用于病毒純化用連續(xù)超速離心的糖溶液配方的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及病毒純化領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 病毒，無論是自然出現(xiàn)的還是其重組體，皆可用于疫苗接種和基因治療領(lǐng)域。許 多病毒或類病毒粒子可以安全并有效地在寄主細(xì)胞中增殖。有數(shù)種公開出版物描述了從 寄主細(xì)胞中提純病毒的技術(shù)，主要集中于特異性的層析基質(zhì)的應(yīng)用，用于由寄主細(xì)胞裂解 物純化病毒（參見，例如，美國專利No. 6, 008, 036)。描述的其他方法，例如，在美國專利 No. 6, 048, 537中描述的方法使用了連續(xù)式蔗糖梯度離心，其提供的產(chǎn)品具有較小的抗原純 度，并且要求進(jìn)一步通過離心提純的步驟。這些方法也還遭受抗原聚集之患，這可以導(dǎo)致病 毒抗原的損失，或者抑制病毒失活步驟。
[0003] 病毒聚集還可能會抑制層析工藝的產(chǎn)率，其時(shí)間和成本要求高，難以適合于大規(guī) 模生產(chǎn)。因此，本發(fā)明的目標(biāo)在于提供一種純化病毒、尤其是從寄主細(xì)胞樣本中純化病毒的 方法，其比較簡單，但仍能以高純度提供全病毒抗原組分，同時(shí)減少病毒抗原聚集。
【附圖說明】
[0004] 圖1 :用普通的超速離心工藝（圖la)和本發(fā)明的超速離心工藝（圖lb)純化的 PMVHs的顯微照片。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供一種用于提純病毒或病毒抗原的方法，其包括：提供病毒制品并在糖 梯度中離心所述病毒制品，其中該糖梯度是由在緩沖水溶液中的濃度為蔗糖當(dāng)量34%至 50% (w/w%)的第一糖層A和濃度為蔗糖當(dāng)量50%至65% (w/w%)的第二糖層B所建立 的，緩沖水溶液中的一種緩沖劑成分是pKa值為6. 0~9. 4的緩沖劑成分；以及從離心液中 收集所述病毒或病毒抗原，即，離心方法的產(chǎn)物。
[0006] 本發(fā)明的一個(gè)方面在于提供一種提純病毒或病毒抗原的方法。該方法涉及到提供 包含糖梯度的溶液，所述糖梯度是通過離心至少一種第一緩沖糖溶液和至少一種第二緩沖 糖溶液而建立的。在第一緩沖糖溶液中的糖濃度具有35%至50% (w/w%)的蔗糖當(dāng)量； 在特定的實(shí)施方式中，蔗糖當(dāng)量為34%至46% (w/w%)。在第二緩沖糖溶液中的糖濃度具 有50%至65% (w/w%)的蔗糖當(dāng)量；在特定的實(shí)施方式中，蔗糖當(dāng)量為50%至60% (w/ W%)。一旦建立起糖梯度，就將病毒制品加至該糖梯度。然后將病毒制品和糖梯度離心以 得到波峰匯集液（peakpool)，并且萃取波峰匯集液以得到病毒或病毒抗原。
【具體實(shí)施方式】
[0007] 在病毒或病毒抗原提純期間，通過離心濃縮病毒或病毒抗原，從而使其與細(xì)胞培 養(yǎng)基成分和/或寄主細(xì)胞和寄主細(xì)胞成分相分離。本發(fā)明的方法能夠在提純的離心步驟中 使病毒聚集和病毒損失最小化。
