對(duì)索拉非尼具有耐藥性或敏感性的人肝癌細(xì)胞系及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于細(xì)胞系領(lǐng)域，特別涉及對(duì)索拉非尼具有耐藥性或敏感性的人肝癌細(xì)胞 系及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 原發(fā)性肝癌具有發(fā)病例高、預(yù)后較差及病死率高等特點(diǎn)，是常見的惡性腫瘤的一 種。據(jù)最新的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，肝癌全球新發(fā)例數(shù)約74. 8萬，死亡病例69.6萬，而其中半數(shù)發(fā)生在 中國(guó)。其發(fā)病例和死亡率在男性腫瘤患者中分別居于第5位，第2位；在女性腫瘤患者中分 別居于第 7 位和第6位（JemalA,&rayF,CenterMM,FerlayJ,WardE, D.Global cancerstatistics, 2011.CACancerJClin2011 ;61 (2) :69-90.陳建國(guó)，陳萬青，張思維， 鄭榮壽，朱健，張永輝.中國(guó)2003-2007年肝癌發(fā)病率與死亡率分析.中華流行病學(xué)雜志 2012 ；33(6) :547-53.) 〇
[0003] 原發(fā)性肝癌起病隱匿，早期缺乏典型癥狀，早期診斷較困難，病程發(fā)展快，進(jìn)展迅 速，確診時(shí)大多數(shù)患者已經(jīng)達(dá)到局部晚期或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，治療困難，預(yù)后很差，嚴(yán)重地威 脅人民群眾的身體健康和生命安全。手術(shù)切除和肝移植是肝癌首選的治療方法，但是大部 分患者化0-70%)確診時(shí)時(shí)已經(jīng)是晚期，失去手術(shù)治療機(jī)會(huì)，只能采用其他治療方案，包括 局部消融，肝動(dòng)脈介入治療（化療和栓塞），放射治療，系統(tǒng)性治療（祀向藥物索拉非尼，W 細(xì)胞毒藥物阿霉素和奧沙利笛為主的聯(lián)合治療方案），中醫(yī)藥治療W及免疫治療等，其中化 學(xué)藥物治療起著重要作用。但是，傳統(tǒng)的化療方案（如阿霉素，笛類藥物等）很難有效延長(zhǎng) 晚期肝癌患者的生存期。
[0004] 索拉非尼（sorafenib，商品名：多吉美，Nexavar)是一種多祀點(diǎn)抑制劑，它能抑制 Raf激酶的活性，阻斷下游E服激酶的磯酸化，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增值；同時(shí)它還祀向血 管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體（Vascularendothelialgrowthfactorreceptor,VEGFR)和血小板 衍生生長(zhǎng)因子受體（plateletderivedgrowthfactorreceptor,PDGFR),從而抑制腫瘤的 血管新生。索拉非尼能抑制肝癌細(xì)胞系的體外增殖，并能抑制送些細(xì)胞的體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)。在 兩個(gè)大型III期臨床實(shí)驗(yàn)中（SHARP和化iental)，索拉非尼的治療都明顯提高了患者的總生 存期和疾病進(jìn)展時(shí)間。因此，2007年美國(guó)FDA和歐洲EAM相繼批準(zhǔn)其用于治療晚期不能手 術(shù)的肝細(xì)胞肝癌，2008年中國(guó)SFDA批準(zhǔn)其用于肝癌治療，是目前臨床用于晚期肝細(xì)胞肝癌 患者的標(biāo)準(zhǔn)化療藥物。
[0005] 然而，索拉非尼的治療效果比較短暫，只能延長(zhǎng)患者數(shù)月的總生存期；大多數(shù)患者 在接受給藥初期，表現(xiàn)良好效果；但是長(zhǎng)期治療后，腫瘤會(huì)出現(xiàn)耐藥，并重新生長(zhǎng)，疾病進(jìn) 展，治療失敗。因此，建立對(duì)索拉非尼耐藥的肝癌模型，并探索相關(guān)耐藥機(jī)制，具有極其重大 的科研價(jià)值和臨床意義。目前，對(duì)索拉非尼的耐藥機(jī)制研究處于起步階段，并且集中在體外 耐藥細(xì)胞系模型上，對(duì)體內(nèi)耐藥的動(dòng)物模型尚無明確報(bào)道。有研究團(tuán)隊(duì)用索拉非尼在細(xì)胞 水平長(zhǎng)期作用于肝癌細(xì)胞系，誘導(dǎo)細(xì)胞耐藥性發(fā)生，并和親本細(xì)胞進(jìn)行比較，尋找體外耐藥 機(jī)制，發(fā)現(xiàn)耐藥細(xì)胞出現(xiàn)Akt和STAT-3等信號(hào)通路的激活，W及EGFR/肥R-3受體的過度活 化，或者出現(xiàn)間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymaltransition,EMT)等，但是并沒有 比較體外誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞在體內(nèi)對(duì)索拉非尼的反應(yīng)性。