玫瑰的花青素還原酶RrANR基因及其編碼蛋白和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地指一種玫瑰的花青素還原酶RrANR基 因及其編碼蛋白和應(yīng)用，該基因與植物原花青素合成有關(guān)。
【背景技術(shù)】
[0002] 原花青素（Procyanidins，PAs)是植物界中廣泛存在的一大類多酷類化化合物的 總稱（呂麗爽等，2007)。大量研宄發(fā)現(xiàn)原花青素是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的最強有效的自由基 清除劑之一，其清除氧自由基的能力比常用的天然抗氧化劑，比如類胡蘿卜素、維生素C和 維生素E等都要強很多，它可以保護(hù)植物不受UV的傷害以及真菌的侵染，原花青素含量的 增加可以提高植物的抗氧化能力（Winkel-Shirley, 2002 ;Dixon, 2005 ;Yuan，2013)。國內(nèi) 報道從黑莓、葡萄、荔枝、茶和落葉松等提取原花青素都具有不同程度抗氧化作用（徐懷德 等，2008 ;周瑋婧等，2012 ;王威等，2011 ;姜貴全，2013 ;蔣其鐘，2010)。自由基和氧化應(yīng)激 是導(dǎo)致眾多心血管疾病的重要原因，原花青素可通過強大的抗氧化活性，保護(hù)心血管系統(tǒng)。 動物實驗和臨床研宄表明，原花青素可通過降低膽固醇水平，減少血管壁上的膽固醇沉積， 提高血管彈性來降低血壓（Packeret，1998)。原花青素的抗腫瘤功效國外己有許多研宄報 道，證實原花青素對多種癌細(xì)胞有不同程度的抑制作用，對皮膚癌、口腔癌、肝癌、肺癌、胰 腺癌、胃癌、結(jié)腸癌等均有一定的預(yù)防或治療作用（杜曉芬等，2005)。原花青素的抗癌機 制，主要由于原花青素具有強大的抗氧化和清除自由基的能力，而致癌的誘發(fā)階段與促進(jìn) 階段均與活性氧自由基相關(guān)，原花青素可以抑制誘導(dǎo)癌細(xì)胞生長并誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡。
[0003] 玫瑰（RosarugosaThunb.)是薔薇科薔薇屬落葉叢生灌木，花型秀美，芳香四溢， 色彩絢麗，在中國傳統(tǒng)名花中評價極高，素有"花中皇后"之稱。玫瑰具有重要的經(jīng)濟(jì)價值， 其花瓣果實均含有原花青素，可以提取、分離純化出原花青素，進(jìn)行工藝優(yōu)化，使之更加科 學(xué)化、高效化和產(chǎn)業(yè)化，創(chuàng)造出更大的經(jīng)濟(jì)效益有利于提高產(chǎn)品的附加值，開發(fā)出符合人們 需要的功能食品、保健食品、營養(yǎng)滋補品和藥品等系列產(chǎn)品，使特種資源變成經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢，其 前景將更加廣闊。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題就是提供一種玫瑰的花青素還原酶（Anthocyanidin Reductase)RrANR基因及其編碼蛋白和應(yīng)用。該基因與植物原花青素合成有關(guān)。將該基因 的完整翻譯區(qū)與花椰菜花葉病毒啟動子結(jié)合后直接轉(zhuǎn)入一般植物體，轉(zhuǎn)基因植株的花色發(fā) 生變化，原花青素含量顯著增加，轉(zhuǎn)基因植株的抗氧化能力明顯增強。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的一種玫瑰的花青素還原酶RrANR基因，其核 苷酸序列為SEQIDNo. 1所示，其長度為1020bp。
[0006] 進(jìn)一步地，獲得所述RrANR基因核苷酸序列引物對為：
[0007]P1 正向引物：5' -ATGGCCACCCCCCAACCC-3' ；
[0008]P2 反向引物：5 ' -CTAGCTCTGCAGCTCCCC-3 '。
[0009] 本發(fā)明還提供了一種RrANR基因編碼的花青素還原酶RrANR，其氨基酸序列為由 SEQIDNo. 2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，其長度為339bp。
[0010] 本發(fā)明還提供一種重組表達(dá)載體，它含有權(quán)利要求1所述的原核表達(dá)載體。
[0011] 進(jìn)一步地，所述的原核表達(dá)載體為遺傳轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA2300s。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種含有重組表達(dá)載體的大腸桿菌DH5a表達(dá)菌株。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種含有重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，其特征在于：所述宿主細(xì)胞 為農(nóng)桿菌EHA105。
[0014] 本發(fā)明還提供了下述各項之一在提高植物原花青素合成和增強抗逆性上的應(yīng)用， 包括：
[0015] 1)權(quán)利要求3或4所述的重組表達(dá)載體，
[0016] 2)含有權(quán)利要求3或4所述重組表達(dá)載體的大腸桿菌DHlOBac表達(dá)菌株；
[0017] 3)含有權(quán)利要求3或4所述重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，其特征在于：所述宿主細(xì) 胞為農(nóng)桿菌EHA105。