[0008] 在本發(fā)明的方法中，通常將生理學(xué)緩沖液中的第一糖溶液垂直地加載入連續(xù)超速 離心裝置，從而形成水平的糖溶液層A;然后將在相同或不同的生理學(xué)緩沖液中的更高濃 度的第二糖溶液加載入該裝置，從而形成水平的糖溶液層B。然后啟動該裝置，形成糖梯度。 最大濃度在裝置的外壁，并且濃度朝向裝置的中心逐漸變小。然后將來自細(xì)胞培養(yǎng)物的包 含病毒的收獲液加載入裝置中，并且病毒顆粒會迀移到糖梯度中的位置，在該位置它們的 密度與梯度密度相等。當(dāng)糖是蔗糖時(shí)，出現(xiàn)該平衡的典型密度范圍是36% -48% (w/w% ) 蔗糖。一旦裝置停止，該梯度會向水平位置移動，并且該包含病毒顆粒的梯度部分（或者 "波峰匯集液）"將從裝置中被抽出。
[0009] 本發(fā)明的一個(gè)方面是一個(gè)令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，與慣常的利用單一濃度蔗糖水溶液從 而形成蔗糖梯度的方法相比，其通過利用雙層溶液的方法，能夠增加波峰匯集液的體積。即 使使用蔗糖、并且梯度中的最大蔗糖濃度與在常規(guī)方法中使用的相同，也能得到這一令人 驚奇的效果。通過優(yōu)化兩個(gè)蔗糖溶液層A和B的濃度和含量，能夠增加波峰匯集液體積，例 如，增加兩倍。通過減小全病毒顆?；蚩乖髯缘臐舛?，該增加的波峰匯集液體積可減少它 們的聚集。
[0010] 連續(xù)超速離心工藝對于病毒制品的提純是有用的。高濃度的糖（例如，蔗糖或山 梨糖醇）或者鹽（例如CSCl2或NaBr)的溶液能夠被用于通過超速離心法產(chǎn)生梯度。然而， 不含任何添加劑的糖溶液具有低濃度的電解質(zhì)并且沒有緩沖能力。因此，本發(fā)明的一個(gè)方 面是獲得如下認(rèn)識：糖溶液比如蔗糖溶液中的病毒制品，取決于病毒顆粒的濃度，其具有較 強(qiáng)的形成聚集體的傾向，這會在用于疫苗生產(chǎn)的進(jìn)一步加工中造成問題。通過使用糖溶液 (例如，55%w/w的蔗糖溶液）外加生理學(xué)濃度的鹽（例如，約4-8g/kg的NaCl)以及外加 緩沖液（例如，大約l〇-20mmol/kg的Tris，接著調(diào)節(jié)pH)、從而在梯度中獲得生理學(xué)的電 解質(zhì)以及pH條件，本發(fā)明的方法能夠有效地使這些問題最小化。在特定的實(shí)施方式中，不 同的糖溶液被應(yīng)用以在超速離心機(jī)中構(gòu)造梯度。作為實(shí)施例，將200mL的55%w/w溶液和 800mL的42%w/w溶液加載至超速離心機(jī)。較小量的較高濃度的蔗糖溶液可確保在超速離 心的未尾，最大蔗糖濃度保持在高于45% ;并且大量的42%蔗糖可得到在約40%的范圍內(nèi) 更平緩的梯度，在該處會典型地出現(xiàn)病毒波峰最大值。通過本發(fā)明的這些方法，能夠增加波 峰匯集液的體積，并且因此將病毒顆粒懸浮液稀釋并導(dǎo)致較少的聚集。而且，通過使用這樣 的蔗糖配方，分子或顆粒在加載至超速離心機(jī)的上清液與梯度之間的擴(kuò)散被改進(jìn)。
[0011] 舉例來說，使用在20mmol/kgTris-緩沖液中大約42%和55%(w/w%)的蔗糖溶 液形成的密度梯度被發(fā)現(xiàn)對于流感病毒是特別有用，但還可以容易地適用于其他病毒。對 于pH為6. 5至9. 7的范圍，Tris(三羥甲基氨基甲烷）是有用的緩沖劑。雖然在本發(fā)明的
【具體實(shí)施方式】中的這一特別的實(shí)施例中使用蔗糖，但可以使用適合于梯度離心的其他糖。 另外，可以使用其他的緩沖化合物、尤其是有機(jī)緩沖化合物比如胺類。優(yōu)選緩沖液的pKa值 高于 6、6. 2、6. 4、6. 6、6. 8、7. 2、7. 4、7. 6、7. 8 或 8. 0,并且低于 9. 4、9. 2、9. 0、8. 8、8. 6、8. 4 或 8. 2。合適的緩沖劑包含例如HEPES(4-(2-羥乙基）-1_哌嗪乙烷磺酸）、ACES(N-(2-乙酰 胺基）_2_氨基乙燒橫酸）、二_tris_甲燒或-丙烷、CAPS(N_環(huán)己基_3_氨基丙烷橫酸） 或CAPSO、PIPES(哌嗪-N，N' -二（2-乙基磺酸））、磷酸鹽緩沖劑、或者任何其他在生物化 學(xué)領(lǐng)域中使用的緩沖劑。該緩沖劑優(yōu)選對于生物分子是化學(xué)惰性的。