而在體內(nèi)模型中，有研究團(tuán)隊(duì)將人肝 癌細(xì)胞系Hep3B接種到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，進(jìn)行索拉非尼長(zhǎng)期給藥，誘導(dǎo)體內(nèi)耐藥產(chǎn)生；但 是他們發(fā)現(xiàn)送種耐藥性是不穩(wěn)定的而是可W產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是針對(duì)目前對(duì)索拉非尼耐藥的臨床前肝癌模型 匿乏，難W深入研究肝癌細(xì)胞對(duì)索拉非尼的耐藥機(jī)制W及逆轉(zhuǎn)藥物開發(fā)送一技術(shù)難題，提 供了對(duì)索拉非尼具有耐藥性或敏感性的人肝癌細(xì)胞系及其應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之一是；一種對(duì)索拉非尼具有耐藥性 的人肝癌細(xì)胞系，其保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中必，保藏編號(hào)為CCTCCN0:C2013181。
[0008] 本發(fā)明所述人肝癌細(xì)胞系較佳地還包括如上所述的人肝癌細(xì)胞系的子代細(xì)胞系。
[0009] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之二是；如上所述的人肝癌細(xì)胞系在 制備使免疫缺陷哺乳動(dòng)物產(chǎn)生肝癌的試劑中的用途。
[0010] 本發(fā)明所述的在免疫缺陷哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生肝癌的試劑為本領(lǐng)域常規(guī)的試劑，該試 劑的制備方法較佳地為將本發(fā)明所述人肝癌細(xì)胞系混懸于各種溶劑中即得，所述溶劑為本 領(lǐng)域常規(guī)溶劑，較佳地為皿SS緩沖液，所述皿SS緩沖液的配方為：含500U/ml青霉素G、 500μg/ml硫酸鏈霉素和1. 25μg/ml兩性霉素B。
[0011] 本發(fā)明所述試劑較佳地用于制備肝癌動(dòng)物模型。其中所述肝癌動(dòng)物模型的制備方 法為本領(lǐng)域常規(guī)方法，較佳地包括W下步驟：將所述使免疫缺陷哺乳動(dòng)物產(chǎn)生肝癌的試劑 接種于免疫缺陷缺陷動(dòng)物，進(jìn)行飼養(yǎng)，獲得肝癌動(dòng)物模型。其中所述免疫缺陷哺乳動(dòng)物為本 領(lǐng)域常規(guī)的免疫缺陷哺乳動(dòng)物，較佳地為免疫缺陷小鼠，所述免疫缺陷小鼠較佳地為裸小 鼠或嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠（SCID小鼠），優(yōu)選地為嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠（SCID小鼠）， 其中所述裸小鼠較佳地為NU/NU品系的裸小鼠。
[0012] 其中所述的接種的方式為本領(lǐng)域常規(guī)使用的接種方式。所述接種方式較佳地包括 皮下穿刺接種，原位接種或者腎囊膜內(nèi)接種，優(yōu)選地為皮下穿刺接種。所述接種的細(xì)胞量較 佳地為1. 0~2X1〇7個(gè)細(xì)胞，優(yōu)選地為5. 0X1〇6個(gè)細(xì)胞。所得人肝癌動(dòng)物模型對(duì)索拉非尼 的治療具有耐藥性，是索拉非尼治療耐藥性人肝癌動(dòng)物模型。
[0013] 本發(fā)明所述人肝癌動(dòng)物模型的應(yīng)用方法較佳地為，利用所得人肝癌動(dòng)物模型檢測(cè) 待測(cè)化合物的抑制肝癌活性，將待測(cè)化合物施用于人肝癌動(dòng)物模型，觀察和測(cè)量動(dòng)物的體 重與腫瘤生長(zhǎng)情況；施用后導(dǎo)致人肝癌動(dòng)物模型肝癌癥狀改善或治愈的待測(cè)化合物具有抑 制肝癌活性。
[0014] 其中所述的待測(cè)化合物施用的方法為本領(lǐng)域常規(guī)的施用方法，較佳地包括：尾靜 脈注射、腹腔注射、灌胃、口服和腫瘤局部用藥中的一種或幾種方式施用于肝癌的荷瘤動(dòng) 物。所述實(shí)驗(yàn)中的對(duì)照例較佳地為：同時(shí)使用不含待測(cè)化合物的溶劑施用于肝癌的荷瘤動(dòng) 物作為對(duì)照。
[0015] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之Η是；一種待測(cè)化合物抑制肝癌活 性的檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法包括W下步驟：將待測(cè)化合物施用于細(xì)胞模型中，施用后抑制細(xì) 胞增殖或?qū)е录?xì)胞調(diào)亡的待測(cè)化合物為具有抑制肝癌活性的待測(cè)化合物，其中所述的細(xì)胞 模型是如上所述的人肝癌細(xì)胞系。
