卷煙煙氣中芳香胺類化合物體外誘導(dǎo)上皮細(xì)胞中muc5ac表達(dá)的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及卷煙煙氣毒理研究技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種卷煙煙氣中芳香胺類化合 物體外誘導(dǎo)上皮細(xì)胞中MUC5AC表達(dá)的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 慢性阻塞性肺病（chronicobstructivepulmonarydisease，C0PD)是世界范圍 內(nèi)一種發(fā)病率高、致殘致死率高、且嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量的疾病，同時(shí)會(huì)加重患者的經(jīng)濟(jì) 負(fù)擔(dān)。
[0003]在各種致病因素中，吸煙是最重要的環(huán)境危險(xiǎn)因素。據(jù)統(tǒng)計(jì)，由吸煙所致死亡的疾 病中，慢性肺部疾患占45 %，C0PD是其中的慢性肺病之一。國(guó)外有80 %~90 %的C0PD是 由吸煙引起的，我國(guó)約有72%的C0PD是由吸煙引起的。
[0004] 正常情況下，氣管、支氣管上皮細(xì)胞和黏膜下腺分泌的黏液能保護(hù)氣道上皮免受 空氣污染物和病原體的攻擊，而在慢性氣道炎癥性疾病如慢性阻塞性肺病、哮喘等病理情 況下，常常伴有黏液過度分泌，過多分泌的黏液阻塞氣道，使呼吸功能長(zhǎng)期不能改善，且易 導(dǎo)致病原菌定植，引起反復(fù)感染，與病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)。
[0005] 大量研究證實(shí)，氣道黏液高分泌已成為coro急性加重期患者死亡率升高的獨(dú)立 危險(xiǎn)因素，在致死性哮喘患者氣道中也發(fā)現(xiàn)有大量黏液阻塞，杯狀細(xì)胞急性脫顆粒釋放大 量黏液是造成哮喘急性惡化及死亡的重要原因。早有研究證實(shí)，吸煙患者的慢性支氣管炎、 肺氣腫、支氣管哮喘、肺間質(zhì)纖維化等一系列慢性炎性病變的發(fā)生率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于非吸煙者，且 病情更嚴(yán)重，不易緩解。
[0006] 長(zhǎng)期大量吸煙的正常人中，雖然小氣道形態(tài)學(xué)上并無(wú)異常，但上皮細(xì)胞中編碼細(xì) 胞因子、固有免疫反應(yīng)、凋亡、黏蛋白等的基因都存在調(diào)節(jié)上的異常，更易發(fā)生病變，導(dǎo)致 C0PD的發(fā)生發(fā)展。吸煙者氣道的杯狀細(xì)胞大量增生、肥大，其體積和數(shù)量多于吸煙者的數(shù) 倍，能儲(chǔ)存高于正常2. 2倍乃至更多的黏液，在有小氣道阻塞性病變的吸煙者中尤其顯著， 故在急性發(fā)作期，更易產(chǎn)生黏液栓，使病情惡化。
[0007] 卷煙煙氣是多種化合物組成的復(fù)雜混合物，截止1988年（據(jù)Roberts， 1988TobaccoR印orter報(bào)道）已經(jīng)鑒定出煙氣中的化學(xué)成分已達(dá)5068種，其中1172種是煙 草本身就有的，另外3896種是煙氣中獨(dú)有的。美國(guó)健康基金會(huì)副董事長(zhǎng)D.霍夫曼博士列 出卷煙煙氣中的44種主要有害成分，除焦油、煙堿和一氧化碳這些主要成分外，其他大致 可分為九類：①氨；②四種芳香胺；③苯并芘；④八種醛酮類化合物；⑤氫氰酸；⑥七種無(wú) 機(jī)元素；⑦七種酚類化合物；⑧四種煙草特有亞硝胺；⑨其他揮發(fā)性有機(jī)成分。
