專利名稱：：適用于快速檢測(cè)食品中微生物總數(shù)狀況的微量熱法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于食品安全微生物快速檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種適用于檢測(cè)食品中的微生物總數(shù)狀況的微量法。
背景技術(shù)：
：目前，國(guó)內(nèi)外研究的基于代謝學(xué)的快速檢測(cè)技術(shù)快速檢測(cè)食品中微生物總數(shù)的方法主要有ATP生物發(fā)光技術(shù)、酶底物法、電化學(xué)技術(shù)、噬菌體技術(shù)等。這些方法大多存在操作繁瑣、檢測(cè)時(shí)間太長(zhǎng)的缺點(diǎn)且受樣品復(fù)雜性的影響，造成結(jié)果的不準(zhǔn)確性。微量熱技術(shù)是一種通過(guò)測(cè)定細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)熱量的變化對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒別和檢測(cè)的方法。通過(guò)敏感的微量熱計(jì)對(duì)微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的熱量進(jìn)行測(cè)量，由于不同細(xì)菌新陳代謝各異，因而經(jīng)測(cè)量得到的熱圖譜也各不相同。但是由于放熱量與微生物數(shù)量呈相關(guān)性，一旦建立了參考熱譜圖，就可以對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定和檢測(cè)，使鑒定檢測(cè)步驟大為簡(jiǎn)化，一般只需數(shù)小時(shí)，因此微量熱技術(shù)具有廣泛的應(yīng)用前景。實(shí)驗(yàn)證實(shí)微量熱法可用于檢測(cè)食品中的微生物總數(shù)的狀況，采用量熱的方式來(lái)進(jìn)行分析，具有通用性強(qiáng)、適用于大多數(shù)生化樣品、在測(cè)量時(shí)不受其他電化學(xué)活性物質(zhì)或光學(xué)物質(zhì)的干擾等優(yōu)點(diǎn)。但是由于微生物生長(zhǎng)放熱量過(guò)于微小，利用高精度的MicroDSCIII微量熱儀才能夠檢測(cè)出，但由于測(cè)量結(jié)果平行性較差，降低了這種方法的實(shí)用性。
發(fā)明內(nèi)容為克服微量熱法檢測(cè)食品中微生物總數(shù)狀況中微生物生長(zhǎng)放熱量過(guò)于微小的缺點(diǎn)，本發(fā)明提出一種適用于快速檢測(cè)食品中微生物總數(shù)狀況的微量熱法。本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種適用于快速檢測(cè)食品中微生物總數(shù)狀況的微量熱法，通過(guò)檢測(cè)微生物生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的C02的量檢測(cè)食品中微生物總數(shù)狀況。進(jìn)一步地，所述產(chǎn)生的C02的量的計(jì)算方法為將產(chǎn)生C02與堿液發(fā)生酸堿化學(xué)反應(yīng)，通過(guò)計(jì)算被消耗掉的堿液的量，推算出C02的量。進(jìn)一步地，所述被消耗掉的堿液的量的計(jì)算方法為計(jì)算未與C02發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的相同的堿液與酸中和產(chǎn)生的熱量值，計(jì)算與C02發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的剩余堿液與酸中和產(chǎn)生的熱量值，計(jì)算兩者之間的熱量差值，算出被消耗的堿的量。本發(fā)明將熱與微生物生長(zhǎng)過(guò)程緊密結(jié)合在一起，利用微生物生長(zhǎng)呼吸產(chǎn)生的C02與堿液反應(yīng)所產(chǎn)生的熱量實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的檢測(cè)。