TET2蛋白和5-mC DNA的三維結(jié)構(gòu)及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本申請(qǐng)屬于結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域，涉及TET2基因改造、蛋白表達(dá)純化、TET2-5-mCDNA 復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 惡性腫瘤及血液系統(tǒng)疾病很長時(shí)間來都是危害人類生命健康的最大殺手，新增的 癌癥病例患者死亡率以每年1%的速度遞增著。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO)國際癌癥研究機(jī)構(gòu) 推測，截至2030年，全球范圍內(nèi)，確診癌癥的患者數(shù)將比21世紀(jì)初增加1倍以上，即截止至 2030年，全球?qū)⒂屑s2700萬人確診為癌癥，約1700萬人死于癌癥。目前，世界衛(wèi)生組織和 各國政府衛(wèi)生部門已把攻克癌癥列為一項(xiàng)首要任務(wù)。
[0003] 隨著近年來表觀遺傳學(xué)熱度的增加，人們?cè)絹碓揭庾R(shí)到表觀遺傳學(xué)在基因組印 記、基因表達(dá)調(diào)控、胚胎干細(xì)胞維持及分化、胚胎發(fā)育及成體造血功能、惡性血液疾病及腫 瘤發(fā)生中的重要意義。表觀遺傳學(xué)（epigenetics)是研究在DNA堿基序列不變前提下引起 基因表達(dá)或細(xì)胞表型變化的遺傳機(jī)制，主要包括DNA(胞嘧啶，cytosine，C)的甲基化、組蛋 白修飾和染色質(zhì)重塑等。
[0004] 高等真核細(xì)胞DNA甲基化主要為胞嘧啶（C)甲基化，即形成5-甲基胞嘧啶（5-mC)。 5-mC轉(zhuǎn)換為C即為DNA去甲基化。細(xì)胞DNA甲基化/去甲基化處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，以調(diào)芐基 因表達(dá)及細(xì)胞行使功能。DNA甲基化與去甲基化發(fā)生均受到嚴(yán)格調(diào)控，此調(diào)控同個(gè)體生長 發(fā)育與生理活動(dòng)調(diào)節(jié)密切相關(guān)，疾病發(fā)生時(shí)常伴有DNA甲基化調(diào)控機(jī)制異常所引起的DNA 甲基化修飾紊亂[0KAN0M,BELLDW,HABERDA，etal.DNAmethyltransferasesDnmt3a andDnmt3bareessentialfordenovomethylationandmammaliandevelopment[J]. Cell, 1999,99(3) : 247-257]。DNA甲基化主要由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNAmethyltransferase， DNMT)催化。DNA去甲基化包括全基因組范圍和特異基因位點(diǎn)DNA的去甲基化，其發(fā)生機(jī)制 較為復(fù)雜，分為被動(dòng)和主動(dòng)去甲基化兩類。被動(dòng)去甲基化是指在DNA復(fù)制過程中，因DNMT 活性受抑制導(dǎo)致新合成DNA鏈上甲基化水平隨著DNA的復(fù)制而被稀釋。主動(dòng)去甲基化則獨(dú) 立于DNA復(fù)制，由相關(guān)酶逐步催化5-mC轉(zhuǎn)化為C，主動(dòng)去甲基化過程中，一方面可由酶催化 5_mC甲基基團(tuán)的直接切除[WUSC,ZHANGY.ActiveDNAdemethylation:manyroadslead toRome[J].NatureReviewsMolecularCellBiology, 2010, 11(9):607_620];另一方 面是利用堿基或核苷酸切除等DNA損傷修復(fù)機(jī)制，將5-mC或經(jīng)化學(xué)基團(tuán)修飾后的5-mC 轉(zhuǎn)化為C[WUSC,ZHANGY.ActiveDNAdemethylation:manyroadsleadtoRome[J]. NatureReviewsMolecularCellBiology, 2010, 11(9):607-620；SANCARA,LINDSEYB LA,UNSALKK,etal.MolecularmechanismsofmammalianDNArepairandtheDNA damagecheckpoints[J].AnnuRevBiochem, 2004,73:39-85]。
[0005] 大量研究表明，TET蛋白家族可催化5-mC氧化為5-羥甲基胞嘧啶（5-hmC)， 5-hmC又被稱為第6種堿基，但對(duì)這種堿基的分布和重要性一直缺乏詳細(xì)理解。5-hmC最 初在多種動(dòng)物的DNA中被發(fā)現(xiàn)，且在早期胚胎和神經(jīng)系統(tǒng)中有大量分布。TET蛋白家族 具有催化5-mC羥基化的酶活性，而5-hmC在染色體上的分布與基因表達(dá)具有明顯關(guān)系[LoenarzC，SchofieldCJ.Oxygenasecatalyzed5~methy1cytosinehydroxylation [J].ChemBiol，200916(6):580-583]。后來研究發(fā)現(xiàn)，在多種細(xì)胞的基因組DNA中都 能檢測到TET蛋白進(jìn)一步將5-hmC氧化，生成5-?；涠福?-formylcytosine，5fC) 和5-羧基胞啼卩定（5_。&1'130171。7七08；[116,5。&0[3.1七0，1^311611，6七&1.16七。1'0七6；[118 canconvert5-methylcytosineto5-formylcytosineand5-carboxylcytosine[J]. Science，2011，333:1300-1303]，它們都被認(rèn)為是去甲基化過程的中間產(chǎn)物，是哺乳動(dòng)物中 重要的DNA表觀遺傳標(biāo)記。
