專利名稱：起因于hpv的癌細(xì)胞的檢測方法、組織是否為重度不典型增生以上階段組織的判斷方法及 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種起因于HPV的癌細(xì)胞的檢測方法、組織是否為重度不典型增生以 上階段組織的判斷方法及其所用引物對和試劑盒。
背景技術(shù)：
人類乳頭狀瘤病毒(Human papillomavirus，以下稱“HPV”)是一種以雙鏈閉環(huán) DNA為基因組的病毒，容易誘發(fā)增生性病變。HPV分類為100多種亞型。已知HPV的亞型的 共同區(qū)域有編碼非結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)的El區(qū)、E2區(qū)、E4區(qū)、E5區(qū)、E6區(qū)和E7區(qū)、編碼外殼蛋白 質(zhì)的Ll區(qū)和L2區(qū)以及LCR。HPV的DNA從宮頸癌和宮頸部不典型增生的病變部位以及口腔癌和咽喉癌的組織 檢出。因此，感染HPV被認(rèn)為是宮頸癌、口腔癌和咽喉癌的風(fēng)險因素之一。多數(shù)情況下感染 HPV的方式都是從感染開始一定時間后HPV從細(xì)胞自然消失的一過性感染。然而，HPV感染 中有5 10%的感染為HPV不消失、引起宮頸癌的持續(xù)性感染。在宮頸組織診斷中，宮頸部位不典型增生作為癌細(xì)胞產(chǎn)生的前期階段，根據(jù)上皮 內(nèi)出現(xiàn)異型細(xì)胞的程度分為輕度、中度及重度三個階段的不典型增生。從重度不典型增生 再進(jìn)一步惡化，宮頸部位不典型增生病變?yōu)榘┘?xì)胞出現(xiàn)在上皮內(nèi)的階段。宮頸部位不典型 增生還進(jìn)一步進(jìn)展為癌細(xì)胞局限于上皮內(nèi)的“上皮內(nèi)癌”以及癌細(xì)胞從上皮擴(kuò)展到皮下組 織的“微小浸潤扁平上皮癌”和“浸潤扁平上皮癌”。輕度不典型增生或中度不典型增生的病變基本上都不進(jìn)行治療，只觀察進(jìn)展。然 而放縱重度不典型增生的前驅(qū)病變不治療，病變很可能會進(jìn)展為浸潤癌，因此對于診斷為 重度不典型增生的受檢者大多實施手術(shù)等治療。因此，判斷受檢者病變是否為重度不典型 增生或比此更嚴(yán)重的階段對于決定受檢者的治療方法是十分重要的。高等真核生物的染色體DNA中，構(gòu)成DNA的堿基中胞嘧啶的第5位會被甲基化。高 等真核生物中的DNA甲基化作為抑制基因信息表達(dá)的機(jī)構(gòu)發(fā)揮其作用。近年來，有報告顯 示在基因組DNA中有無HPV甲基化與癌癥的發(fā)病有著非常密切的關(guān)系。比如，專利文獻(xiàn)1中記載，當(dāng)患者宮頸部位的細(xì)胞中所含HPV的E6區(qū)和LCR未甲 基化時，宮頸癌細(xì)胞的存在會得到更強(qiáng)的顯示。然而，未甲基化的E6區(qū)和LCR有時會從宮 頸癌細(xì)胞以外的細(xì)胞中檢測出來。因此，很難僅通過確認(rèn)E6區(qū)和LCR的甲基化狀態(tài)就從患 者宮頸部位的細(xì)胞中精確地檢測出起因于HPV的癌細(xì)胞。非專利文獻(xiàn)1中記載，在宮頸癌中，HPV-18的Ll區(qū)雖然甲基化程度很高，但LCR和 E6區(qū)卻未甲基化。在此，非專利文獻(xiàn)1是先決定用與HPV-18基因組DNA相應(yīng)的亞硫酸氫鹽 處理后的核酸的堿基序列，再確認(rèn)其甲基化狀態(tài)。然而，這種通過決定堿基序列來確認(rèn)DNA 甲基化的方法費(fèi)時且操作煩瑣。很難從采自受檢者的試樣中簡便地檢測出起因于HPV的癌 細(xì)胞。非專利文獻(xiàn)1 Tolga Turan et al.，病毒學(xué)(Virology) 349 (2006) 175-183
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專利文獻(xiàn)1 特表2006-522607號公報

