溴取代的芳香化合物修飾的高分子材料及制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及高分子化學(xué)，有機(jī)合成W及生物材料技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種漠取代 的芳香化合物修飾的陽(yáng)離子高分子材料及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 基因轉(zhuǎn)染是分子生物學(xué)和基因治療中一種非常重要的技術(shù)手段，它是指將外源基 因?qū)爰?xì)胞，從而獲得新的遺傳性狀的過(guò)程?；蜣D(zhuǎn)染需要轉(zhuǎn)染載體將帶有目的基因的核 酸片段運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)并保護(hù)它不被細(xì)胞內(nèi)外存在的核酸酶所降解。目前使用的基因轉(zhuǎn)染載 體主要包括病毒類載體和非病毒類載體。在過(guò)去的200多年中，病毒類基因轉(zhuǎn)染載體因?yàn)?具有較高的基因轉(zhuǎn)染效率受到了科學(xué)界廣泛的關(guān)注。但病毒類載體存在攜帶基因能力有 限、生產(chǎn)造價(jià)高W及存在安全性隱患等問(wèn)題，運(yùn)在很大程度上限制了病毒類基因轉(zhuǎn)染載體 的應(yīng)用。隨著科學(xué)界對(duì)更加安全、穩(wěn)定的基因轉(zhuǎn)染載體的需要，很多非病毒類基因轉(zhuǎn)染載體 應(yīng)運(yùn)而生了。
[0003] 陽(yáng)離子聚合物是一類廣泛使用的非病毒類基因轉(zhuǎn)染載體。它易于生產(chǎn)，可生物降 解，結(jié)構(gòu)靈活，易于對(duì)其表面進(jìn)行多功能化的修飾，并且可W將大分子量的質(zhì)粒轉(zhuǎn)到活細(xì)胞 中。聚酷胺-胺樹(shù)形高分子和聚乙締亞胺是兩種典型的陽(yáng)離子聚合物基因轉(zhuǎn)染載體。由 于表面大量的氨基基團(tuán)的存化他們可W將DNA濃縮成很小的納米顆粒，不僅有利于將DNA 導(dǎo)入細(xì)胞，而且能夠保護(hù)DNA不被外部的核酸酶降解。其內(nèi)部的Ξ級(jí)胺結(jié)構(gòu)可W起到"質(zhì) 子海綿"的作用，促進(jìn)DNA復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)涵體的逃逸，但是聚酷胺-胺樹(shù)形高分子W及 聚乙締亞胺陽(yáng)離子聚合物在基因轉(zhuǎn)染過(guò)程中對(duì)常見(jiàn)常用細(xì)胞系（如肥K293、HeLa、C0S-7 細(xì)胞等）表現(xiàn)出的低的或者中等的基因轉(zhuǎn)染效率，W及較高的細(xì)胞毒性限制了他們的臨床 應(yīng)用。近年來(lái)，許多研究工作者在運(yùn)兩類陽(yáng)離子聚合物表面連接了各種修飾基團(tuán)，如氨基 酸、脂質(zhì)體、多膚、環(huán)糊精、寡氨、聚乙二醇、糖基等來(lái)增強(qiáng)其生物相容性和轉(zhuǎn)染效果。目前， W聚酷胺-胺樹(shù)形高分子和聚乙締亞胺為基礎(chǔ)的基因轉(zhuǎn)染載體如SuperFect、Priofect、 PolyFect，Je巧El等已經(jīng)成功商業(yè)化。但是，現(xiàn)有技術(shù)中基于陽(yáng)離子聚合物合成的基因轉(zhuǎn) 染載體有比較復(fù)雜的合成路線、高昂的材料成本，W及高的細(xì)胞毒性。運(yùn)些缺陷在很大程度 上制約了其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。因此亟需通過(guò)新的修飾及改良方法合成具有較高的 基因轉(zhuǎn)染效率和良好生物相容性的轉(zhuǎn)染載體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明克服現(xiàn)有陽(yáng)離子高分子轉(zhuǎn)染材料及其合成方法的不足，提出了一種基于漠 取代的芳香環(huán)化合物修飾的陽(yáng)離子高分子轉(zhuǎn)染載體，可W高效、安全、低毒地轉(zhuǎn)染核酸或蛋 白質(zhì)。本方法利用漠取代的芳香環(huán)化合物和陽(yáng)離子高分子材料作為原料，反應(yīng)高效、安全、 合成成本較低，得到的轉(zhuǎn)染載體具備細(xì)胞毒性小、轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)點(diǎn)。
