變體的多核巧酸或含有該多核巧酸的表 達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)入宿主細(xì)胞,獲得含有該多核巧酸或表達(dá)載體的基因工程化宿主細(xì)胞。
[0095] 本文所用的宿主細(xì)胞可W是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任一種宿主細(xì)胞,包括原核細(xì) 胞、真核細(xì)胞,例如細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或植物細(xì)胞等。 示例性的細(xì)菌細(xì)胞包括埃希氏菌屬、桿菌屬、鏈霉菌屬、沙口氏菌屬、假單胞菌屬和葡萄球 菌屬中的任何種,包括例如大腸桿菌、乳酸球菌、枯草芽抱桿菌、蠟狀芽胞桿菌、鼠傷寒沙口 氏菌、英光假單胞菌。示例性的真菌細(xì)胞包括曲霉屬的任何種。示例性的酵母細(xì)胞包括畢 赤酵母屬、啤酒酵母菌屬、裂殖酵母屬或酵母菌屬中的任何種,包括畢赤酵母、啤酒酵母或 裂殖酵母。示例性的昆蟲細(xì)胞包括斜紋夜蛾或果觸中的任何種,包括果觸S2和斜紋夜蛾 S巧。示例性的動(dòng)物細(xì)胞包括CH0、COS或黑色素瘤或任何小鼠或人細(xì)胞系。選擇合適的宿 主在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。
[0096] 可W利用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)將表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中,包括轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、 轉(zhuǎn)染、病毒感染、基因槍或Ti-介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。具體的方法包括磯酸巧轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚 糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂轉(zhuǎn)染或電穿孔等值avis,L.,Dibne;r,M. ,Battey,I.,BasicMethodsin MolecularBiology, (1986))。作為示例,當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí),可在指數(shù)生長 期后收獲感受態(tài)細(xì)胞,用本領(lǐng)域熟知的化C12法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
[0097] 在具體的實(shí)施方案中,本發(fā)明所用的宿主細(xì)胞為大腸桿菌。在優(yōu)選的實(shí)施方案中, 將攜帶本發(fā)明多核巧酸序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌化21 (DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。
[0098] 本發(fā)明的《化的制各方法
[0099] 本發(fā)明的多膚可W通過本領(lǐng)域人員已知的任何合適的方法制備,例如通過重組技 術(shù)產(chǎn)生,或者化學(xué)合成。產(chǎn)生重組膚的方法是本領(lǐng)域已知的。膚的化學(xué)合成方法也為本領(lǐng) 域技術(shù)人員所熟知,例如,可w通過使用固相技術(shù)的定向膚合成來產(chǎn)生本發(fā)明的多膚及其 變體(Merrifield,J.Am.Chem.Soc. 85:2149-2154(1963))??蒞用手動(dòng)或通過自動(dòng)化來進(jìn)行 蛋白合成。例如,可W用AppliedBiosystems的431A膚合成儀(PerkinElmer)實(shí)現(xiàn)自動(dòng) 化合成??蛇x擇地,不同的片度可W分別通過化學(xué)方式合成并利用化學(xué)方法進(jìn)行組合W制 備所需的分子。
[0100] 本發(fā)明的多膚與異源多膚融合所產(chǎn)生的融合蛋白也可W通過常規(guī)手段獲得,例如 通過使編碼所述融合蛋白的核巧酸序列在合適的酵母細(xì)胞中進(jìn)行基因表達(dá)。如果需要,能 夠使用終標(biāo)簽(eventualtag)來分離或純化所述融合蛋白。
[0101] 在具體的實(shí)施方案中,提供了制備本發(fā)明的多膚的方法,其包括:
[0102] 1)將編碼本發(fā)明多膚的多核巧酸克隆在表達(dá)載體上,
[0103] 2)將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)至合適的宿主細(xì)胞中,
[0104] 3)在合適的培養(yǎng)基中,培養(yǎng)宿主細(xì)胞,
[0105] 4)從所述宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基中分離并純化所述多膚
[0106] 合適的宿主細(xì)胞是指適于表達(dá)載體或目的多核巧酸表達(dá)的宿主細(xì)胞。合適的培養(yǎng) 基指適于宿主細(xì)胞生長或?qū)ζ溥M(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)的培養(yǎng)基。
[0107] 在某些實(shí)施方案中,根據(jù)所用的宿主細(xì)胞,可W選擇各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主 細(xì)胞生長的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。優(yōu)選地,工程化的宿主細(xì)胞可W在被修飾適于激活啟動(dòng)子的 常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),W篩選轉(zhuǎn)化子或擴(kuò)增本發(fā)明的多核巧酸。轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì) 胞并當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后,用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo) 選擇的啟動(dòng)子,將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間,W允許其生產(chǎn)目的多膚或其片段。
[0108] 在某些實(shí)施方案中,通過離必收獲宿主細(xì)胞,通過物理或化學(xué)方法破碎細(xì)胞,并且 將得到的粗提物保留用于進(jìn)一步純化。用于蛋白表達(dá)的微生物細(xì)胞可W通過任何便利的方 法進(jìn)行破碎,包括凍融循環(huán)、超聲、機(jī)械破碎或使用細(xì)胞裂解劑。送些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人 員熟知的。
[0109] 在某些實(shí)施方案中,宿主細(xì)胞生產(chǎn)的重組多膚可包被于細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表 達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要,可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分 離和純化重組的蛋白。例如,表達(dá)的多膚或其片段可W通過本領(lǐng)域熟知的W下方法從重組 細(xì)胞培養(yǎng)物中回收并純化;常規(guī)的復(fù)性處理、蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離必、滲透破 菌、超聲波處理、超離必、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析 0PLC)和其它各種液相層析技術(shù)及送些方法的結(jié)合。作為示例性說明,在C-末端或N-末 端包含膚標(biāo)簽(例如化S-標(biāo)簽等)的蛋白的親和色譜法純化是用于獲得高純度多膚制劑 的常規(guī)方法。
[0110] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中,提供了制備由SEQIDN0:1所示的氨基酸序列組成的多 膚的方法,其包括;將由SEQIDN0:2所示的核巧酸序列組成的多核巧酸克隆在表達(dá)載體 pET24a(+)中,W及將帶有該多核巧酸序列的祀T24a(+)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌化2UDE3)進(jìn)行誘 導(dǎo)表達(dá),然后從大腸桿菌化21 0E3)中分離并純化FL2多膚。 ?!璢縣有胎肪酶活巧的《化的府巧
[0112] 本發(fā)明的多膚是具有脂肪酶活性的多膚,能夠催化油脂的水解,特別是催化乳脂 肪的水解。更具體地,本發(fā)明的多膚能夠水解脂肪酸和甘油居基之間的醋鍵。
