專利名稱：紫花苜蓿葉黃素循環(huán)組分的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物生化檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種紫花苜蓿(Medicagosat iva L.)葉黃素循環(huán)組分的快速檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
紫花苜猜(Medicago sativa L.)是我國(guó)栽培歷史最久、分布最廣、種植最多的優(yōu)良豆科牧草。紫花苜蓿具有產(chǎn)量高、品質(zhì)好、蛋白質(zhì)含量高、適口性好等特點(diǎn)，被譽(yù)為“牧草之王”。同時(shí)，它能保持水土、培肥地力、增加飼料，對(duì)改善農(nóng)牧業(yè)生態(tài)環(huán)境、促進(jìn)畜牧業(yè)發(fā)展有重要作用。由于種植條件粗放，紫花苜蓿經(jīng)常受到強(qiáng)光、干旱和土壤貧瘠等逆境的脅迫而發(fā)生光抑制甚至光破壞，使其光合效率降低、品質(zhì)下降。環(huán)境脅迫如高溫、干旱、強(qiáng)光和貧瘠等條件下，植物的光合能力下降，積累的過剩光能易導(dǎo)致光破壞，依賴于植物體內(nèi)的葉黃素循環(huán)耗散過剩激發(fā)能，是光合器官在自然條件下免遭光破壞的重要途徑之一。葉黃素循環(huán)組分由玉米黃質(zhì)(Z)、環(huán)氧玉米黃質(zhì)(A)和紫黃質(zhì)(V)構(gòu)成。當(dāng)光合器官吸收的光能不能全部被光合作用利用時(shí)，V在紫黃素脫環(huán)氧化酶催化下。經(jīng)中間體A脫環(huán)氧生成Z，在沒有過剩光能條件下，Z在環(huán)氧化酶催化下經(jīng)中間體A加環(huán)氧生成V。且Z隨著過剩光能的增加而增加，并直接參與熱耗散而將多余的激發(fā)能猝滅，起到光保護(hù)作用。因此，建立紫花苜蓿葉黃素循環(huán)組分的測(cè)定方法是十分必要的。目前對(duì)植物葉黃素循環(huán)組分的測(cè)定大多數(shù)采用的是Spherisorb C18色譜柱柱，使用的流動(dòng)相是Tris-HCL緩沖液、甲醇和乙酸乙酯。該流動(dòng)相要么形成不溶于水的晶體沉淀而堵塞管路系統(tǒng)，導(dǎo)致柱壓急劇升高，大大縮短了柱的有效使用壽命；要么就是乙酸乙酯被吸附，要經(jīng)常洗脫，不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且經(jīng)常使得被測(cè)組分的峰形被破壞。所以建立對(duì)色譜柱無傷害、靈敏準(zhǔn)確的紫花苜蓿葉黃素組分循環(huán)測(cè)定方法具有十分重要的作用。發(fā)明目的針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，本發(fā)明旨在提供一種紫花苜蓿葉黃素循環(huán)組分的快速檢測(cè)技術(shù)，采用價(jià)格較Spherisorb C18相對(duì)便宜的Hypersil ODS色譜柱,采用對(duì)色譜柱無傷害的常用試劑乙腈作為流動(dòng)相，為紫花苜蓿葉黃素循環(huán)組分的快速、準(zhǔn)確檢測(cè)提供了節(jié)約人力、物力和財(cái)力的方法。從色素的提取到檢測(cè)全過程只需I小時(shí)即可完成，該方法快速、靈敏、準(zhǔn)確。本發(fā)明的上述目的是通過下述的技術(shù)方案加以實(shí)現(xiàn)的紫花苜蓿葉黃素循環(huán)組分的檢測(cè)方法，取紫花苜蓿鮮葉O.1g,倒入液氮研磨至粉末狀，加入85%丙酮，勻漿2-3 min,再加入100%丙酮，勻漿I min之后置于冰上15 min,1200g離心10 min，取上清液用0.45 Mm微孔濾膜過濾后進(jìn)樣到高效液相色譜儀采用濃度線性梯度洗脫，從而檢測(cè)紫花苜蓿葉黃素循環(huán)組分玉米黃質(zhì)(Z)、環(huán)氧玉米黃質(zhì)(A)和紫黃質(zhì)(V)的含量。