針對(duì)熱量過(guò)小的問(wèn)題，改進(jìn)微量熱法的檢測(cè)方式，利用酸液再次中和與C02反應(yīng)后剩余的堿液的方式，將待測(cè)熱量值放大，在保持結(jié)果準(zhǔn)確的同吋提高了試驗(yàn)結(jié)果的平行性，使微量熱法真正成為簡(jiǎn)易、方便、實(shí)用的快速檢測(cè)微生物方法。圖1為本發(fā)明檢測(cè)C02溶于堿液的實(shí)驗(yàn)裝置；圖2為本發(fā)明驗(yàn)證檢測(cè)C02與堿液反應(yīng)熱量被檢測(cè)的可行性的實(shí)驗(yàn)裝置；圖3為本發(fā)明微量熱儀槍測(cè)得到的C02與堿液反應(yīng)曲線；圖4為本發(fā)明含菌的標(biāo)準(zhǔn)菌液釋放的C02與堿液反應(yīng)的熱圖譜；圖5為本發(fā)明不含菌的標(biāo)準(zhǔn)菌液釋放的C02與堿液反應(yīng)的熱圖譜；圖6為本發(fā)明測(cè)定細(xì)菌總數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖7為本發(fā)明測(cè)定另一種細(xì)菌總數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體實(shí)施例方式一種適用于快速檢測(cè)食品中微生物總數(shù)狀況的微量熱法，通過(guò)檢測(cè)微生物生L侖過(guò)程中產(chǎn)生的C02的量檢測(cè)食品中微生物總數(shù)狀況。由于菌體生長(zhǎng)放熱是每一種菌體都會(huì)產(chǎn)生的，而替代物也需要具有同樣的普遍性。微生物的基本生長(zhǎng)過(guò)程是C源+0一N源一細(xì)胞量+H"+C02+產(chǎn)物+熱量從上面方程式看出，微生物將各種能源物質(zhì)分解利用，除了生長(zhǎng)用之外，還會(huì)產(chǎn)生水、C02、各種產(chǎn)物以及熱量。由于微生物是培養(yǎng)在水環(huán)境中，因此無(wú)法對(duì)產(chǎn)生的水進(jìn)行檢測(cè)，而熱量已經(jīng)被否定了，同時(shí)不同的微生物所產(chǎn)生的產(chǎn)物是不同的，無(wú)法從中找到共同性，因此C02將是最好的選擇。由于食品中易污染的菌體通常都是好氧菌，菌體在呼吸過(guò)程中均會(huì)產(chǎn)生C02，C02能溶于水(體積比l:l)生成碳酸，即可與堿反應(yīng)。利用二氧化碳與堿液發(fā)生酸堿化學(xué)反應(yīng)放熱，與微生物生長(zhǎng)熱相比，熱值有了較大的提升。進(jìn)一步地，本發(fā)明將微生物生長(zhǎng)直接放的微小熱量檢測(cè)轉(zhuǎn)化為酸堿反應(yīng)放熱檢測(cè)，具體檢測(cè)方法為用酸去同時(shí)中和微量熱儀(MicroDSCIII)樣品池和參比池中的剩余堿液，通過(guò)熱量差值推算樣品中微生物總數(shù)。由于整個(gè)實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)時(shí)間約8個(gè)小時(shí)，這些熱量平均在8個(gè)小時(shí)內(nèi)，所需檢測(cè)的熱值仍然是很小的，通過(guò)量熱儀器檢測(cè)是很難實(shí)現(xiàn)的。因此有必要將待測(cè)熱量放大，最好能在短時(shí)間內(nèi)釋放大量的熱。由于C02在與堿液反應(yīng)時(shí)會(huì)消耗掉部分堿，反應(yīng)結(jié)束時(shí)，樣品池內(nèi)的堿液與參比池內(nèi)的堿液濃度必然會(huì)有差別，酸液過(guò)量情況下用酸去同時(shí)中和樣品池和參比池中的剩余堿液，參比池釋放的熱量必然會(huì)大于樣品池的熱量，這兩個(gè)熱值的差即為被消耗的堿的量，從而可以推算出這部分堿消耗掉的C02的量，繼而推算出樣品中含有的微生物的量。而且，由于酸堿反應(yīng)屬于無(wú)機(jī)化學(xué)反應(yīng)，短時(shí)間內(nèi)放出的熱量很大，因此，在利用C02與堿反應(yīng)的基礎(chǔ)上，再添加一步用酸去中和剩余的堿，就達(dá)到了放大熱量的目的。