[0113] 在一些實(shí)施方案中,本發(fā)明的多膚為具有短鏈偏好性的脂肪酶,能夠用于產(chǎn)生和/ 或強(qiáng)化乳制品的香味。
[0114] 因此,本申請?zhí)峁┝吮景l(fā)明的多膚在制備乳制品中的用途。在優(yōu)選的實(shí)施方案中, 上述乳制品為乳酪。
[0115] 本說明書和權(quán)利要求書中,詞語"包括"、"包含"和"含有"意指"包括但不限于", 且并非意圖排除其他部分、添加物、組分、或步驟。
[0116] 應(yīng)該理解,在本發(fā)明的特定方面、實(shí)施方案或?qū)嵤├忻枋龅奶卣鳌⑻匦?、組分或 步驟,可適用于本文所描述的任何其他的方面、實(shí)施方案或?qū)嵤├?,除非與之矛盾。
[0117] 上述公開內(nèi)容總體上描述了本發(fā)明,通過下面的實(shí)施例進(jìn)一步示例本發(fā)明。描述 送些實(shí)施例僅為說明本發(fā)明,而不是限制本發(fā)明的范圍。盡管本文中使用了特殊的術(shù)語和 值,送些術(shù)語和值同樣被理解為示例性的,并不限定本發(fā)明的范圍。除非特別指明,本說明 書中的實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法和技術(shù)。
[om]實(shí)施例
[0119] 實(shí)施例1 ;FL2多膚的表達(dá)和純化
[0120]SEQIDNO. : 2所示的核巧酸序列(其編碼序列如SEQIDNo. : 1所示的多膚)由 生工生物工程(上海)股份有限公司合成,并被該公司克隆在表達(dá)載體祀T24a(+)上。 [012。 將帶有該核巧酸序列的祀T24a(+)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌化21 0E3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá) (具體參見,分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第Η版,科學(xué)出版社2002[美]J.薩姆布魯克,化W拉塞爾 著,黃培堂等譯),轉(zhuǎn)化條件如下:42Γ下熱激50砂,冰浴2分鐘,涂LB平板,挑取轉(zhuǎn)化子接 種在LB培養(yǎng)基(蛋白腺lOg/L、酵母提取物5g/L和氯化鋼lOg/L)中,于37°C進(jìn)行過夜種 子培養(yǎng),按1 %的接種量,將種子培養(yǎng)液接種到表達(dá)培養(yǎng)基中,于37°C、220rpm培養(yǎng)至0D600 =0. 6-0. 8。
[012引冷卻至2(TC后,加入異丙基-目-D-硫代化喃半乳糖巧(IPTG)O.ImM進(jìn)行誘導(dǎo),于 2(TC、190rpm過夜表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后,離必收集菌體。用裂解緩沖液巧OmM磯酸二氨 鋼、300mM氯化鋼、lOmM咪哇,P冊)重懸菌體,其中每克細(xì)胞加5毫升裂解緩沖液。
[0123] 將重懸的菌體進(jìn)行低溫超聲破碎細(xì)胞(50%電壓輸出,2砂超聲破碎,9砂間隔,共 超聲20分鐘),操作時(shí)將樣品冰浴冷卻W保護(hù)蛋白。細(xì)胞破碎后,W1400化pm離必20分鐘 并收集上清。
[0124] 每100毫升上清中加入1毫升Ni-NTA樹脂冰浴振蕩30分鐘。將細(xì)胞破碎上清 和Ni樹脂轉(zhuǎn)移至Ni-NTAAgarose層析柱(Qiagen,化t.No. 30210)中,待細(xì)胞破碎上清 全部通過Ni樹脂后,先用20個(gè)柱體積的洗脫緩沖液1 (50mM磯酸二氨鋼、300mM氯化鋼、 20mM咪哇,P冊)清洗,再用20個(gè)柱體積的洗脫緩沖液2 (50mM磯酸二氨鋼、300mM氯化鋼、 50mM咪哇,P冊)清洗,最后用5個(gè)柱體積的洗脫緩沖液3 (50mM磯酸二氨鋼、300mM氯化鋼、 250mM咪哇,P冊)清洗,并收集洗脫液,將洗脫液于4°C透析過夜,其中所用透析液的配方 為;150mM氯化鋼、20mMTris-肥l、10mM硫酸鋒、ImM二硫蘇糖醇,P冊。通過凝膠電泳(10% SDS-PAGE,100V,2小時(shí))的檢測結(jié)果如圖1所示。根據(jù)圖1結(jié)果,所得溶液為純化的FL2蛋 白溶液。
[01巧]實(shí)施例2 ;脂肪酶FL2的酶學(xué)性質(zhì) 陽12引 胎肪酶活力的測定方法
[0127] 采用比色法測定低溫脂肪酶活力。W對硝基苯蹤擱酸醋(pNP巧或者對硝基苯了 酸醋(pNPB)為底物,