)2hpo4溶于120ml去離子水中，得到濃度為0.5mol/l的(nh4)2hpo4水溶液；

然后，采用注射泵控制滴加速率為0.5ml/min的速率將上述所得的0.5mol/l的(nh4)2hpo4水溶液逐滴加入步驟（2）所得絲素溶液中，滴加過程控制轉(zhuǎn)速為800rpm，溫度為75℃，過程中通過滴加濃度為26%的氨水維持絲素溶液的ph為9.5-10.5，待(nh4)2hpo4水溶液滴加完，繼續(xù)控制攪拌轉(zhuǎn)速800rpm持續(xù)攪拌24h得到乳濁液；

上述滴加(nh4)2hpo4水溶液的量，按(nh4)2hpo4水溶液中的(nh4)2hpo4：制備絲素溶液所用的蠶絲的質(zhì)量比計算，即(nh4)2hpo4：蠶絲為1.85：1；

（4）、將步驟（3）所得的乳濁液控制轉(zhuǎn)速為800rpm進行離心，所得的沉淀用去離子水洗滌4次后控制，控制溫度為-90℃進行冷凍干燥，過400目篩子，得到絲素蛋白/羥基磷灰石白色復(fù)合粉體，其粒徑均一，均小于38微米，然后密封保存?zhèn)溆茫?/p>

（5）、在步驟（4）得到的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合粉體中加入粘結(jié)劑，控制攪拌轉(zhuǎn)速為500rpm攪拌2h后得到打印墨水，密封保存?zhèn)溆茫?/p>

粘結(jié)劑的加入量，按絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合粉體：粘結(jié)劑的質(zhì)量比為5.0：1的計算；

所述的粘結(jié)劑為質(zhì)量百分比濃度為10%的聚乙烯醇水溶液，所述的聚乙烯醇的分子量為146000-186000；

質(zhì)量百分比濃度為10%的聚乙烯醇水溶液的配制：即將5g分子量為146000-186000的聚乙烯醇溶于45g的去離子水中，控制溫度為90℃水浴加熱磁力攪拌至完全溶解即得質(zhì)量百分比濃度為10%的聚乙烯醇水溶液；

（6）、將步驟（5）得到的打印墨水裝進三維打印機的料筒中，針頭直徑為400微米；啟動三維打印程序，調(diào)節(jié)氣壓為2.5~3.5bar,打印速度為3.0~5.0mm/s，墨水相鄰兩層走向夾角為60°，孔徑為800微米，將打印墨水以層層堆積的方式沉積在載物平臺的玻璃培養(yǎng)皿中，然后進行冷凍干燥，得到具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架；

所述的三位打印程序是通過solidworks制圖技術(shù)繪制而成的具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架圖形。

采用feiquanta450型場發(fā)射掃描電鏡，對上述所得的具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架進行掃描，所得的sem圖如圖1b所示，從圖1b中可以看出通過三維打印技術(shù)制備的復(fù)合支架層與層之間，線與線之間均存在一定的空隙，具有高孔隙率，支架表面具有一定的粗糙度有利于細胞的黏附、遷移、增殖，且不同比例的支架表面粗糙度、孔隙率存在差異。

采用華為手機加外置魚眼鏡頭，對上述所得的具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架進行拍攝，所得的光學(xué)照片如圖3所示，從圖3中可以看出支架結(jié)構(gòu)完好，線與線之間間距均勻，層與層呈90度堆疊孔徑分布良好。由此表明了支架孔隙率高，支架結(jié)構(gòu)完整，利用三維打印技術(shù)能夠靈活的控制打印參數(shù)。

實施例3

一種具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架，通過包括如下步驟的方法制備而成：

（1）、蠶繭去除蠶蛹，清理蠶繭表面雜物

將4.3g蠶繭浸入500ml的濃度為0.5g/l的na2co3水溶液中，100℃水煮60min進行脫膠，取出脫膠后所得的蠶絲，用去離子水洗滌3次，然后60℃真空干燥24h，得到蠶絲，室溫下干燥保存?zhèn)溆茫?/p>