所述的紫花苜蓿葉黃素循環(huán)組分的檢測(cè)方法中所述高效液相色譜儀使用美國(guó)Agilent 1100高效液相色譜儀,色譜柱使用美國(guó)Agilent Hypersil ODS的4. O X 250 mm, 5Mm色譜柱。所述的紫花苜蓿葉黃素循環(huán)組分的檢測(cè)方法中所述濃度線性梯度洗脫，流動(dòng)相A液為100%乙腈，B液為100%水，濃度線性梯度洗脫程序?yàn)?0% A液+ 10% B液洗脫15min，接著在5min內(nèi)，90% A液濃度線性遞增至100%的A液,之后再洗脫20 min,流速I ml/min,檢測(cè)波長(zhǎng)445 nm，柱子溫度30°C，進(jìn)樣體積10 μ 。所述的紫花苜蓿葉黃素循環(huán)組分的檢測(cè)方法，所述紫花苜蓿葉黃素循環(huán)組分玉米黃質(zhì)0119、環(huán)氧玉米黃質(zhì)0231和紫黃質(zhì)0259標(biāo)樣購(gòu)自瑞士 carotenature原裝,純度分別為 99. 6%, 95. 7% 和 98. 6%。所述的紫花苜蓿葉黃素循環(huán)組分的檢測(cè)方法中所述紫花苜蓿葉黃素提取過程在無光條件下進(jìn)行。所述的紫花苜蓿葉黃素循環(huán)組分的檢測(cè)方法中所述試劑丙酮為分析純，水為超純水，乙腈為色譜純。更具體地，本發(fā)明 的紫花苜蓿葉黃素循環(huán)組分的檢測(cè)方法是準(zhǔn)確稱量玉米黃質(zhì)
O.96 mg,環(huán)氧玉米黃質(zhì)1. 128 mg,紫黃質(zhì)1. 536 mg,用甲醇定容100 ml容量瓶中，取上述儲(chǔ)備液I ml，分別稀釋10倍、50倍、100倍和200倍，分別取10 μ 稀釋后的標(biāo)樣進(jìn)樣到美國(guó) Agilent 1100 高效液相色譜儀中，用美國(guó) Agilent Hypersil ODS (4.0X250 mm, 5Mm)色譜柱，流動(dòng)相A液為100%乙腈，B液為100%水，梯度洗脫程序90%A液+10%B液洗脫15 min，接著在5 min內(nèi)，90%A液濃度線性遞增至100%的A液，之后再洗脫20 min，流速Iml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)445 nm，柱子溫度30°C，以它們的峰面積和濃度進(jìn)行線性回歸，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，玉米黃質(zhì)、環(huán)氧玉米黃質(zhì)和紫黃質(zhì)的保留時(shí)間分別為15. 38 min、10.20 min和6. 90min ;在暗室中，取紫花苜蓿鮮葉放入研缽中，然后倒入液氮迅速研磨至粉末狀，加入85%丙酮，勻漿2-3 min，再加入100%丙酮，勻漿I min，之后將研缽置于冰上15 min, 1200 g離心10 11^11，取上清液用0.45 μ m微孔濾膜過濾后，取10 μ 體積進(jìn)樣到美國(guó)Agilent 1100高效液相色譜儀中，用美國(guó)Agilent Hypersil ODS的4. 0X250 mm, 5 Mm色譜柱,流動(dòng)相A液為100%乙腈，B液為100%水，梯度洗脫程序90%A液+10%B液洗脫15 min,接著在5 min內(nèi)，90%A液濃度線性遞增至100%的A液，之后再洗脫20 min,流速I ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)445nm，柱子溫度30°C，紫花苜蓿玉米黃質(zhì)、環(huán)氧玉米黃質(zhì)和紫黃質(zhì)的保留時(shí)間分別與標(biāo)樣的保留時(shí)間一致，測(cè)出玉米黃質(zhì)、環(huán)氧玉米黃質(zhì)、紫黃質(zhì)的含量。