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種精確、簡便地檢測出起因于HPV的癌細(xì)胞的方法。 本發(fā)明的另一目的是提供一種能夠精確、簡便地判斷組織是否為重度不典型增生以上階段 的組織。本發(fā)明還提供一種能夠精確、簡便地檢測出起因于HPV的癌細(xì)胞和判斷組織是否 處于重度不典型增生以上階段的引物對。8口，本發(fā)明涉及(1) 一種起因于HPV的癌細(xì)胞檢測方法，包括以下步驟(A)從受檢者細(xì)胞中制備含有DNA的試樣；(B)使上述步驟(A)獲得的試樣中所含DNA中的非甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)換為其他堿基， 獲取轉(zhuǎn)換試樣；(C)用上述步驟(B)獲得的轉(zhuǎn)換試樣、第一引物和第二引物以由第一引物雜交部 位到第二引物雜交部位之間連續(xù)的堿基序列構(gòu)成的核酸為擴(kuò)增對象進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，其 中第一引物與HPV的L1區(qū)或L2區(qū)中有CpG部位的堿基序列中由存在于CpG部位以外的胞 嘧啶轉(zhuǎn)換為其他堿基的堿基序列構(gòu)成的核酸雜交，第二引物與HPV的LCR或E6區(qū)中有CpG 部位的堿基序列中由胞嘧啶轉(zhuǎn)換為其他堿基的堿基序列構(gòu)成的核酸雜交；及(D)根據(jù)上述步驟(C)的核酸擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果，檢測出起因于HPV的癌細(xì)胞；(2)上述(1)所述檢測方法，其特征在于所述步驟(A)包括(a)混合含有表面活性劑的溶液和受檢者細(xì)胞，獲得混合物、(b)將上述步驟(a)獲得的混合物進(jìn)行離心分離，沉淀不溶物，獲得上清、及(c)分取上述步驟(b)獲得的上清；(3)上述(2)所述檢測方法，其特征在于所述步驟(A)在步驟(a)和步驟(b)之間還有步驟(al)，在步驟(al)，對步驟(a) 獲得的混合物進(jìn)行物理處理，使DNA從細(xì)胞中游離，在所述步驟(b)將上述步驟(al)獲得的產(chǎn)物進(jìn)行離心分離，沉淀不溶物，獲得上 清；(4) 一種判斷組織是否處于重度不典型增生以上階段的判斷方法，包括以下步 驟(A)從受檢者組織制備含有DNA的試樣；(B)將上述步驟(A)獲得的試樣所含DNA中的非甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)換為其他堿基，獲 取轉(zhuǎn)換試樣；(C)用上述步驟(B)獲得的轉(zhuǎn)換試樣、第一引物和第二引物，以由第一引物雜交部 位到第二引物雜交部位之間的連續(xù)的堿基序列構(gòu)成的核酸為擴(kuò)增對象進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)， 其中第一引物與HPV的L1區(qū)或L2區(qū)中有CpG部位的堿基序列中由存在于CpG部位以外的 胞嘧啶轉(zhuǎn)換為其他堿基的堿基序列構(gòu)成的核酸雜交，第二引物與HPV的LCR或E6區(qū)有CpG 部位的堿基序列中由胞嘧啶轉(zhuǎn)換為其他堿基的堿基序列構(gòu)成的核酸雜交；及(D)根據(jù)上述步驟(C)的核酸擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果判斷組織是否處于重度不典型增生以 上階段；
(5)上述(4)所述判斷方法，其特征在于組織是宮頸部位的組織；(6) 一種引物對，這種引物對用于通過核酸擴(kuò)增反應(yīng)擴(kuò)增在由非甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn) 換為其他堿基的HPV基因組DNA堿基序列構(gòu)成的核酸中由第一引物雜交部位到第二引物雜 交部位之間的連續(xù)的堿基序列構(gòu)成的核酸，該引物對包括第一引物，與HPV的L1區(qū)或L2區(qū)中有CpG部位的堿基序列中由存在于CpG部位 以外的胞嘧啶轉(zhuǎn)換為其他堿基的堿基序列構(gòu)成的核酸雜交，第二引物，與HPV的LCR或E6區(qū)中有CpG部位的堿基序列中由胞嘧啶轉(zhuǎn)換為其他 堿基的堿基序列構(gòu)成的核酸雜交；(7)上述(6)所述引物對，其特征在于第一引物是一種與HPV的L1區(qū)中有CpG部 位的堿基序列中由存在于CpG部位以外的胞嘧啶轉(zhuǎn)換為其他堿基的堿基序列構(gòu)成的核酸 