（2）、蠶絲溶液的制備

首先，將11.10gcacl2、9.20gch3ch2oh和14.4g去離子水按摩爾比計算，即cacl2：ch3ch2oh：去離子水為1：2：8的比例進行混合均勻，得到三元混合溶液；

然后將步驟（1）所得的蠶絲全部溶于上述所得的三元混合溶液中，75℃水浴加熱，充分攪拌直至完全溶解，得到絲素溶液；

溶解所用的三元混合溶液的量，按制備蠶絲所用的蠶繭：三元混合溶液為1g:8ml的比例計算；

（3）、(nh4)2hpo4水溶液的配置

首先將7.92g(nh4)2hpo4溶于120ml去離子水中，得到濃度為0.5mol/l的(nh4)2hpo4水溶液；

然后，采用注射泵控制滴加速率為0.5ml/min的速率將上述所得的0.5mol/l的(nh4)2hpo4水溶液逐滴加入步驟（2）所得絲素溶液中，滴加過程控制轉(zhuǎn)速為800rpm，溫度為75℃，過程中通過滴加濃度為26%的氨水維持絲素溶液的ph為9.5-10.5，待(nh4)2hpo4水溶液滴加完，繼續(xù)控制攪拌轉(zhuǎn)速800rpm持續(xù)攪拌24h得到乳濁液；

上述滴加(nh4)2hpo4水溶液的量，按(nh4)2hpo4水溶液中的(nh4)2hpo4：制備絲素溶液所用的蠶絲的質(zhì)量比計算，即(nh4)2hpo4：蠶絲為1.85：1；

（4）、將步驟（3）所得的乳濁液控制轉(zhuǎn)速為800rpm進行離心，所得的沉淀用去離子水洗滌4次后，控制溫度為-90℃進行冷凍干燥，過400目篩子，得到絲素蛋白/羥基磷灰石白色復(fù)合粉體，其粒徑均一，均小于38微米，然后密封保存?zhèn)溆茫?/p>

（5）、在步驟（4）得到的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合粉體中加入粘結(jié)劑，控制攪拌轉(zhuǎn)速為500rpm攪拌2h后得到打印墨水，密封保存?zhèn)溆茫?/p>

粘結(jié)劑的加入量，按絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合粉體：粘結(jié)劑的質(zhì)量比為10.0：1的計算；

所述的粘結(jié)劑為質(zhì)量百分比濃度為10%的聚乙烯醇水溶液，所述的聚乙烯醇的分子量為146000-186000；

質(zhì)量百分比濃度為10%的聚乙烯醇水溶液的配制：即將5g分子量為146000-186000的聚乙烯醇溶于45g的去離子水中，控制溫度為90℃水浴加熱磁力攪拌至完全溶解即得質(zhì)量百分比濃度為10%的聚乙烯醇水溶液；

（6）、將步驟（5）得到的打印墨水裝進三維打印機的料筒中，針頭直徑為400微米；啟動三維打印程序，調(diào)節(jié)氣壓為3.5~4.0bar,打印速度為4.0~6.0mm/s，墨水相鄰兩層走向夾角為60°，孔徑為800微米，將打印墨水以層層堆積的方式沉積在載物平臺的玻璃培養(yǎng)皿中，然后冷凍干燥，得到具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架；

所述的三位打印程序是通過solidworks制圖技術(shù)繪制而成的具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架圖形。

采用feiquanta450型場發(fā)射掃描電鏡，對上述所得的具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架進行掃描，所得的sem圖如圖1c所示，從圖1c中可以看出通過三維打印技術(shù)制備的復(fù)合支架層與層之間，線與線之間均存在一定的空隙，具有高孔隙率，支架表面具有一定的粗糙度有利于細胞的黏附、遷移、增殖，且不同比例的支架表面粗糙度、孔隙率均存在差異。

實施例4

一種具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架，通過包括如下步驟的方法制備而成：

（1）、蠶繭去除蠶蛹，清理蠶繭表面雜物

將4.3g蠶繭浸入500ml的濃度為0.5g/l的na2co3水溶液中，100℃水煮60min進行脫膠，取出脫膠后所得的蠶絲，用去離子水洗滌3次，然后60℃真空干燥24h，得到蠶絲，室溫下干燥保存?zhèn)溆茫?/p>

