IDN0:2所示的核巧酸序 列。
[0072] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核巧酸由與SEQIDN0:2所示的核巧酸序列具 有 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或 100% 同源性的核巧酸序列 組成。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核巧酸由SEQIDN0:2所示的核巧酸序列組成。 [007引本文使用的術(shù)語"多核巧酸"或"核酸"指mRNA、RNA、cRNA、cDNA或DNA，包括單鏈 和雙鏈形式的DNA。該術(shù)語通常指至少10個(gè)堿基長度的核巧酸多聚形式，所述核巧酸是核 糖核巧酸或脫氧核巧酸或任一類型的核巧酸的修飾形式。
[0074] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核巧酸包含與編碼FL2多膚及其功能等同變體的 核巧酸序列在嚴(yán)格條件下雜交的核巧酸序列，或者由與編碼FL2多膚及其功能等同變體的 核巧酸序列特異性雜交且編碼與FL2多膚在功能上等同的多膚的核巧酸序列組成。
[0075] 本領(lǐng)域技術(shù)人員可W常規(guī)選擇DNA雜交的嚴(yán)格條件。通常較長的探針需要較高的 溫度，W便進(jìn)行適當(dāng)?shù)耐嘶?，而較短的探針需要較低的溫度。雜交通常取決于當(dāng)互補(bǔ)鏈處于 低于其解鏈溫度的環(huán)境時(shí)變性DNA的重退火能力。探針與可雜交序列之間同源性程度越 高，所能采用的相對(duì)溫度越高。于是，較高的相對(duì)溫度往往使反應(yīng)條件更嚴(yán)格，而在較低的 溫度下，則嚴(yán)格度較低。關(guān)于雜交反應(yīng)嚴(yán)格條件的詳細(xì)描述，可參閱Ausubel等，化rrent ProtocolsinMolecularBiology,WileyIntersciencePublishers, (1995)。
[0076] 在某些實(shí)施方案中，DNA雜交采用的嚴(yán)格條件包括；1)洗涂時(shí)采用低離子強(qiáng)度 和高溫，例如5(TC下的0. 015M氯化鋼/0. 0015M巧樣酸鋼/0. 1%十二烷基硫酸鋼；2)雜 交時(shí)采用甲醜胺等變性劑，例如42°C下50% (v/v)甲醜胺加0.1%牛血清白蛋白/0.1% Ficoll/0. 1%聚二帰化咯焼麗/p冊(cè).5的50mM磯酸鋼緩沖液W及750mM氯化鋼、75mM巧樣 酸鋼；或做在42°C下過夜雜交，雜交溶液含50%甲醜胺，5xSS"0.75M氯化鋼，0.075M朽 1樣酸鋼）、50mM磯酸鋼（P冊(cè).8)、0. 1%焦磯酸鋼、5xDenhar化'S溶液、超聲波處理的娃魚精 子DNA巧0.mu.g/ml)、0. 1 %SDS和10 %硫酸葡聚糖，然后在0. 2xSSC(氯化鋼/巧樣酸鋼） 中于42°C洗涂10分鐘，再W含有邸TA的0.lxSSC于55°C進(jìn)行高嚴(yán)格度洗涂。中等嚴(yán)格 條件可按Sambrook等，MolecularCloning：ALaboratoryManual,NewYork：ColdSpring HarborPress, 1989中的描述加W確定。中等嚴(yán)格條件包括采用嚴(yán)格度低于W上描述的洗 涂溶液和雜交條件（如溫度、離子強(qiáng)度和SDS百分比）。例如，中等嚴(yán)格條件包括用至少約 16%v/v到至少約30%v/v的甲醜胺和至少約0. 5M到至少約0. 9M的鹽在42°C雜交，W及 用至少約0. 1M到至少約0. 2M鹽在55°C洗涂。中等嚴(yán)格條件還可W包括用1%牛血清白蛋 白度SA)、lmMEDTA、0. 5M化HP04(pH7. ^、7%SDS在 65°C雜交，W及用a)2XSSC、0. 1% SDS;或（U)0. 5%BSAUmM邸TA、40mMNaHP04(pH47. 2)、5%SDS在 60-65°C洗涂。專業(yè)人 員將會(huì)根據(jù)探針長度等因素調(diào)節(jié)溫度、離子強(qiáng)度等。雜交核酸時(shí)的嚴(yán)格度取決于核酸分子 長度和互補(bǔ)程度，W及其它本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的變量。兩個(gè)核巧酸序列之間的相似性或同 源性越大，則含有送些序列的核酸雜合體的Tm越大。核酸雜交的相對(duì)穩(wěn)定性（對(duì)應(yīng)于較高 的Tm)W下列順序遞減：RNA:RNA、DNA:RNA，DNA:DNA。優(yōu)選地，可雜交核酸的最低長度至少 約為12個(gè)核巧酸，優(yōu)選至少約為16個(gè)、更優(yōu)選至少約為24個(gè)、最優(yōu)選至少約為36個(gè)核巧 酸。
[0077]本發(fā)明的多核巧酸可W與其他DNA序列組合，所述其他DNA序列例如啟動(dòng)子、聚腺 巧化信號(hào)、其他限制性酶切位點(diǎn)、多克隆位點(diǎn)、其他編碼節(jié)段等，使得它們的總長度可W顯 著不同。因此考慮可W利用幾乎任意長度的多核巧酸片段；總長度優(yōu)選地受預(yù)期重組DNA 方案中制備和使用的便利性的限制。
[007引可W利用本領(lǐng)域內(nèi)已知的和可獲得的多種成熟技術(shù)中的任何一種來制備、操控和 /或表達(dá)多核巧酸及其融合物。例如，編碼本發(fā)明的多膚或其變體的多核巧酸序列可W用于 重組DNA分子中W指導(dǎo)多膚在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中表達(dá)。由于遺傳密碼子固有的簡并性，編 碼基本上相同或在功能上等同的氨基酸序列的其他DNA序列也可W用于本發(fā)明中，并且送 些序列可W用于克隆和表達(dá)給定的多膚。
[0079] 此外，可W使用本領(lǐng)域內(nèi)公知的方法改造本發(fā)明的多核巧酸序列，包括但不限于 基因產(chǎn)物的克隆、加工、表達(dá)和/或活性的改變。
[0080] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核巧酸通過人工合成產(chǎn)生，例如直接的化學(xué)合成 或酶合成。在可選的實(shí)施方案中，上述多核巧酸通過重組技術(shù)產(chǎn)生。