[0005] 本發(fā)明提供了一種漠取代的芳香環(huán)化合物修飾的高分子材料，其結(jié)構(gòu)如式（1)所 示，包括陽(yáng)離子高分子骨架W及漠取代的芳香環(huán)化合物功能基團(tuán)，所述含漠芳香環(huán)化合物 功能基團(tuán)共價(jià)連接在陽(yáng)離子高分子表面；所述陽(yáng)離子高分子表面為伯胺基團(tuán)；
[0006] R-燈-S)x式（1)，
[0007] 式（1)中：
[0008] R為所述高分子骨架，所述高分子骨架為陽(yáng)離子高分子骨架；
[0009] Y為連接基團(tuán)；
[0010] S為漠取代的芳香化合物功能基團(tuán)；
[0011] X為 1-1024 的整數(shù)。
[0012] 其中，所述R為如式（2)所示的聚酷胺-胺樹(shù)形高分子、如式（3)所示的聚丙締亞 胺樹(shù)形高分子、如式（4)所示的聚賴氨酸陽(yáng)離子高分子、如式（5)所示的線性聚乙締亞胺陽(yáng) 離子高分子或如式（6)所示的支化聚乙締亞胺陽(yáng)離子高分子，
[0013]
[0014] 所述式似和式（3)中：
[0015] Μ是樹(shù)形高分子的核屯、，包括氨、乙二胺、下二胺、己二胺、辛二胺、葵二胺和 1，12-十二燒二胺；
[0016] η是1-10的整數(shù)；
[0017] m是2-4的整數(shù)； 陽(yáng)01引所述式（4)中，q是1-1024的整數(shù)；
[0019] 所述式巧）中，r是1-1024的整數(shù)；
[0020] 所述式（6)中，X，y是1-1024的整數(shù)。
[0021] 所述Y如式（7)、式做、式巧）、式（10)、式（11)或式（12)所示：
[0022]
W23]式（7);式做；式巧）；式（10);式（11);式（。）；
[0024] 所述S如式（13)、式（14)、式（15)、式（16)、式（17)或式（18)所示： 陽(yáng)0巧]
[0026] 本發(fā)明漠取代的芳香環(huán)化合物修飾的陽(yáng)離子高分子材料，包括陽(yáng)離子高分子骨架 W及漠取代的芳香環(huán)化合物功能基團(tuán)，所述漠取代的芳香環(huán)化合物功能基團(tuán)共價(jià)連接在陽(yáng) 離子高分子表面；所述陽(yáng)離子高分子骨架包括聚酷胺-胺樹(shù)形高分子，聚丙締亞胺樹(shù)形高 分子、聚賴氨酸陽(yáng)離子高分子、線性聚乙締亞胺陽(yáng)離子高分子或支化聚乙締亞胺陽(yáng)離子高 分子，所述陽(yáng)離子高分子表面的伯胺基團(tuán)與所述漠取代的芳香環(huán)化合物的修飾基團(tuán)進(jìn)行取 代、酷化、橫酸化等反應(yīng)，W酷胺鍵、氨基橫酸鍵等化合鍵連接。
[0027] 本發(fā)明還提出了一種式（1)所示陽(yáng)離子高分子材料的制備方法，將漠取代的芳香 環(huán)化合物及陽(yáng)離子高分子溶解于水或有機(jī)溶劑，攬拌反應(yīng)48-168小時(shí)，通過(guò)反應(yīng)將含漠取 代的芳香環(huán)化合物功能基團(tuán)共價(jià)連接到陽(yáng)離子聚合物表面，得到如式（1)所示的陽(yáng)離子高 分子材料。
[0028] 具體地，漠取代的芳香環(huán)化合物修飾的陽(yáng)離子高分子材料制備方法，W所述陽(yáng)離 子高分子和所述漠取代的芳香環(huán)化合物為原料，首先將漠取代的芳香環(huán)化合物溶于溶劑 中，之后向溶劑中加入適量的活化劑進(jìn)行活化，再按照一定的比例逐滴滴加所述陽(yáng)離子高 分子的水或有機(jī)溶液；一定的反應(yīng)溫度下攬拌反應(yīng)，得到如式（1)所示的陽(yáng)離子高分子材 料。
[0029] 本發(fā)明制備方法中，所述溶劑為有機(jī)溶劑或水；
[0030] 其中，所述有機(jī)溶劑包括甲醇、乙醇、二甲亞諷、N，N-二甲基甲酯胺和四氨巧喃等 可溶解所述漠取代的芳香環(huán)化合物的有機(jī)溶劑。