（2）、蠶絲溶液的制備

首先，將11.10gcacl2、9.20gch3ch2oh和14.4g去離子水按摩爾比計算，即cacl2：ch3ch2oh：去離子水為1：2：8的比例進行混合均勻，得到三元混合溶液；

然后將步驟（1）所得的蠶絲全部溶于上述所得的三元混合溶液中，75℃水浴加熱，充分攪拌直至完全溶解，得到絲素溶液；

溶解所用的三元混合溶液的量，按制備蠶絲所用的蠶繭：三元混合溶液為1g:8ml的比例計算；

（3）、(nh4)2hpo4水溶液的配置

首先將7.92g(nh4)2hpo4溶于120ml去離子水中，得到濃度為0.5mol/l的(nh4)2hpo4水溶液；

然后，采用注射泵控制滴加速率為0.5ml/min的速率將上述所得的0.5mol/l的(nh4)2hpo4水溶液逐滴加入步驟（2）所得絲素溶液中，滴加過程控制轉(zhuǎn)速為800rpm，溫度為75℃，過程中通過滴加濃度為26%的氨水維持絲素溶液的ph為9.5-10.5，待(nh4)2hpo4水溶液滴加完，繼續(xù)控制攪拌轉(zhuǎn)速800rpm持續(xù)攪拌24h得到乳濁液；

上述滴加(nh4)2hpo4水溶液的量，按(nh4)2hpo4水溶液中的(nh4)2hpo4：制備絲素溶液所用的蠶絲的質(zhì)量比計算，即(nh4)2hpo4：蠶絲為1.85：1；

（4）、將步驟（3）所得的乳濁液控制轉(zhuǎn)速為800rpm進行離心，所得的沉淀用去離子水洗滌4次后，控制溫度為-90℃進行冷凍干燥，過400目篩子，得到絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合粉體，其粒徑均一，均小于38微米，然后密封保存?zhèn)溆茫?/p>

（5）、在步驟（4）得到的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合粉體中加入粘結(jié)劑，控制攪拌轉(zhuǎn)速為500rpm攪拌2h后得到打印墨水，密封保存?zhèn)溆茫?/p>

粘結(jié)劑的加入量，按絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合粉體：粘結(jié)劑的質(zhì)量比為5.0：1的計算；

所述的粘結(jié)劑為質(zhì)量百分比濃度為10%的海藻酸鈉水溶液，所述的海藻酸鈉的分子量為216；

質(zhì)量百分比濃度為10%的海藻酸鈉水溶液的配制：即將2g分子量為216的海藻酸鈉溶于18g的去離子水中，控制溫度為90℃水浴加熱磁力攪拌至完全溶解即得質(zhì)量百分比濃度為10%的海藻酸鈉水溶液；

（6）、將步驟（5）得到的打印墨水裝進三維打印機的料筒中，針頭直徑為400微米；啟動三維打印程序，調(diào)節(jié)氣壓為2.5~3.0bar,打印速度為6.0~8.0mm/s，墨水相鄰兩層走向夾角為45°，孔徑為600微米，將打印墨水以層層堆積的方式沉積在載物平臺的玻璃培養(yǎng)皿中，然后進行冷凍干燥，得到絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架；

所述的三位打印程序是通過solidworks制圖技術(shù)繪制而成的具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架圖形。

實施例5

一種具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架，通過包括如下步驟的方法制備而成：

（1）、蠶繭去除蠶蛹，清理蠶繭表面雜物

將4.3g蠶繭浸入500ml的濃度為0.5g/l的na2co3水溶液中，100℃水煮60min進行脫膠，取出脫膠后所得的蠶絲，用去離子水洗滌3次，然后60℃真空干燥24h，得到蠶絲，室溫下干燥保存?zhèn)溆茫?/p>

（2）、蠶絲溶液的制備

首先，將11.10gcacl2、9.20gch3ch2oh和14.4g去離子水按摩爾比計算，即cacl2：ch3ch2oh：去離子水為1：2：8的比例進行混合均勻，得到三元混合溶液；