[0016] 本發(fā)明所述待測(cè)化合物抑制肝癌活性的檢測(cè)方法為本領(lǐng)域常規(guī)的檢測(cè)方法，所述 檢測(cè)方法較佳地包括W下步驟：
[0017] (1)將本發(fā)明所述人肝癌細(xì)胞系或其子代細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔中，培養(yǎng) 24小時(shí)；
[0018] (2)將待測(cè)化合物稀釋成不同濃度施用于細(xì)胞，化合物作用72小時(shí)后通過測(cè)定細(xì) 胞的活力，計(jì)算不同濃度的待測(cè)化合物對(duì)細(xì)胞的增殖抑制能力，計(jì)算待測(cè)化合物的半數(shù)抑 制濃度，用W判斷待測(cè)化合物的抑制肝癌活性。
[0019] 其中步驟（1)所述人肝癌細(xì)胞系或其子代細(xì)胞的接種量較佳地為5000/孔。其 中步驟（2)所述待測(cè)化合物的半數(shù)抑制濃度的檢測(cè)方法較佳地包括ATP生物發(fā)光法或MTT 法，本發(fā)明所述檢測(cè)方法優(yōu)選地為ATP生物發(fā)光法。所述的ATP生物發(fā)光法是通過對(duì)細(xì)胞 中的ATP進(jìn)行定量測(cè)定來檢測(cè)培養(yǎng)物中活細(xì)胞數(shù)目的一種均質(zhì)檢測(cè)方法，其中所述的ATP 是活細(xì)胞新陳代謝的一個(gè)重要指標(biāo)，所述ATP生物發(fā)光法可W利用市售檢測(cè)試劑盒進(jìn)行。
[0020] 本發(fā)明所述細(xì)胞模型的制備方法為本領(lǐng)域常規(guī)制備方法，其中所述細(xì)胞模型的制 備方法較佳地包括W下步驟：
[0021] (1)獲得新鮮的臨床人肝癌手術(shù)切除標(biāo)本，剪切成小塊，皮下穿刺接種哺乳動(dòng)物； [002引 似穿刺接種70~90天后，將荷瘤動(dòng)物處死，取出腫瘤組織，皮下接種到新的免疫 缺陷小鼠；
[0023] (3)腫瘤形成后，隨機(jī)分為兩組，一組為溶媒對(duì)照組（溶媒具體成分為12. 5%聚氧 己帰藍(lán)麻油（化emphor)，12. 5%己醇和75%無菌水，給藥劑量為10ml/千克動(dòng)物體重，每天 給藥一次，灌胃）；一組為索拉非尼給藥組（給藥方式為40毫克/千克動(dòng)物體重，每天給藥 一次，灌胃）；
[0024] (4)從溶媒對(duì)照組的荷瘤鼠和索拉非尼給藥組的治療耐藥荷瘤鼠中，分離腫瘤組 織，進(jìn)行癌細(xì)胞的原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。
[00巧]所得人肝癌細(xì)胞系對(duì)索拉非尼的治療耐藥性，利用該細(xì)胞系可W制備索拉非尼體 內(nèi)治療耐藥性細(xì)胞模型。
[0026] 其中步驟（1)所述的新鮮的臨床人肝癌手術(shù)切除標(biāo)本，較佳地處理方法為：剪切 成20~50mg的小塊。其中所述的哺乳動(dòng)物為本領(lǐng)域常規(guī)的哺乳動(dòng)物，較佳地為免疫缺陷 小鼠或裸小鼠，所述免疫缺陷小鼠較佳地為嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠（SCID小鼠）。其中所 述的新鮮的臨床人肝癌切除標(biāo)本的處理方式較佳地為；用新鮮的皿SS緩沖液（含500U/ml 青霉素G、500μg/ml硫酸鏈霉素和1. 25μg/ml兩性霉素B)漂洗。
[0027] 其中步驟（4)所述的原代培養(yǎng)方法是常規(guī)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法。所 述的原代培養(yǎng)方法較佳地包括W下步驟：將腫瘤組織剪切成小塊，置入培養(yǎng)瓶中，于37°C 賠箱5%C〇2條件下培養(yǎng)；次日，將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉(zhuǎn)平放，向瓶?jī)?nèi)加入DMEM/F12培養(yǎng)液（含 lOng/ml重組人表皮生長(zhǎng)因子，10μg/ml重組人膜島素，6. 7ng/ml亞砸酸鋼，5. 5μg/ml轉(zhuǎn) 鐵蛋白，2μg/ml己醇胺，0.1%牛血清白蛋白，100U/ml青霉素G、100μg/ml硫酸鏈霉素和 0. 25μg/ml兩性霉素B)，靜置培養(yǎng)。
[0028] 其中步驟（4)所述的傳代培養(yǎng)方法是常規(guī)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的傳代培養(yǎng)方法。所述 細(xì)胞傳代培養(yǎng)方法較佳地包括W下步驟；吸棄舊培養(yǎng)液，向瓶中加入新鮮的0. 05%膜蛋白 酶溶液，待細(xì)胞脫落后，加入新鮮的DMEM/F12培養(yǎng)液，仔細(xì)吹打，使之脫離瓶壁形成細(xì)胞懸 液；少量在瓶壁上變圓但沒有脫落的細(xì)胞，用無菌細(xì)胞