[0008] 國(guó)內(nèi)的鄭州煙草研究院根據(jù)國(guó)家局要求以及行業(yè)質(zhì)量安全性工作的需要，推出卷 煙煙氣中7種主要有害成分包括C0,HCN，NNK，NH3,B[a]P，苯酚和巴豆醛的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。芳香 胺類物質(zhì)作為煙氣中主要成份之一，對(duì)呼吸道具有強(qiáng)刺激作用以及致癌作用，目前針對(duì)卷 煙煙氣中芳香胺類物質(zhì)體外誘導(dǎo)氣道上皮Muc5ac表達(dá)，尚無(wú)公開發(fā)表的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明提供了一種卷煙煙氣中芳香胺類化合物體外誘導(dǎo)上皮細(xì)胞中MUC5AC表達(dá) 的檢測(cè)方法，操作簡(jiǎn)單，方便快速，靈敏度高，能夠準(zhǔn)確檢測(cè)卷煙主流煙氣中各種芳香胺類 物質(zhì)對(duì)人氣道上皮細(xì)胞中MUC5AC表達(dá)的誘導(dǎo)作用。
[0010] -種卷煙煙氣中芳香胺類化合物體外誘導(dǎo)上皮細(xì)胞中MUC5AC表達(dá)的檢測(cè)方法， 包括：
[0011] 步驟1，以pGL6為質(zhì)粒載體，構(gòu)建含有MUC5AC啟動(dòng)子的MUC5AC-promotor-pGL6質(zhì) 粒；
[0012] 步驟2,將MUC5AC-promotor-pGL6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入人氣道上皮細(xì)胞16HBE中，得到 MUC5AC-promotor-pGL6-16HBE細(xì)胞；
[0013] 步驟3,在MUC5AC-promotor-pGL6-16HBE細(xì)胞中加入卷煙煙氣中的芳香胺類化合 物，作用至少48h ;
[0014] 步驟4,對(duì)步驟3的作用產(chǎn)物進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)，依據(jù)所得的熒光素酶活性， 得到上皮細(xì)胞中MUC5AC的誘導(dǎo)表達(dá)倍數(shù)。
[0015] 本發(fā)明選取人氣道上皮細(xì)胞中MUC5AC啟動(dòng)子序列-1300-+48作為靶標(biāo)序列，利用 PCR擴(kuò)增該序列，并克隆到具有熒光素酶報(bào)告基因和G418篩選標(biāo)記的PGL6質(zhì)粒中，將測(cè)序 驗(yàn)證正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入人氣道上皮細(xì)胞16HBE中，將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞與卷煙提取物相作用， 獲得上皮細(xì)胞中MUC5AC的表達(dá)程度。
[0016] 作為優(yōu)選，MUC5AC-promotor_pGL6質(zhì)粒的構(gòu)建方法如下：
[0017] 步驟1-1、設(shè)計(jì)MUC5AC啟動(dòng)子-1300-+48的引物序列如下：
[0018]上游引物為：5'-AGGGTACCAGAGCTTGGGACGGGTCC-3'（序列如SEQIDN0:1 所示的 DNA序列）；
[0019]下游引物為：5'-CCGCTCGAGTGTGTGGACGGCGGGGAAGA-3'（序列如SEQIDN0 :2所 不的DNA序列）；
[0020] 以人氣道上皮細(xì)胞16HBE的總基因組DNA為模板，利用PCR擴(kuò)增MUC5AC啟動(dòng)子序 列；
[0021] 步驟1-2、利用Κρη I和Xhol I雙酶切步驟1-1的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒載體pGL6,用 T4DNA連接酶連接至少24h，得到MUC5AC-promotor-pGL6質(zhì)粒。
[0022] 作為優(yōu)選，步驟1-1中PCR反應(yīng)的條件如下：
[0023]
[0024] 變性、退火、延伸循環(huán)28~30次。
[0025] 作為優(yōu)選，PCR產(chǎn)物與pGL6載體的摩爾比為3:1。