然后將步驟（1）所得的蠶絲全部溶于上述所得的三元混合溶液中，75℃水浴加熱，充分攪拌直至完全溶解，得到絲素溶液；

溶解所用的三元混合溶液的量，按制備蠶絲所用的蠶繭：三元混合溶液為1g:8ml的比例計算；

（3）、(nh4)2hpo4水溶液的配置

首先將7.92g(nh4)2hpo4溶于120ml去離子水中，得到濃度為0.5mol/l的(nh4)2hpo4水溶液；

然后，采用注射泵控制滴加速率為0.5ml/min的速率將上述所得的0.5mol/l的(nh4)2hpo4水溶液逐滴加入步驟（2）所得絲素溶液中，滴加過程控制轉(zhuǎn)速為800rpm，溫度為75℃，過程中通過滴加濃度為26%的氨水維持絲素溶液的ph為9.5-10.5，待(nh4)2hpo4水溶液滴加完，繼續(xù)控制攪拌轉(zhuǎn)速800rpm持續(xù)攪拌24h得到乳濁液；

上述滴加(nh4)2hpo4水溶液的量，按(nh4)2hpo4水溶液中的(nh4)2hpo4：制備絲素溶液所用的蠶絲的質(zhì)量比計算，即(nh4)2hpo4：蠶絲為1.85：1；

（4）、將步驟（3）所得的乳濁液控制轉(zhuǎn)速為800rpm進行離心，所得的沉淀用去離子水洗滌4次后，控制溫度為-90℃進行冷凍干燥，過400目篩子，得到絲素蛋白/羥基磷灰石白色復(fù)合粉體，其粒徑均一，均小于38微米，然后密封保存?zhèn)溆茫?/p>

（5）、在步驟（4）得到的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合粉體中加入粘結(jié)劑，控制攪拌轉(zhuǎn)速為500rpm攪拌2h攪拌均勻后得到打印墨水，密封保存?zhèn)溆茫?/p>

粘結(jié)劑的加入量，按絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合粉體：粘結(jié)劑的質(zhì)量比為5.0：1的計算；

所述的粘結(jié)劑為1g聚己內(nèi)酯溶于3ml三氯甲烷而得的有機溶液，聚己內(nèi)酯和三氯甲烷的用量，按質(zhì)量比體積計算，聚己內(nèi)酯：三氯甲烷為1：3的比例計算，其中聚己內(nèi)酯的平均分子量為8000；

（6）、將步驟（5）得到的打印墨水裝進三維打印機的料筒中，針頭直徑為400微米；啟動三維打印程序，調(diào)節(jié)氣壓為2.8~3.5bar,打印速度為3.0~5.0mm/s，墨水相鄰兩層走向夾角為90°，孔徑為800微米，將打印墨水以層層堆積的方式沉積在載物平臺的玻璃培養(yǎng)皿中，然后進行冷凍干燥，得到具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架；

所述的三位打印程序是通過ug制圖技術(shù)繪制而成的具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架圖形。

實施例6

一種具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架，通過包括如下步驟的方法制備而成：

（1）、蠶繭去除蠶蛹，清理蠶繭表面雜物

將4.3g蠶繭浸入500ml的濃度為0.5g/l的na2co3水溶液中，100℃水煮60min進行脫膠，取出脫膠后所得的蠶絲，用去離子水洗滌3次，然后60℃真空干燥24h，得到蠶絲，室溫下干燥保存?zhèn)溆茫?/p>

（2）、蠶絲溶液的制備

濃度為9.3mol/l的libr水溶液的配制：即取40glibr溶于50ml去離子水，得到濃度為9.3mol/l的libr水溶液；

將步驟（1）所得的蠶絲溶于上述所得的濃度為9.3mol/l的libr水溶液，75℃水浴加熱，充分攪拌直至完全溶解，然后利用透析袋（截留分子量：8000-14000）進行透析，得到絲素溶液；

