W單位體積的酶液在單位時(shí)間內(nèi)酶解產(chǎn)生對(duì)硝基苯酪（pN巧的生成量 進(jìn)行酶活力的計(jì)算。具體方法如下：預(yù)先配置底物和緩沖液，底物；6mg/mLpNPP(異丙醇溶 解）（同樣配置6mg/mLpNPB)，緩沖液；0. 05M化is(P冊(cè).0,0. 1 %阿拉伯膠）。將底物和緩 沖液W1:9 (v/v)配成反應(yīng)混合液。取兩個(gè)2mL離必管，分別為對(duì)照管和樣品管。分別添加 400μL反應(yīng)混合液至兩離必管，在合適的反應(yīng)溫度（例如35°C)預(yù)溫浴5min。向樣品管中 加入一定量的稀釋酶液，混合均勻后，繼續(xù)溫浴15min。加入1. 5mL己醇至上述兩離必管終 止反應(yīng)，并添加同樣量的稀釋酶液至對(duì)照管。W1200化pm離必2min，取上清，測(cè)405皿處的 吸光值。
[0128] 酶活力單位定義為；1個(gè)單位即指在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)條件下每分鐘催化 釋放1μmol的pNP所需的酶量。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得酶活力計(jì)算公式為；A =-([A1-A0]X0. 7885-0. 0118)XVIXη/ (V2Xt)。A;樣品酶活扣/mL)，A1 ;樣品酶液的 0D405,A0 ;對(duì)照酶液的0D405,VI;總反應(yīng)液的體積（mL)，η;酶液的稀釋倍數(shù)，V2 ;酶液的體 積（mL)，t;反應(yīng)時(shí)間（min)。 陽(yáng)12引最淀反.應(yīng)溫.麼
[0130] 在不同的溫度（〇-5(TC)下按照上述pNPP法測(cè)定化2的脂肪酶活力，W測(cè)定活力 最高時(shí)的酶活力為100%，計(jì)算其他溫度下的相對(duì)酶活力（％)。按照相同方法測(cè)定WpNPB 為底物時(shí)的最適溫度。由圖2可見，F(xiàn)L2的酶學(xué)活力隨著溫度的提高呈現(xiàn)先上升后下降的 趨勢(shì)，WpNPP為底物時(shí)，其中4(TC左右酶活最高，為其最適作用溫度；WpWB為底物時(shí)，最 適作用溫度為3(TC左右。
[0131] 最淀反.應(yīng)地
[0132] 分別在不同抑(3. 0-10. 0)的緩沖液中，在35°C的溫度下按上述pNPP法測(cè)定化2 酶液的脂肪酶活力。W測(cè)定活力最高時(shí)的酶活力為100%，計(jì)算其他抑下酶的相對(duì)活力 (% )。由圖3可見，F(xiàn)L2的酶活力隨著抑值的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，pH<7時(shí)酶活 力接近零（未顯示數(shù)據(jù)），其中抑9. 5時(shí)酶活力最高。因此，F(xiàn)L2的最適抑在9. 5左右。由 此推斷，本發(fā)明所述的脂肪酶為堿性脂肪酶。 陽(yáng)13引地穩(wěn)定巧
[0134]將FL2酶液分別在不同抑(3. 0-11. 0)的緩沖體系中于4°C保溫24小時(shí)，再于 35Γ、pH8. 0下按pNPP法測(cè)定脂肪酶的活力。在酶活力最高的緩沖液中所測(cè)得的酶活力為 100%，計(jì)算其他抑下的相對(duì)酶活力。由圖4可見，F(xiàn)L2多膚在較寬抑范圍內(nèi)（5.0-10.0) 保持穩(wěn)定，酶活力在80% -100%區(qū)間內(nèi)變動(dòng)。在抑< 5. 0和抑> 10. 0時(shí)脂肪酶活力下 降較快，例如抑為11.0時(shí)，脂肪酶活力降至小于20%。 巧] 胎肪酶水解底物的特異巧-胎肪酸專一'1~牛
[0136] 配制6mg/mL4-硝基苯基了酸醋（pNPB)、4-硝基苯基辛酸醋（pNPO)、4-硝基苯基 月桂酸醋（pNPD)、4-硝基苯基肉豆護(hù)酸醋（pNPM)、4-硝基苯基蹤擱酸醋（pNP巧和4-硝基 苯基硬脂酸醋（pNP巧，用異丙醇溶解，按照標(biāo)準(zhǔn)pNPP法（更換為相應(yīng)底物）檢測(cè)脂肪酶的 活力，W酶活測(cè)定最高的底物所測(cè)得的酶活力為100%，計(jì)算水解其他底物的相對(duì)酶活力。 由圖5可見，F(xiàn)L2對(duì)于4-硝基苯基了酸醋的水解效果最優(yōu)，隨著脂肪酸碳鏈增長(zhǎng)，酶活力急 劇下降。 陽(yáng)"7] 余屬離子對(duì)脂肪酶活力的影響