[0031] 本發(fā)明制備方法中所述漠取代的芳香環(huán)化合物包括4-漠苯甲酸、4-漠苯甲醒、 4-漠苯異氯酸醋、3-漠苯甲酸、2-漠苯甲酸、3, 5-二漠苯甲酸等含漠芳香環(huán)衍生物。
[0032] 本發(fā)明制備方法中，所述反應(yīng)時(shí)間為48-168小時(shí)；所述反應(yīng)溫度為0-37°C。
[0033] 本發(fā)明還提出了式（1)所示的漠取代的芳香環(huán)化合物修飾的高分子材料作為核 酸或蛋白質(zhì)分子的輸送載體的應(yīng)用。
[0034] 其中，所述核酸包括DNA、siRNA、shRNA、microRNA和修飾的核酸。
[0035] 其中，所述蛋白是膚、修飾的膚、蛋白或修飾的蛋白。
[0036] 本發(fā)明還提出了一種新的復(fù)合物，其包括含有如式（1)所示的漠取代的芳香環(huán)化 合物修飾的高分子材料和核酸或蛋白質(zhì)，由所述式（1)轉(zhuǎn)染材料攜帶所述核酸或蛋白質(zhì)。
[0037] 在一個(gè)具體的實(shí)施例中，在室溫下，將所述陽(yáng)離子高分子材料和特異性敲除巧光 素酶的siRNA形成復(fù)合物，在該復(fù)合物中，由所述陽(yáng)離子高分子材料攜帶核酸。
[0038] 陽(yáng)離子高分子包括聚酷胺-胺樹(shù)形高分子，聚丙締亞胺樹(shù)形高分子、聚賴氨酸陽(yáng) 離子高分子、線性聚乙締亞胺陽(yáng)離子高分子和支化聚乙締亞胺陽(yáng)離子高分子，其表面存在 大量的氨基可W很好地結(jié)合和濃縮核酸或蛋白質(zhì)，將核酸或蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)。其內(nèi)部的 Ξ級(jí)胺結(jié)構(gòu)可W通過(guò)"質(zhì)子海綿"機(jī)制幫助核酸或蛋白質(zhì)成功地從內(nèi)含體逃逸。但是運(yùn)些 陽(yáng)離子高分子聚合物一般只具有較低或中等的基因轉(zhuǎn)染效率。本發(fā)明制備的如式（1)所示 的漠取代的芳香環(huán)修飾的高分子材料作為轉(zhuǎn)染載體能有效地提高原陽(yáng)離子高分子轉(zhuǎn)染核 酸或蛋白質(zhì)的效率，達(dá)到商業(yè)化lipofectamine2000的級(jí)別，同時(shí)降低了細(xì)胞毒性。因 此，本發(fā)明的漠取代的芳香環(huán)修飾的高分子材料的制備方法合成工藝簡(jiǎn)單、材料組成可控、 成本低廉，制備的高分子材料能有效且安全地將核酸或蛋白質(zhì)分子輸送到細(xì)胞中，具有轉(zhuǎn) 染效率高和毒性低等優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0039] 圖1為實(shí)施例1中所制備的陽(yáng)離子高分子材料G5-4-Br〇-a，G5-N=C-4-Bro-a，G 5-NH-4-Br〇-a,G5-2-Br〇-a,G5-3-B;r〇-a,G5-3,S-Bro-a的一維核磁共振圖譜。
[0040] 圖2為實(shí)施例1中所得的陽(yáng)離子高分子材料G5-4-Br〇-47和G5-3, 5-Br〇-30在 化la-luc細(xì)胞上對(duì)巧光素酶基因的敲除效率對(duì)比圖。 陽(yáng)0川 圖3為實(shí)施例2制備的陽(yáng)離子高分子材料PEI-3, 5-Bro-lOO、PEI和 Lipofectamine2000在化la-Luc細(xì)胞上對(duì)巧光素酶的敲除效率對(duì)比圖。
【具體實(shí)施方式】
[0042] 結(jié)合W下具體實(shí)施例和附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容 不局限于W下實(shí)施例。在不背離發(fā)明構(gòu)思的精神和范圍下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的變 化和優(yōu)點(diǎn)都被包括在本發(fā)明中，并且W所附的權(quán)利要求書為保護(hù)范圍。實(shí)施本發(fā)明的過(guò)程、 條件、試劑、實(shí)驗(yàn)方法等，除W下專口提及的內(nèi)容之外，均為本領(lǐng)域的普遍知識(shí)和公知常 識(shí)，本發(fā)明沒(méi)有特別限制內(nèi)容。 陽(yáng)043] 實(shí)施例1:
[0044] 本發(fā)明基于第五代聚酷胺-胺型樹(shù)形高分子和漠取