溶解所用的9.3mol/l的libr水溶液的量，按制備蠶絲所用的蠶繭：9.3mol/l的libr水溶液為1g:15ml的比例計算

（3）、(nh4)2hpo4水溶液的配置

首先將7.92g(nh4)2hpo4溶于120ml去離子水中，得到濃度為0.5mol/l的(nh4)2hpo4水溶液；

然后，采用注射泵控制滴加速率為0.5ml/min的速率將上述所得的0.5mol/l的(nh4)2hpo4水溶液逐滴加入步驟（2）所得絲素溶液中，滴加過程控制轉(zhuǎn)速為800rpm，溫度為75℃，過程中通過滴加濃度為26%的氨水維持絲素溶液的ph為9.5-10.5，待(nh4)2hpo4水溶液滴加完，繼續(xù)控制攪拌轉(zhuǎn)速800rpm持續(xù)攪拌24h得到乳濁液；

上述滴加(nh4)2hpo4水溶液的量，按(nh4)2hpo4水溶液中的(nh4)2hpo4：制備絲素溶液所用的蠶絲的質(zhì)量比計算，即(nh4)2hpo4：蠶絲為1.85：1；

（4）、將步驟（3）所得的乳濁液控制轉(zhuǎn)速為800rpm進行離心，所得的沉淀用去離子水洗滌4次后，控制溫度為-90℃進行冷凍干燥，過400目篩子，得到絲素蛋白/羥基磷灰石白色復(fù)合粉體，其粒徑均一，均小于38微米，然后密封保存?zhèn)溆茫?/p>

（5）、在步驟（4）得到的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合粉體中加入粘結(jié)劑，控制攪拌轉(zhuǎn)速為500rpm攪拌2h后得到打印墨水，密封保存?zhèn)溆茫?/p>

粘結(jié)劑的加入量，按絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合粉體：粘結(jié)劑的質(zhì)量比為10.0：1的計算；

所述的粘結(jié)劑為質(zhì)量百分比濃度為10%的海藻酸鈉水溶液，所述的海藻酸鈉的分子量為216；

質(zhì)量百分比濃度為10%的海藻酸鈉水溶液的配制：即將2g分子量為216的海藻酸鈉溶于18g的去離子水中，控制溫度為90℃水浴加熱磁力攪拌至完全溶解即得質(zhì)量百分比濃度為10%的海藻酸鈉水溶液；

（6）、將步驟（5）得到的打印墨水裝進三維打印機的料筒中，針頭直徑為400微米；啟動三維打印程序，調(diào)節(jié)氣壓為3.0~3.5bar，打印速度為6.0~8.0mm/s，墨水相鄰兩層走向夾角為60°，孔徑為800微米，將打印墨水以層層堆積的方式沉積在載物平臺的玻璃培養(yǎng)皿中，冷凍干燥，得到具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架；

所述的三位打印程序是通過autocad制圖技術(shù)繪制而成的具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架圖形。

采用華為手機加外置魚眼鏡頭，對上述所得的具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架進行拍攝，所得的光學(xué)照片如圖4a、4b所示，從圖4a、4b中可以看出支架結(jié)構(gòu)完好，線與線之間間距均勻，層與層呈90度堆疊，孔徑分布良好，支架高度、形狀可調(diào)。由此表明了支架孔隙率高，支架結(jié)構(gòu)完整，利用三維打印技術(shù)能夠靈活的控制打印參數(shù)。

綜上所述，本發(fā)明提供的一種具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架的制備方法，首先通過仿生礦化，制備出粒徑均一的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合粉體，該絲素蛋白在絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合粉體中的含量，按質(zhì)量百分比計算可達10%-80%，進一步，利用三維打印技術(shù)，可制備出具有高孔隙率、較好的孔連通性，可控的力學(xué)性能的骨修復(fù)復(fù)合材料支架，從而有利于成骨誘導(dǎo)、分化，細胞黏附、遷移、增殖。通過三維打印技術(shù)，可以靈活調(diào)節(jié)打印針頭直徑、打印氣壓、打印速度、支架孔徑和結(jié)構(gòu)等參數(shù)，能夠滿足骨組織工程支架“一結(jié)構(gòu)，一支架”的要求。

以上所述僅是本發(fā)明的實施方式的舉例，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進和變型，例如：基本參數(shù)的改變（針頭直徑、打印氣壓、打印速度等）、打印墨水的配比、粘結(jié)劑的改變、粉體和支架的處理方法等，這些改進和變型也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。