[0006] 已有研究表明，表觀修飾在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中均發(fā)揮重要的作用，而多項(xiàng)實(shí) 驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TET蛋白基因突變或結(jié)構(gòu)異常與造血系統(tǒng)惡性腫瘤密切相關(guān)[LangemeijerSM， AslanyanMG,JansenJH.TETproteinsinmalignanthematopoiesis[j].CellCycle, 2009,8(24) :4044-4048]。2009 年 3 月，TefferiA等人首先發(fā)現(xiàn)，在大約 14% 的JAK2V617F 陽性MPNs患者中存在TET2突變，且這些突變存在于早期造血干細(xì)胞（⑶34+⑶38-)中，這 一重要發(fā)現(xiàn)使得TET2成為最近血液腫瘤領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。隨后的大量研究發(fā)現(xiàn)，其他髓 系惡性腫瘤，如慢性骨髓單核細(xì)胞性白血?。╟hronicmyelomonocyticleukemia，CMML)、 骨髓增生異常綜合癥（myelodysplasticsyndrome，MDS)、急性髓細(xì)胞性白血?。ˋcute MyelocyticLeukemia，AML)和M7AML等患者體內(nèi)也存在TET蛋白突變體。有研究發(fā)現(xiàn)，在 多個(gè)AML患者中鑒定出存在TET1與組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶MLL基因融合的現(xiàn)象[LorsbachRB， MooreJ,MathewS，etal.TET1，amemberofanovelproteinfamily,isfusedto MLLinacutemyeloidleukemiacontainingthet(10;11) (q22;q23) [J].Leukemia， 2003,17(3) :637-641 ]。TET2 在骨髓增生性腫瘤（myeloproliferativeneoplasms，MPN) 中突變率為 7. 6%，CMML中為 42%，AML中為 12% [Abdel-Wahab0,MullallyA，HedvatC， etal.GeneticcharacterizationofTET1，TET2，andTET3alterationsinmyeloid malignancies[J].Blood，2009，114(l):144-147]。TET2 是至今鑒定出的突變最頻繁的 MDS相關(guān)基因[LangemeijerSM，KuiperRP，BerendsM，etal.Acquiredmutationsin TET2arecommoninmyelodysplasticsyndromes[j].NatGenet,2009,41(7):838-842], 在大約20%的MDS患者中鑒定出TET2基因突變，且與臨床癥狀密切相關(guān)，因此可作為一種 良好的診斷分子標(biāo)志物[Kosmider0，Gelsi_BoyerV，CheokM，etal.TET2mutationis anindependentfavorableprognosticfactorinmyelodysplasticsyndromes(MDSs) [J].Blood，2009，114(15):3285-3291]〇
[0007] TET2全稱為TET癌基因家族成員2(TEToncogenefamilymember2)，其基因位 于染色體4q24上，含11個(gè)外顯子，mRNA有三種選擇性剪切體，在體內(nèi)廣泛表達(dá)。TET2蛋 白共有三種亞型分別為亞型1、2、3,其中全長2002個(gè)氨基酸的TET2蛋白亞型1包含兩個(gè) 進(jìn)化高度保守區(qū)域。在脊椎動(dòng)物中存在三種保守的了￡1'蛋白4￡1'1、了￡了2、了￡了3，了￡1'1在胚 胎干細(xì)胞（EScells)、TET2在造血細(xì)胞中、TET3在卵母細(xì)胞和受精卵中大量表達(dá)。TET蛋 白涉及到多種生物進(jìn)程，如早期胚胎形成、干細(xì)胞分化和造血作用[M.R.Branco,G.Ficz，W. Reik,Uncoveringtheroleof5-hydroxymethylcytosineintheepigenome[J].Nat. Rev.Genet. , 2011, 13: 7-13 ；H.Wu,Y.Zhang. ,MechanismsandfunctionsofTetprot ein-mediated5-methylcytosineoxidation[J].Genes&Dev.，2011，25:2436-2452]〇 TET蛋白屬于a-酮戊二酸（alpha-ketoglutaricacid,a-KG)和Fe2+依賴的雙加氧 酶，在靠近C端的位置有1個(gè)催化結(jié)構(gòu)域（catalytic/dioxygenasedomain),該結(jié)構(gòu)域 具有3個(gè)金屬離子（Fe2+)和1個(gè)a-KG的結(jié)合位點(diǎn)，催化結(jié)構(gòu)域前還有一段富含半胱氨 酸的區(qū)域（Cys-richdomain)。TET蛋白的催化機(jī)制為：氧和a-KG在為5-mC提供羥基 的同時(shí)a-KG氧化脫羧生成琥拍酸，該過程還需要Fe2+和抗壞血酸的參與[XuW，Yang H,LiuY,etal.Oncometabolite2-hydroxyglutarateisacompetitiveinhibitor ofa-ketoglutarate-dependentdioxygenases[j].Cance