雜交的引物；(8)上述(6)所述引物對，其特征在于第二引物是一種與HPV的LCR中有CpG部 位的堿基序列中由胞嘧啶轉(zhuǎn)換為其他堿基的堿基序列構(gòu)成的核酸雜交的引物；(9)上述(6)所述引物對，其特征在于其他堿基指尿嘧啶或胸腺嘧啶；(10)上述(6)所述引物對，其特征在于第一引物和第二引物均用于通過聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(PCR)、鏈置換反應(yīng)法、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(LCR)或轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增法擴(kuò)增核酸；(11) 一種起因于HPV的癌癥診斷用試劑盒，包括上述(6)所述引物對以及將核酸 中的非甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)換為其他堿基的非甲基化胞嘧啶誘變劑；(12)上述(11)所述診斷用試劑盒，其特征在于非甲基化胞嘧啶誘變劑是亞硫酸
氫鹽；(13)上述(11)所述診斷用試劑盒，其特征在于起因于HPV的癌癥為宮頸癌、口 腔癌或咽喉癌；(14) 一種不典型增生階段診斷用試劑盒，其包括上述(6)所述引物對和將核酸中 的非甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)換為其他堿基的非甲基化胞嘧啶誘變劑。


圖1為HPV基因結(jié)構(gòu)的簡要說明圖。圖2為植入SiHa細(xì)胞的HPV16的基因組DNA中甲基化CpG部位和非甲基化CpG 部位的模式圖。圖3為電泳圖，顯示了用實施例1、比較例1和比較例2的各引物對和由正常組織 試樣及癌組織試樣制備的各分析用試樣進(jìn)行核酸擴(kuò)增后的擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)果。圖4為植入C4-1細(xì)胞的HPV18的基因組DNA中甲基化CpG部位和非甲基化CpG 部位的模式圖。圖5為顯示用實施例1的引物對和從手術(shù)摘取試樣及活檢試樣制備的各分析用試 樣進(jìn)行核酸擴(kuò)增后擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)果的電泳圖。圖6為顯示來源于手術(shù)摘取試樣的HPV18的基因組DNA中甲基化CpG部位和非甲 基化CpG部位的模式圖。圖7為顯示來源于手術(shù)摘取試樣的HPV58的基因組DNA中甲基化CpG部位和非甲 基化CpG部位的模式圖。
圖8為顯示來源于活檢試樣的HPV58的基因組DNA中甲基化CpG部位和非甲基化 CpG部位的模式圖。
具體實施例方式本發(fā)明的引物對包括第一引物和第二引物，第一引物與HPV的L1區(qū)或L2區(qū)中有 CpG部位的堿基序列(也稱“第一堿基序列”)中由存在于CpG部位以外的胞嘧啶轉(zhuǎn)換為其 他堿基的堿基序列(也稱“第二堿基序列”)構(gòu)成的核酸雜交，第二引物與HPV的LCR或E6 區(qū)中有CpG部位的堿基序列(也稱“第三堿基序列”)中由胞嘧啶轉(zhuǎn)換為其他堿基的堿基 序列(也稱“第四堿基序列”)構(gòu)成的核酸雜交，此引物對用于通過核酸擴(kuò)增反應(yīng)擴(kuò)增由與 HPV的基因組DNA相應(yīng)的非甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)換為其他堿基的堿基序列構(gòu)成的核酸中由第一 引物雜交部位到第二引物雜交部位之間連續(xù)的堿基序列構(gòu)成的的核酸。上述第二堿基序列 是通過轉(zhuǎn)換第一堿基序列構(gòu)成的核酸而形成的核酸的堿基序列，除存在于CpG部位以外的 胞嘧啶轉(zhuǎn)換為其他堿基外，均與第一堿基序列對應(yīng)。上述第四堿基序列是轉(zhuǎn)換由第三堿基 序列構(gòu)成的核酸后形成的核酸的堿基序列，除全部胞嘧啶轉(zhuǎn)換為其他堿基外，均與第三堿 基序列相對應(yīng)。本發(fā)明的引物對具有一大特征就是含有第一引物和第二引物，其中第一引物與 HPV的L1區(qū)或L2區(qū)有CpG部位的堿基序列中由存在于CpG部位以外的胞嘧啶轉(zhuǎn)換為其他 堿基的堿基序列構(gòu)成的核酸雜交，第二引物與HPV的LCR或E6區(qū)有CpG部位的堿基序列中 由胞嘧啶轉(zhuǎn)換為其他堿基的堿基序列構(gòu)成的核酸雜交。