[0012] 該離心方法能夠產(chǎn)生波峰匯集液組分，其中在就電解質(zhì)和pH條件而言的生理?xiàng)l 件下，病毒顆粒被分散。在波峰匯集液組分中全病毒抗原的濃度能夠通過加入不同量的高 濃度和低濃度糖溶液而改變，以便限定梯度并因此限定波峰組分的體積。另外，通過單獨(dú)添 加鹽和合適的緩沖液（例如，Tris-緩沖鹽水（TBS))也可增加波峰組分的體積，導(dǎo)致抗原 和蛋白質(zhì)的明顯更高的產(chǎn)率。這一效果或許應(yīng)歸因于預(yù)料不到的提高的蛋白質(zhì)和病毒抗原 進(jìn)入包含生理學(xué)濃度的鹽和生理學(xué)pH的糖梯度的流動性。不同的超速離心條件（例如，有 和沒有預(yù)澄清器以及不同的重力荷載）清楚地顯示，通過蔗糖梯度的這些改變，能夠?qū)崿F(xiàn) 顯著的產(chǎn)率提高和病毒顆粒聚集的減少。
[0013]優(yōu)選添加的電解質(zhì)大于 50m0sm/kg、100m0sm/kg、150m0sm/kg、200m0sm/kg或 250m0sm/kg，并且小于 500m0sm/kg、450m0sm/kg、400m0sm/kg或 350m0sm/kg，優(yōu)選約 300m0sm/kg。應(yīng)注意，在不進(jìn)行范霍夫斯（van'tHoffs)因子矯正的情況下，將電解質(zhì) 含量計(jì)算轉(zhuǎn)換為等效的水溶液滲透壓。另外，梯度形成物質(zhì)（例如，蔗糖）的貢獻(xiàn)未被用 于計(jì)算。例如，來自電解質(zhì)的滲透壓計(jì)算如下：8gNaCl/kg/58.44g/mol= 136.9mmol/ kgX2(個(gè)離子 /mol) = 273. 8m0sm/kg+20mM/kgTRISX2 個(gè)離子/mol= 40m0sm/kg;總計(jì) (NaCl+TRIS) 313. 8m0sm/kg)。pH值能夠在生理學(xué)范圍內(nèi)，優(yōu)選在5. 5和9. 5之間；更優(yōu)選 在5. 5和8. 5之間；尤其優(yōu)選高于5. 5、6、6. 5或7并且低于9. 5、9. 0、8. 5、8或7. 5 ;尤其優(yōu) 選在7. 0和7. 5之間或者在7. 0和7. 4之間。
[0014] 在尤其優(yōu)選的實(shí)施方式中，用于產(chǎn)生密度梯度的糖是蔗糖。然而，本發(fā)明預(yù)期還可 使用其他糖，包括醇類糖在內(nèi)。其非限制性的實(shí)施例是山梨糖醇。另外，本發(fā)明預(yù)期可使用 氫化糖、線性糖、改性糖或任何其他糖，只要該糖的水溶性足以產(chǎn)生具有在此限定的密度的 溶液即可。在相同層或不同層中的糖的組合（即，兩種以上的糖）也可以被用于產(chǎn)生在此 描述的梯度，只要組成那些層的對應(yīng)的糖溶液具有在此限定的密度即可。
[0015] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，梯度形成制品的體積相對于超速離心轉(zhuǎn)子或?qū)颖臼┘?離心力的裝置的有效體積的比率是在5%至100%之間，優(yōu)選高于5%、10%、15%、20%、 25%、30%、32%、35%、40%、45%或