為驗(yàn)證本發(fā)明方法的可行性，本發(fā)明采用圖1所示的實(shí)驗(yàn)裝置檢測(cè)C02溶于堿液的可行性，圖l中各部分功能如下蠕動(dòng)泵l，用于向微生物培養(yǎng)瓶中不斷吹入含氧的空氣；空氣洗脫瓶2，用于處理蠕動(dòng)泵1吹入含氧的空氣中的C02,如果空氣不經(jīng)處理就直接吹入堿瓶中將會(huì)引起堿液的消耗而得出錯(cuò)誤的結(jié)論；微生物的培養(yǎng)裝置3，包括培養(yǎng)瓶和在培養(yǎng)瓶周圍設(shè)置的溫度環(huán)境，此處的溫度環(huán)境為恒溫(37°C)水浴，因?yàn)槲⑸锏纳L(zhǎng)是有最適合生長(zhǎng)的溫度，選擇合適生長(zhǎng)的溫度培養(yǎng)能夠加快檢測(cè)速度；堿瓶，包括樣品瓶41和參比瓶42，堿瓶中的堿液中含有酸堿指示劑(藍(lán)色)，以方便觀察顏色的變化。培養(yǎng)12小時(shí)(h)后，堿瓶中原本藍(lán)色的堿液，參比瓶42中顏色基本沒(méi)有變化；而樣品瓶41中由于吸收了細(xì)菌呼吸產(chǎn)生的C02而成為黃色，效果十分明顯?？梢娋w呼吸產(chǎn)生的C02是能夠溶于堿液并與堿液反應(yīng)的。碳酸與堿液反應(yīng)消耗堿，堿液的pH會(huì)發(fā)生變化。利用酸堿指示劑會(huì)對(duì)不同pH的液體產(chǎn)生不同顏色變化的特性，實(shí)現(xiàn)對(duì)堿液的pH的簡(jiǎn)單測(cè)定。如果菌體產(chǎn)生的C02消耗了堿，就會(huì)引起堿液的顏色發(fā)生變化，可以直觀的觀測(cè)到檢測(cè)C02溶于堿液是可行的。進(jìn)一步地，通過(guò)圖2中的裝置驗(yàn)證檢測(cè)C02與堿液反應(yīng)熱量被檢測(cè)的B/行性。如圖2所示，將圖1中的堿瓶換成微量熱儀(本實(shí)施例中采用的型號(hào)為MicroDSCIII),由于微量熱儀有一種循環(huán)池非常適合氣液混合放熱的檢測(cè)，本試驗(yàn)選擇微量熱儀作微量熱儀器，其余各部分與圖丄相同。圖3為微量熱儀檢測(cè)得到的C02與堿液反應(yīng)曲線，圖中橫坐標(biāo)為時(shí)間單位(秒)，縱坐標(biāo)為熱量單位(毫瓦mW)。從圖3看出，熱值曲線在后期有一個(gè)明顯的上升峰，與菌體的生長(zhǎng)過(guò)程狀態(tài)十分吻合，由此可知C02與堿液反應(yīng)產(chǎn)生的熱量也是可以被檢測(cè)得的。在細(xì)菌培養(yǎng)的優(yōu)化條件下，利用已知濃度的B3菌液作為待測(cè)菌液，可得到一條與菌體生長(zhǎng)狀態(tài)相關(guān)的熱圖譜，如圖4、圖5所示，圖4為標(biāo)準(zhǔn)菌液釋放的C02與堿液反應(yīng)的熱圖譜(含菌)，圖中橫坐標(biāo)為時(shí)間單位(小時(shí))，縱坐標(biāo)為熱量單位(毫瓦mW)，圖5為標(biāo)準(zhǔn)菌液釋放的C02與堿液反應(yīng)的熱圖譜(不含菌)，圖中橫坐標(biāo)為時(shí)間單位(小時(shí))，縱坐標(biāo)為熱量單位(毫瓦mW)。通過(guò)對(duì)熱圖譜中4h到8h的累積放熱值進(jìn)行面積積分，就得到了8h內(nèi)菌體生長(zhǎng)釋放出的C02與堿液反應(yīng)產(chǎn)生的熱量值。在相同條件下，用已知的不同細(xì)菌總數(shù)的B3菌懸液重復(fù)試驗(yàn)，將熱量值與初始細(xì)菌總數(shù)一一對(duì)應(yīng)，即得到此種細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖6所示。經(jīng)過(guò)對(duì)所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性擬合，得到曲線方程為y=0.0007x+l.5375，R2=0.9738。線性關(guān)系非常好。下表1為標(biāo)準(zhǔn)曲線驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果-<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表1從表1中看出，利用最佳培養(yǎng)條件，對(duì)未知濃度的B3菌液檢測(cè)，同時(shí)利用標(biāo)準(zhǔn)曲線及平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行對(duì)比，所得的結(jié)果偏差不大，誤差值為8.86%和0.7%，基本符合要求，證明了這條標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確性。