起因于HPV的癌細(xì)胞中所含HPV基因組DNA的L2區(qū)或L1區(qū)的CpG部位的胞嘧啶 被甲基化，且LCR或E6區(qū)中的CpG部位胞嘧啶未甲基化。因此，將本發(fā)明的引物對用于核 酸擴(kuò)增反應(yīng)，可以特異性地擴(kuò)增由與造成癌變的HPV的基因組DNA相應(yīng)的非甲基化胞嘧啶 轉(zhuǎn)換為其他堿基的堿基序列構(gòu)成的核酸。以此，使用本發(fā)明的引物對可以精確、簡便地檢測 出起因于HPV的癌細(xì)胞。因此，使用本發(fā)明的引物對也可以精確、簡便地診斷宮頸癌、口腔 癌及咽喉癌。存在于重度不典型增生以上階段的病變部位的HPV基因組DNA，其L2區(qū)或L1區(qū)的 CpG部位的胞嘧啶甲基化，且LCR或E6區(qū)中的CpG部位胞嘧啶未甲基化。因此，將本發(fā)明的 引物對用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)，可以特異性地擴(kuò)增由與存在于重度不典型增生以上階段的病變 部位的HPV基因組DNA相應(yīng)的非甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)換為其他堿基的堿基序列構(gòu)成的核酸。因 此，使用本發(fā)明的引物對可以精確、簡便地診斷不典型增生的階段。而且，使用本發(fā)明的引 物對可以精確、簡便地判斷組織是否處于重度不典型增生以上階段。另外，本說明書中所謂起因于HPV的癌細(xì)胞指因感染HPV而癌變的細(xì)胞和有很高 癌變風(fēng)險的細(xì)胞。更具體而言，所謂起因于HPV的癌細(xì)胞指引起宮頸癌、口腔癌或咽喉癌癥 狀的感染HPV細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞、口腔癌細(xì)胞或咽喉癌細(xì)胞。在本說明書中，所謂“重度不典型增生以上階段”指日本婦產(chǎn)科學(xué)會根據(jù)“宮頸癌 處置規(guī)則1997”的分類，分類為“重度不典型增生”或比此更嚴(yán)重的階段-“上皮內(nèi)癌”、“微 小浸潤扁平上皮癌”或“浸潤扁平上皮癌”的階段。一旦判斷組織病變?yōu)檫@些階段的病變， 受檢者幾乎都需要手術(shù)等治療，因此，判斷病變是否處于重度不典型增生以上階段在臨床 上非常重要。另一方面，比“重度不典型增生”輕的病變分類為“上皮無異?！薄ⅰ拜p度不典型增生”或“中度不典型增生”。病變在此階段，受檢者幾乎都不必實施特別的治療，僅觀察其進(jìn)展。在本說明書中，所謂“異常細(xì)胞”指異型細(xì)胞和癌細(xì)胞。在此，所謂“異型細(xì)胞”指 雖然不是癌細(xì)胞，但確認(rèn)有核腫大、核染質(zhì)增量、核形不規(guī)則等核異常的細(xì)胞。如上所述，起因于HPV的癌細(xì)胞有L2區(qū)或L1區(qū)的CpG部位的胞嘧啶被甲基化、 LCR或E6區(qū)中的CpG部位胞嘧啶未甲基化的HPV基因組DNA。用使非甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)換為 其他堿基的非甲基化胞嘧啶誘變劑對上述起因于HPV的癌細(xì)胞中所含HPV基因組DNA進(jìn)行 處理時，L2區(qū)或L1區(qū)的CpG部位的胞嘧啶不轉(zhuǎn)換為其他堿基，而LCR或E6區(qū)中的CpG部 位胞嘧啶轉(zhuǎn)換為其他堿基。因此，使用本發(fā)明的引物對，可以讓用非甲基化胞嘧啶誘變劑處 理的HPV基因組DNA中、L2區(qū)或L1區(qū)的CpG部位仍為由胞嘧啶和鳥嘌呤構(gòu)成的二核苷酸 堿基序列，僅對LCR或E6區(qū)中的CpG部位胞嘧啶轉(zhuǎn)換為其他堿基的核酸通過核酸擴(kuò)增反應(yīng) 進(jìn)行擴(kuò)增。在本發(fā)明的引物對中，第一引物與HPV的L1區(qū)或L2區(qū)有CpG部位的堿基序列中 由存在于CpG部位以外的胞嘧啶轉(zhuǎn)換為其他堿基的堿基序列構(gòu)成的核酸雜交。第二引物與 HPV的LCR或E6區(qū)有CpG部位的堿基序列中由胞嘧啶轉(zhuǎn)換為其他堿基的堿基序列構(gòu)成的核 酸雜交。