圖1葉黃素循環(huán)組分玉米黃質(zhì)(Z)、環(huán)氧玉米黃質(zhì)(A)和紫黃質(zhì)(V)的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖2徳欽野生紫花苜蓿葉黃素循環(huán)組分玉米黃質(zhì)(Z)、環(huán)氧玉米黃質(zhì)(A)和紫黃質(zhì)(V)的峰值圖。圖3阿爾R金紫花苜蓿葉黃素循環(huán)組分玉米黃質(zhì)(Z)、環(huán)氧玉米黃質(zhì)(A)和紫黃質(zhì)(V)的峰值圖。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的組培方法的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明方法選取了價(jià)格較為便宜的液相色譜柱美國(guó)Agilent Hypersil ODS(4.0X250 mm, 5 Mm)色譜柱。選取了對(duì)色譜柱無傷害的常規(guī)液相色譜流動(dòng)相乙腈，同時(shí)篩選出了靈敏、準(zhǔn)確、快速的液相色譜檢測(cè)條件。從色素的提取到檢測(cè)全過程只需I小時(shí)即可完成。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用來進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容。根據(jù)本發(fā)明技術(shù)方案和實(shí)施例的描述，也許同領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明的基礎(chǔ)上還可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行一些修改和改進(jìn)。因此，在不偏離本發(fā)明主要技術(shù)方案基礎(chǔ)上所做的修改和改進(jìn)，均應(yīng)屬于本發(fā)明所要求保護(hù)的范圍。實(shí)施例1 :將購(gòu)自瑞士 carotenature原裝玉米黃質(zhì)(0119)準(zhǔn)確稱量O. 96 mg、環(huán)氧玉米黃質(zhì)(0231)1. 128 mg和紫黃質(zhì)(0259)1. 536 mg，用甲醇定容100 ml容量瓶中。取上述儲(chǔ)備液Iml，分別稀釋10倍、50倍、100倍和200倍。分別取10 PL稀釋后的標(biāo)樣進(jìn)樣到美國(guó)Agilent1100高效液相色譜儀中，用美國(guó)Agi lent Hypersil ODS (4. 0X250 mm, 5 Mm)色譜柱，流動(dòng)相A液為100%乙腈，B液為100%水，梯度洗脫程序90%A液+10%B液洗脫15 min,接著在5min內(nèi)，90%A液濃度線性遞增至100%的A液，之后再洗脫20 min,流速I ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)445 nm，柱子溫度30°C。以它們的峰面積和濃度進(jìn)行線性回歸，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。玉米黃質(zhì)、環(huán)氧玉米黃質(zhì)和紫黃質(zhì)的保留時(shí)間分別為15.38 min、10. 20 min和6. 90 min。(見附圖1)在暗室中，取德欽野生紫花苜蓿鮮葉片O.1g放入研缽中，然后倒入液氮迅速研磨至粉末狀，加入4 ml 85%丙酮，勻漿2-3 min，再加入Iml 100%丙酮，勻漿I min，之后將研缽置于冰上15 min, 1200 g離心10 min，取上清液用O. 45 μ m微孔濾膜過濾后，取10 μ 體積進(jìn)樣到美國(guó)Agilent 1100高效液相色譜儀中，用美國(guó)Agilent Hypersil 0DSC4. 0X250mm, 5 Mm)的色譜柱，流動(dòng)相A液為100%乙腈，B液為100%水，梯度洗脫程序90%A液+10%B液洗脫15 min,接著在5 min內(nèi)，90%A液濃度線性遞增至100%的A液，之后再洗脫20 min。流速I ml/min,檢測(cè)波長(zhǎng)445 nm,柱子溫度30°C,玉米黃質(zhì)、環(huán)氧玉米黃質(zhì)和紫黃質(zhì)的保留時(shí)間分別為15. 308min、10. 217 min和6. 845min分別與標(biāo)樣的保留時(shí)間一致，測(cè)得的玉米黃質(zhì)的含量為1. 11112X10_3%，環(huán)氧玉米黃質(zhì)的含量9. 87748X 10_4 %和紫黃質(zhì)的含量為