同時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線提供了500cfu/ml左右菌量的熱量值，可以滿足大多數(shù)食品安全標(biāo)準(zhǔn)對(duì)細(xì)菌總數(shù)的要求，也表明這種方法得出的標(biāo)準(zhǔn)曲線有著實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。為了驗(yàn)證這種方法有普遍的應(yīng)用性，選擇另一種菌再次驗(yàn)證。測(cè)定細(xì)菌總數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖7所示，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，對(duì)于不同的菌體，利用C02作為測(cè)量對(duì)象檢測(cè)樣品初始細(xì)菌總數(shù)的方法仍然可行，因此這種方法在檢測(cè)食品中微生物含量時(shí)是完全可行的，并可以普遍應(yīng)用于不同的微生物檢測(cè)中。權(quán)利要求1、一種適用于快速檢測(cè)食品中微生物總數(shù)狀況的微量熱法，其特征在于通過(guò)檢測(cè)微生物生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的CO2的量檢測(cè)食品中微生物總數(shù)狀況。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的適用于快速檢測(cè)食品中微生物總數(shù)狀況的微量熱法，其特征在于所述產(chǎn)生的C02的量的計(jì)算方法為將產(chǎn)生C02與堿液發(fā)生酸堿化學(xué)反應(yīng)，通過(guò)計(jì)算被消耗掉的堿液的量，推算出C02的量。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的適用于快速檢測(cè)食品中微生物總數(shù)狀況的微量熱法，其特征在于所述被消耗掉的堿液的量的計(jì)算方法為計(jì)算未與C02發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的相同的堿液與酸中和產(chǎn)生的熱量值，計(jì)算與C02發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的剩余堿液與酸中和產(chǎn)生的熱量值，計(jì)算兩者之間的熱量差值，算出被消耗的堿的量。全文摘要適用于快速檢測(cè)食品中微生物總數(shù)狀況的微量熱法，將微生物生長(zhǎng)放熱轉(zhuǎn)化為酸堿反應(yīng)放熱，其方法步驟為1)用檢測(cè)菌體生長(zhǎng)放出的CO₂替代直接檢測(cè)菌體生長(zhǎng)熱，利用CO₂與堿液發(fā)生酸堿化學(xué)反應(yīng)放熱；2)用酸去同時(shí)中和MicroDSCIII樣品池和參比池中的剩余堿液，參比池內(nèi)的堿液由于未被CO₂中和，釋放的熱量必然會(huì)大于樣品池的熱量，這兩個(gè)熱值的差即為被消耗的堿的量，從而可以推算出這部分堿消耗掉的CO₂的量，據(jù)測(cè)定細(xì)菌總數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線推算出樣品中含有的微生物的量。由本檢測(cè)方法進(jìn)行微生物總數(shù)檢測(cè)大大提高了檢測(cè)靈敏度、縮短了檢測(cè)時(shí)間，適用于量熱法檢測(cè)微生物總數(shù)。文檔編號(hào)G01N25/20GK101592624SQ200910053379公開日2009年12月2日申請(qǐng)日期2009年6月19日優(yōu)先權(quán)日2009年6月19日發(fā)明者斐徐,李學(xué)輝,李思超,章海鵬申請(qǐng)人:上海理工大學(xué)