[0081] 在某些實(shí)施方案中，可W通過常規(guī)方法優(yōu)選如雙脫氧鏈終止法（Sangeret al.PNAS，1977, 74:5463-5467)測定所獲得的多核巧酸的序列。送類多核巧酸序列測定也可 用購買的測序試劑盒來完成。為了獲得全長的cDNA序列，測序需反復(fù)進(jìn)行。有時(shí)需要測定 多個(gè)克隆的cDNA序列，才能拼接成全長的cDNA序列。
[0082] 表武裁體
[0083] 本申請(qǐng)?zhí)峁┝税景l(fā)明的多核巧酸的表達(dá)載體。
[0084] 本發(fā)明所述的"表達(dá)載體"是重組或合成產(chǎn)生的核酸構(gòu)建體，其具有一系列允 許特定的核酸在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的特異性核酸元件。本發(fā)明的表達(dá)載體可W是諸如 pET-24a(+)、pIRES2-EGFP、pcDNA3.l、pCI-neo、pDC516、pVAC、pcDNA4. 0、pGEM-T、pDC315 的 質(zhì)粒載體，或者是諸如腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、semliki森林病毒（sFv)載體的病 毒載體，或者是本領(lǐng)域熟知的其它載體。
[0085] 在某些實(shí)施方案中，編碼FL2多膚及其變體的多核巧酸序列被克隆到載體中，W 構(gòu)成含有本發(fā)明所述多核巧酸的重組載體。
[0086] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于克隆多核巧酸的表達(dá)載體為質(zhì)粒載體。在更優(yōu)選的實(shí) 施方案中，所述質(zhì)粒載體為祀T-24a(+)。
[0087] 在具體的實(shí)施方案中，上述表達(dá)載體還包含調(diào)節(jié)多核巧酸表達(dá)的調(diào)控序列，其中 所述多核巧酸與所述調(diào)控序列可操作地連接。
[0088] 本文所用的術(shù)語"調(diào)控序列"是指實(shí)現(xiàn)與其連接的編碼序列表達(dá)所需的多核巧酸 序列。送類調(diào)控序列的性質(zhì)隨宿主生物而改變。在原核生物中，送類調(diào)控序列一般包括啟動(dòng) 子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和終止子；在真核生物中，送類調(diào)控序列一般包括啟動(dòng)子、終止子W及 在某些情況下的增強(qiáng)子。因此，術(shù)語"調(diào)控序列"包括其存在對(duì)目的基因的表達(dá)是必需的最 低限度的所有序列，也可W包括其存在對(duì)目的基因表達(dá)是有利的其它序列，例如前導(dǎo)序列。
[0089] 本文所用的術(shù)語"可操作地連接"是指如下情形：所涉及到的序列處于允許它們W 希望的方式起作用的關(guān)系之中。因此，例如"可操作地連接"到一編碼序列的調(diào)控序列使得 在與所述調(diào)控序列相容的條件下實(shí)現(xiàn)該編碼序列的表達(dá)。
[0090] 在某些實(shí)施方案中，利用本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法構(gòu)建包含編碼FL2多膚 及其變體的核巧酸序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯調(diào)控元件的表達(dá)載體。送些方法包括體外重 組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等（Samb;roook,etal.MolecularCloning,a L油oratoryManual,coldSpring化rborL油oratory.化wYork, 1989)。核巧酸序列可操 作地連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，W指導(dǎo)mRNA合成。送些啟動(dòng)子的代表性實(shí)例包 括；大腸桿菌的lac或trp啟動(dòng)子；λ瞻菌體的化啟動(dòng)子；真核啟動(dòng)子包括CMV立即早期 啟動(dòng)子、HSV胸巧激酶啟動(dòng)子、早期和晚期SV40啟動(dòng)子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其它一些已知 的可控制基因在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞或其病毒中表達(dá)的啟動(dòng)子。表達(dá)載體還包括翻譯起始 用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子等。在載體中插入增強(qiáng)子序列將會(huì)使其在高等真核細(xì)胞 中的轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA表達(dá)的順式作用因子，通常大約有10到300個(gè)堿基對(duì)， 作用于啟動(dòng)子W增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄。實(shí)例包括在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的100到270個(gè)堿基對(duì) 的SV40增強(qiáng)子、在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的多瘤增強(qiáng)子W及腺病毒增強(qiáng)子等。
[0091] 此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，W提供用于選擇轉(zhuǎn)化的 宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氨葉酸還原酶、新霉素抗性W及綠色英光蛋 白（GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨予青霉素抗性等。
[0092] 宿豐細(xì)胸
[0093] 本申請(qǐng)?zhí)峁┝税景l(fā)明的多核巧酸或表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
[0094] 在某些實(shí)施方案中，將編碼FL2多膚及其