6.87689XlCT3 % (見附圖 2)。實(shí)施例2 將購(gòu)自瑞士 carotenature原裝玉米黃質(zhì)(0119)準(zhǔn)確稱量O. 96 mg、環(huán)氧玉米黃質(zhì)(0231)1. 128 mg和紫黃質(zhì)(0259)1. 536 mg，用甲醇定容100 ml容量瓶中。取上述儲(chǔ)備液Iml，分別稀釋10倍、50倍、100倍和200倍。分別取10 PL稀釋后的標(biāo)樣進(jìn)樣到美國(guó)Agilent1100高效液相色譜儀中，用美國(guó)Agilent Hypersil ODS (4. 0X250 mm, 5 Mm)色譜柱，流動(dòng)相A液為100%乙腈，B液為100%水，梯度洗脫程序90%A液+10%B液洗脫15 min,接著在5min內(nèi)，90%A液濃度線性遞增至100%的A液，之后再洗脫20 min,流速I ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)445 nm，柱子溫度30°C。以它們的峰面積和濃度進(jìn)行線性回歸，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。玉米黃質(zhì)、環(huán)氧玉米黃質(zhì)和紫黃質(zhì)的保留時(shí)間分別為15.38 min、10. 20 min和6. 90 min。(見附圖1)在暗室中，取阿爾岡金紫花苜蓿鮮葉片O.1g放入研缽中，然后倒入液氮迅速研磨至粉末狀，加入4 ml 85%丙酮，勻漿2-3 min，再加入I ml 100%丙酮，勻漿I min，之后將研缽置于冰上15 min, 1200 g離心10 min，取上清液用O. 45 μ m微孔濾膜過濾后，取體積10 μ 進(jìn)樣到美國(guó)Agilent 1100高效液相色譜儀中，使用美國(guó)Agilent Hypersil ODS(4. O X 250 mm, 5 Mm)色譜柱，流動(dòng)相A液為100%乙腈，B液為100%水，梯度洗脫程序90%A液+10%B液洗脫15 min,接著在5 min內(nèi)，90%A液濃度線性遞增至100%的A液，之后再洗脫20 min。流速I ml/min,檢測(cè)波長(zhǎng)445 nm,柱子溫度30°C。玉米黃質(zhì)、環(huán)氧玉米黃質(zhì)和紫黃質(zhì)的保留時(shí)間分別為15. 735 minUO. 402 min和6. 920 min分別與標(biāo)樣的保留時(shí)間一致，測(cè)得的玉米黃質(zhì)的含量為1. 16060X 10_3 %，環(huán)氧玉米黃質(zhì)的含量7. 34. 48X 10_4 %和紫黃質(zhì)的含量為1. 80011 X 10_3 %。(見附圖3)本發(fā)明的技術(shù)方案通過將玉米黃質(zhì)、環(huán)氧玉米黃質(zhì)和紫黃質(zhì)的標(biāo)樣連續(xù)進(jìn)樣5次，每次 ο μ ，測(cè)定其峰面積，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為O. 87%，O. 32%和O. 96%的精密度實(shí)驗(yàn)；將玉米黃質(zhì)、環(huán)氧玉米黃質(zhì)和紫黃質(zhì)的標(biāo)樣分別于制備后0、3、6、9、14、19、25、48 h,測(cè)定其峰面積，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為2. 15%，1. 29%和3. 57%的穩(wěn)定性試驗(yàn)；精密稱取同一樣品5份，測(cè)定其含量，計(jì)算得到玉米黃質(zhì)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1. 