[0138]配制aiS〇4、MnClz、C0CI2、CaClz、MgS〇4、CuS〇4、KC1、（畑4)2SO4、NaCl、NiS04、FeCls和邸TA等無機(jī)鹽膽存液。按照上述pNPP方法，首先配制反應(yīng)混合液，向每個(gè)反應(yīng)管中分裝 400μL混合液，并添加終濃度為5mmol/L的無機(jī)鹽膽存液，再按照上述方法測(cè)定酶活性。對(duì) 照組添加水代替無機(jī)鹽膽存液，其酶活力作為100%，計(jì)算其余組相對(duì)于對(duì)照組的相對(duì)酶活 力。將底物換為pNPB，按照相同方法測(cè)定金屬離子的影響。如圖6所示，除KC1夕bWpNPP 和pNPB分別作為底物測(cè)試其他離子對(duì)于FL2脂肪酶活力的影響時(shí)，pNPP和pNPB之間區(qū)別 不大。但是，WpNPB為底物時(shí)，KC1對(duì)酶活影響不大，WpNPP為底物時(shí)，脂肪酶活力提高至 兩倍，說明KC1對(duì)pNPP的水解有促進(jìn)作用。另外，如圖6的結(jié)果顯示，F(xiàn)L2對(duì)于二價(jià)離子沒 有依賴性。 陽(yáng)13引 表面活巧劑對(duì)于胎肪酶活力的影響
[0140] 配置10%的陽(yáng)離子表面活性CTAB、陰離子表面活性劑SDS、非離子表面活性劑 TweenSO、AE0-9和TritonX-100等膽存液。按照pNPP標(biāo)準(zhǔn)方法，同時(shí)在反應(yīng)體系中添加 0. 5 %的上述表面活性劑，測(cè)定脂肪酶活力。對(duì)照組添加水代替表面活性劑，其酶活力作 為100%，計(jì)算其余組相對(duì)于對(duì)照組的相對(duì)酶活力。將底物替換為pNPB，按照相同方法測(cè) 定表面活性劑的影響。如圖7所示，SDS和CTAB強(qiáng)烈抑制脂肪酶的活力，TweenSO、AE0-9 和TritonX-100對(duì)脂肪酶的影響根據(jù)反應(yīng)底物的不同而不同，WpNPP為底物時(shí)，Triton X-100、AE0-9在一定程度上提高酶活力，TweenSO抑制酶活力，WpWB為底物時(shí)結(jié)果相反， TritonX-100、AE0-9抑制酶活力，TweenSO提高酶活力。
[0141] 由W上的結(jié)果可知，本發(fā)明的多膚具有脂肪酶活性，和/或具有W下至少一種有 益特性：
[0142] 1)短鏈偏好性，如圖5所示，W4-硝基苯基了酸醋作為底物時(shí)，F(xiàn)L2顯示了最高的 酶活性。
[0143] 2)在很廣泛的抑范圍內(nèi)具有很好的酶活力和穩(wěn)定性，如圖4所示，F(xiàn)L2多膚在較 寬抑范圍內(nèi)巧.0-10.0)保持穩(wěn)定，酶活力均在在約80%W上。
[0144] 3)具有一定的表面活性劑耐受性，如圖7所示，WpNPP為底物時(shí)，在化iton X-100、AE0-9存在下，F(xiàn)L2多膚的酶活力提高；WpNPB為底物時(shí)，在TweenSO存在下，F(xiàn)L2多 膚的酶活力基本不變甚或增加。
[0145] 4)在鐘離子存在下表現(xiàn)出較的高酶活力，如圖6所示，在KC1存在下，F(xiàn)L2催化 pNPP水解的活力增加約1倍W上。