[0026] 作為優(yōu)選，利用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑將MUC5AC-promotor_pGL6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 入人氣道上皮細(xì)胞16HBE中，然后采用G418篩選得到MUC5AC-promotor-pGL6-16HBE細(xì)胞。
[0027] 作為優(yōu)選，步驟3中，芳香胺類化合物的加入量為不對(duì)人氣道上皮細(xì)胞16HBE產(chǎn)生 細(xì)胞毒性的最大量。
[0028] 本發(fā)明提供的檢測(cè)方法，具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0029] (1)由于卷煙煙氣進(jìn)入人體氣道后主要作用細(xì)胞，本發(fā)明采用人氣道上皮細(xì)胞作 為研究對(duì)象，更接近吸煙的實(shí)際狀態(tài)。
[0030] (2)特異性的選取人氣道上皮細(xì)胞中MUC5AC的啟動(dòng)子序列，使檢測(cè)更加具有針對(duì) 性和特異性。
[0031] (3)建立MUC5AC-promotor-PGL6-16HBE穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞，不用反復(fù)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，使篩 選更加快速和經(jīng)濟(jì)。
[0032] (4)采用熒光素酶報(bào)告基因作為最終檢測(cè)指標(biāo)，靈敏度高。
【附圖說明】
[0033] 圖la表示1-氨基萘對(duì)16HBE的細(xì)胞毒作用；
[0034] 圖lb表示3-氨基聯(lián)苯對(duì)16HBE的細(xì)胞毒作用；
[0035] 圖2a表示1-氨基萘對(duì)16HBE中Muc5ac表達(dá)的誘導(dǎo)作用；
[0036] 圖2b表示3-氨基聯(lián)苯對(duì)16HBE中Muc5ac表達(dá)的誘導(dǎo)作用；
[0037] 圖3為PGL6質(zhì)粒圖譜；
[0038] 圖4表示卷煙提取物對(duì)人氣道上皮細(xì)胞中Muc5ac的誘導(dǎo)作用。
【具體實(shí)施方式】
[0039] 實(shí)施例1
[0040] 芳香胺類物質(zhì)是卷煙主流煙氣中的主要物質(zhì)之一，主要有如1-氨基萘，2-氨基 萘，1-氨基聯(lián)苯，3-氨基聯(lián)苯等。為檢測(cè)這些芳香胺類物質(zhì)是否是吸煙導(dǎo)致肺部炎癥的主 要化合物，對(duì)1-氨基萘和3-氨基聯(lián)苯是否會(huì)誘導(dǎo)人氣道上皮細(xì)胞中MUC5AC的表達(dá)進(jìn)行檢 測(cè)，包括以下步驟：
[0041] 步驟1，以pGL6為質(zhì)粒載體，構(gòu)建含有MUC5AC啟動(dòng)子的MUC5AC-promotor-pGL6質(zhì) 粒，構(gòu)建方法如下：
[0042] 步驟1-1、設(shè)計(jì)MUC5AC啟動(dòng)子-1300-+48的引物序列如下：
[0043]上游引物為：5 ' -AGGGTACCAGAGCTTGGGACGGGTCC-3 ' ；
[0044]下游引物為：5' -CCGCTCGAGTGTGTGGACGGCGGGGAAGA-3' ；
[0045] 以人氣道上皮細(xì)胞16HBE的總基因組DNA為模板，利用PCR擴(kuò)增MUC5AC啟動(dòng)子序 列。
[0046] PCR反應(yīng)體系包括：
[0047]
[0048] PCR反應(yīng)的條件如下：
[0049]
[0050] 將PCR產(chǎn)物利用1%瓊脂糖凝膠，110V，20min電泳分離后，得到的擴(kuò)增條帶中的目 的條帶約680bp切下，用GelExtractionKitDNA純化試劑盒進(jìn)行純化。
[0051] 步驟1-2、采用ΚρηI和XholI雙酶切純化產(chǎn)物5h，同時(shí)采用ΚρηI和XholI 雙酶切2μg質(zhì)粒載體pGL6 5h，再次純化回收后，用T4DNA連接酶在16°C下連接24h。
[0052] 連接反應(yīng)體系如下：
[0053]
[0054