88%、環(huán)氧玉米黃質(zhì)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為2. 63%和紫黃質(zhì)RSD為O. 42%的重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差都小于5%，表明該方法可較好的區(qū)分出葉黃素循環(huán)組分玉米黃質(zhì)、環(huán)氧玉米黃質(zhì)和紫黃質(zhì)，能反映樣品的真實(shí)含量，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性均較好，簡(jiǎn)便準(zhǔn)確。本發(fā)明的技術(shù)方案由于流動(dòng)相使用乙腈，相比現(xiàn)有技術(shù)使用流動(dòng)相Tris-HCL緩沖液、甲醇和乙酸乙酯的方法，對(duì)色譜柱無傷害，且較為靈敏準(zhǔn)確?，F(xiàn)有技術(shù)使用的流動(dòng)相要么形成不溶于水的晶體沉淀而堵塞管路系統(tǒng)，導(dǎo)致柱壓急劇升高，大大縮短了柱的有效使用壽命；要么就是乙酸乙酯被吸附，要經(jīng)常洗脫，不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且經(jīng)常使得被測(cè)組分的峰形被破壞。而本發(fā)明克服了這些問題，具備對(duì)色譜柱無傷害、靈敏準(zhǔn)確，提高效率，延長(zhǎng)儀器使用壽命等優(yōu)點(diǎn)。`
權(quán)利要求
1.紫花苜蓿葉黃素循環(huán)組分的檢測(cè)方法，取紫花苜蓿鮮葉0.lg，倒入液氮研磨至粉末狀，加入85%丙酮，勻漿2-3 min，再加入100%丙酮，勻漿.1 min之后置于冰上15 min, 1200g離心10 min，取上清液用0. 45 Mm微孔濾膜過濾后，取.10μ1進(jìn)樣到高效液相色譜儀采用濃度線性梯度洗脫，最后檢測(cè)出紫花苜蓿葉黃素循環(huán)組分玉米黃質(zhì)(Ζ)、環(huán)氧玉米黃質(zhì)(A)和紫黃質(zhì)(V)的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紫花苜蓿葉黃素循環(huán)組分的檢測(cè)方法，其特征在于所述高效液相色譜儀使用美國(guó)Agilent 1100高效液相色譜儀,色譜柱使用美國(guó)Agilent HypersilODS 的 4. 0 X 250 mm, 5 Mm 色譜柱。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紫花苜蓿葉黃素循環(huán)組分的檢測(cè)方法，其特征在于所述濃度線性梯度洗脫，流動(dòng)相A液為100%乙腈，B液為100%水，濃度線性梯度洗脫程序?yàn)?0% A液+ 10% B液洗脫15min，接著在5min內(nèi)，90% A液濃度線性遞增至100%的A液，之后再洗脫.20 min,流速1ml/min,檢測(cè)波長(zhǎng)445 nm,柱子溫度30°C,進(jìn)樣體積10 μl。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紫花苜蓿葉黃素循環(huán)組分的檢測(cè)方法，其特征在于所述紫花苜蓿葉黃素循環(huán)組分玉米黃質(zhì)0119、環(huán)氧玉米黃質(zhì)0231和紫黃質(zhì)0259標(biāo)樣購(gòu)自瑞士carotenature 原裝，純度分別為 99. 6%,95. 7% 和 .98. 6%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紫花苜蓿葉黃素循環(huán)組分的檢測(cè)方法，其特征在于所述紫花苜蓿葉黃素提取過程在無光條件下進(jìn)行。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紫花苜蓿葉黃素循環(huán)組分的檢測(cè)方法，其特征在于所述試劑丙酮為分析純，水為超純水，乙腈為色譜純。