[0146] 可W理解，盡管本申請(qǐng)W某種形式被說明，但本申請(qǐng)并不局限于本說明書中所顯 示和描述的內(nèi)容。對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的是，在不偏離本申請(qǐng)的范圍的前提下還 可做出各種變化。送些變化都在本申請(qǐng)要求保護(hù)的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 具有脂肪酶活性的多肽，其包含選自以下的序列或由選自以下的序列組成： (a) 如SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列，以及 (b) 由（a)所述的序列經(jīng)過取代、缺失或添加至少一個(gè)氨基酸后得到的序列， 其中由（b)獲得的多肽變體仍保持脂肪酶活性。2. 如權(quán)利要求1所述的多肽，其包含SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列，優(yōu)選地，所述多 肽由SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列組成。3. 編碼權(quán)利要求1或2所述的多肽的多核苷酸，其包含選自以下的序列或由選自以下 的序列組成： (a) 核苷酸序列，其編碼如權(quán)利要求1(a)或1(b)所述的氨基酸序列；以及 (b) 在嚴(yán)格條件下與3(a)中的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。4. 如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其包含SEQIDNO:2所示的核苷酸序列，優(yōu)選地，所 述多核苷酸由SEQIDN0:2所示的核苷酸序列組成。5. 如權(quán)利要求3或4所述的多核苷酸，其通過人工合成產(chǎn)生或重組產(chǎn)生。6. 表達(dá)載體，其包含至少一種權(quán)利要求3-5中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。7. 如權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體，其還包含調(diào)節(jié)所述多核苷酸表達(dá)的調(diào)控序列，其中 所述多核苷酸與所述調(diào)控序列可操作地連接，優(yōu)選地，所述表達(dá)載體為pET24a(+)。8. 宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求3-5中任一項(xiàng)所述的多核苷酸或權(quán)利要求6或7所述的 表達(dá)載體，優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌BL21 (DE3)。9. 制備權(quán)利要求1或2所述的多肽的方法，其包括： 1) 將權(quán)利要求3-5中任一項(xiàng)所述的多核苷酸克隆在表達(dá)載體上， 2) 將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)至合適的宿主細(xì)胞中， 3) 在合適的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞， 4) 從所述宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基中分離并純化所述多肽。10. 權(quán)利要求1或2所述的多肽在制備乳制品中的用途。
【專利摘要】本發(fā)明提供了新的具有脂肪酶活性的多肽，其包含如SEQ？ID？NO:1所示的氨基酸序列或在上述序列中包含至少一個(gè)氨基酸取代、缺失或添加的序列。本發(fā)明還提供了編碼所述多肽的多核苷酸、含有該多核苷酸的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞，以及生產(chǎn)上述多肽的方法。此外，還涉及上述具有脂肪酶活性的多肽的用途。
【IPC分類】C12N1/21, C12N9/20, C12N15/55, C12N15/70
【公開號(hào)】CN105331593
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410360558
【發(fā)明人】叢芳, 陳苗苗, 馮奇, 許駿
【申請(qǐng)人】豐益(上海)生物技術(shù)研發(fā)中心有限公司
【公開日】2016年2月17日
【申請(qǐng)日】2014年7月25日