[0018] 進(jìn)一步地，所述的植物為煙草。
[0019] 本發(fā)明還提供了一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括以下步驟：
[0020] 1)目的基因的克隆；
[0021] 2)植物表達(dá)載體構(gòu)建；
[0022] 3)受體的遺傳轉(zhuǎn)化；
[0023]4)陽性轉(zhuǎn)基因植株的鑒定；
[0024]5)轉(zhuǎn)基因植物表型及生理分析。
[0025] 進(jìn)一步地，所述陽性轉(zhuǎn)基因植株的鑒定的引物對為：
[0026]P3正向引物：5 '-TGAAGGGAGCTTCGATGCTGCTA-3'；
[0027]P4反向引物：5 '-TITCGTCCGCAATCAAGCCTGTG-3'。
[0028] 本發(fā)明可利用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的載體，通過直接DNA轉(zhuǎn) 化、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物技術(shù)方法將本發(fā)明提供的RrANR的編碼基因?qū)胫参锛?xì) 胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。使用本發(fā)明的基因片段構(gòu)建到植物表達(dá)載體 中時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前面可加上任意一種增強啟動子或誘導(dǎo)型啟動子。為了便于對 轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或者植株進(jìn)行鑒定及篩選，可對所使用的載體進(jìn)行加工，如加入具有抗性 的抗生素標(biāo)記物（例如卡那霉素或潮霉素等）。被轉(zhuǎn)化的宿主是包括煙草在內(nèi)的多種植 物，培育不同花色的植物種類。
[0029] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0030] 本發(fā)明將玫瑰中克隆分離得到花青素還原酶基因（RrANR)導(dǎo)入煙草植株中，可以 顯著提高轉(zhuǎn)基因植株中原花青素的含量，從而可以提取、分離純化出更多的原花青素，創(chuàng)造 出更大的經(jīng)濟(jì)效益有利于提高產(chǎn)品的附加值；并且將RrANR轉(zhuǎn)化植株可以增強植物的抗逆 性，為下一步培育具有高含量原花青素高抗氧化性的轉(zhuǎn)基因玫瑰新品種奠定基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0031] 圖1為是本發(fā)明的超量植物表達(dá)載體pCAMBIA2300s結(jié)構(gòu)示意圖；
[0032] 圖2為本發(fā)明的超量植物表達(dá)載體pCAMBIA2300sRrANR構(gòu)建示意圖；
[0033] 圖3為對照早花煙草與轉(zhuǎn)化RrANR基因的早花煙草的花色比較圖；
[0034] 圖中：圖3A為對照早花煙草花色；圖3B為本發(fā)明轉(zhuǎn)RrANR早花煙草的花色；
[0035] 圖4為RrANR基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)量情況圖；
[0036] 圖中：Col為早花煙草（作為轉(zhuǎn)基因早花煙草的對照），#5, #9和#12為3個轉(zhuǎn)基 因株系；
[0037] 圖5為對照早花煙草與轉(zhuǎn)化RrANR基因的早花煙草花瓣花青素含量圖；
[0038] 圖中：Control為早花煙草（作為轉(zhuǎn)基因早花煙草的對照），#5, #9和#12為3個 轉(zhuǎn)基因株系，*，林和林*分別表明P〈〇. 05,P〈0. 01和P〈0. 001的差異水平；
[0039] 圖6為對照早花煙草與轉(zhuǎn)化RrANR基因的早花煙草花瓣原花青素含量圖；
[0040] 圖中：Control為早花煙草（作為轉(zhuǎn)基因早花煙草的對照），#5, #9和#12為3個 轉(zhuǎn)基因株系。*，**和林*分別表明P〈〇. 05,P〈0. 01和P〈0. 001的差異水平；
[0041] 圖7為脫水前后未轉(zhuǎn)化植株和三個轉(zhuǎn)基因株系表型；
[0042] 圖中：圖7A為脫水前后氮藍(lán)四唑（NBT)對超氧陰離子的染色；
[0043] 圖7B為脫水處理后電導(dǎo)率的測定；*，林和林*分別表明P〈0.05,P〈0.01和 P〈0. 001的差異水平；Control為早花煙草（作為轉(zhuǎn)基因早花煙草的對照），#5, #9和#12為 3個轉(zhuǎn)基因株系。
[0044] 圖8為過氧化氫處理未轉(zhuǎn)化植株和三個轉(zhuǎn)基因株系表型；
[0045] 圖中：圖8A為過氧化氫處理后二氨基聯(lián)苯胺（DAB)對過氧化氫染色；圖8B為過氧 化氫處理后丙二醛含量的測定。*，**和林*分別表明P〈〇. 05,P〈0. 01和P〈0. 001的差異 水平；Control為早花煙草（作為轉(zhuǎn)基因早花煙草的對照），#5, #9和#12為3個轉(zhuǎn)基因株 系。
【具體實施方式】
[0046] 為了更好地解釋本發(fā)明，以下結(jié)合具體實施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的主要內(nèi)容，但