7.如權(quán)利要求1所述的紫花苜蓿葉黃素循環(huán)組分的檢測(cè)方法，其特征在于準(zhǔn)確稱量玉米黃質(zhì)0. 96 mg,環(huán)氧玉米黃質(zhì)1. 128 mg,紫黃質(zhì)1. 536 mg,用甲醇定容100 ml容量瓶中，取上述儲(chǔ)備液1 ml，分別稀釋10倍、50倍、100倍和200倍，分別取10 μl稀釋后的標(biāo)樣進(jìn)樣到美國(guó)Agilent 1100高效液相色譜儀中，用美國(guó)Agilent Hypersil 0DSC4. OX250 mm,.5 Mm)色譜柱，流動(dòng)相A液為100%乙腈，B液為100%水，梯度洗脫程序90%A液+10%B液洗脫15 min,接著在5 min內(nèi)，90%A液濃度線性遞增至100%的A液，之后再洗脫20 min,流速.1ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)445 nm，柱子溫度30°C，以它們的峰面積和濃度進(jìn)行線性回歸，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，玉米黃質(zhì)、環(huán)氧玉米黃質(zhì)和紫黃質(zhì)的保留時(shí)間分別為15. 38 min、10. 20 min和6. 90min ;在暗室中，取紫花苜蓿鮮葉0.1g放入研缽中，然后倒入液氮迅速研磨至粉末狀，加入.85%丙酮，勻漿2-3 min，再加入100%丙酮，勻漿I min，之后將研缽置于冰上15 min, 1200g離心10 min,取上清液用0. 45 μ m微孔濾膜過濾后,取.10 μl體積進(jìn)樣到美國(guó)Agilent.1100高效液相色譜儀中,用美國(guó)Agilent Hypersil ODS的.4. 0X250 mm, 5 Mm色譜柱,流動(dòng)相A液為100%乙腈，B液為100%水，梯度洗脫程序90%A液+10%B液洗脫15 min,接著在.5min內(nèi)，90%A液濃度線性遞增至100%的A液，之后再洗脫20 min,流速I ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)445 nm，柱子溫度30°C，紫花苜蓿玉米黃質(zhì)、環(huán)氧玉米黃質(zhì)和紫黃質(zhì)的保留時(shí)間分別與標(biāo)樣的保留時(shí)間一致，最后測(cè)出玉米黃質(zhì)、環(huán)氧玉米黃質(zhì)、紫黃質(zhì)的含量。
全文摘要
紫花苜蓿葉黃素循環(huán)組分的檢測(cè)方法，取紫花苜蓿鮮葉0.1g,倒入液氮研磨至粉末狀，加入85%丙酮，勻漿2-3 min，再加入100%丙酮，勻漿1 min之后置于冰上15 min，1200g離心10 min，取上清液用0.45 μm微孔濾膜過濾后，取10 μl進(jìn)樣到美國(guó)Agilent 1100高效液相色譜儀中采用濃度線性梯度洗脫，用美國(guó)Agilent Hypersil ODS(4.0×250 mm，5 μm)色譜柱，流動(dòng)相A液為100%乙腈，B液為100%水，濃度線性梯度洗脫程序?yàn)?0% A液 + 10% B液洗脫15 min，接著在5min內(nèi)，90% A液濃度線性遞增至100%的A液，之后再洗脫20 min，流速1 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)445 nm，柱子溫度30℃。最后檢測(cè)出紫花苜蓿葉黃素循環(huán)組分玉米黃質(zhì)(Z)、環(huán)氧玉米黃質(zhì)(A)和紫黃質(zhì)(V)的含量。
文檔編號(hào)G01N30/02GK103063758SQ201210513000
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2012年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月4日
發(fā)明者姜華, 何承剛, 畢玉芬, 單貴蓮, 馬向麗, 辛培堯 申請(qǐng)人:云南農(nóng)業(yè)大學(xué)