因此，使用本發(fā)明的引物對可以通過一次核酸擴(kuò)增反應(yīng)擴(kuò)增經(jīng)與癌變原因-HPV基 因組DNA中的DNA相應(yīng)的經(jīng)非甲基化胞嘧啶誘變劑處理過的核酸，其中所述DNA為至少包 括L2區(qū)或L1區(qū)的一部分及LCR或E6區(qū)的一部分的連續(xù)區(qū)DNA。HPV 是約 8kb 的環(huán)狀 DNA 病毒。HPV 有 HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、 HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68、HPV73、HPV82 等。HPV基因組如圖1所示，有編碼非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的早期基因的開放閱讀框(E1區(qū)、E2 區(qū)、E4區(qū)、E5區(qū)、E6區(qū)及E7區(qū))、編碼外殼蛋白質(zhì)的晚期基因的開放閱讀框(L1區(qū)和L2區(qū)) 以及LCR的基因區(qū)。E1區(qū)是參與病毒基因組復(fù)制的區(qū)域。E2區(qū)是參與病毒轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的區(qū) 域。E5區(qū)、E6區(qū)及E7區(qū)參與癌變。E6區(qū)與癌抑制基因p53結(jié)合、編碼促進(jìn)p53分解的蛋 白質(zhì)。E7區(qū)與癌抑制基因Rb結(jié)合、編碼使Rb失活的蛋白質(zhì)。L1區(qū)和L2區(qū)參與外殼形成。 LCR(Long control region，長調(diào)控區(qū))參與調(diào)節(jié)病毒基因表達(dá)。一般來說，HPV感染、侵入細(xì)胞，則HPV的基因組DNA其中的CpG部位中一定CpG 部位的胞嘧啶被生物體內(nèi)的DNA甲基化機(jī)構(gòu)甲基化。其中，在宮頸癌細(xì)胞中的HPV中，如圖 2所示，L1區(qū)和L2區(qū)中CpG部位的胞嘧啶被甲基化，LCR和E6區(qū)CpG部位的胞嘧啶未甲基 化。表1為感染HPV細(xì)胞中所含HPV基因組DNA的L1區(qū)和L2區(qū)以及LCR和E6區(qū)的 CpG部位的甲基化狀態(tài)。在此，表1所示感染HPV細(xì)胞中感染HPV細(xì)胞2為起因于HPV的 癌細(xì)胞。表1中，“〇”表示CpG部位的胞嘧啶甲基化，“ X ”表示CpG部位的胞嘧啶未甲基 化。[表 1]
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權(quán)利要求
一種起因于HPV的癌細(xì)胞的檢測方法，包括以下步驟(A)從受檢者細(xì)胞中制備含有DNA的試樣；(B)使所述步驟(A)獲得的試樣中所含DNA中的非甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)換為其他堿基，獲取轉(zhuǎn)換試樣；(C)用所述步驟(B)獲得的轉(zhuǎn)換試樣、第一引物和第二引物以由第一引物雜交部位到第二引物雜交部位之間連續(xù)的堿基序列構(gòu)成的核酸為擴(kuò)增對象進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，其中第一引物與HPV的L1區(qū)或L2區(qū)中有CpG部位的堿基序列中由存在于CpG部位以外的胞嘧啶轉(zhuǎn)換為其他堿基的堿基序列構(gòu)成的核酸雜交，第二引物與HPV的LCR或E6區(qū)中有CpG部位的堿基序列中由胞嘧啶轉(zhuǎn)換為其他堿基的堿基序列構(gòu)成的核酸雜交；及(D)根據(jù)所述步驟(C)的核酸擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果，檢測起因于HPV的癌細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測方法，其特征在于，所述步驟(A)包括(a)混合含有表面活性劑的溶液和受檢者細(xì)胞，獲得混合物；(b)將所述步驟(a)獲得的混合物進(jìn)行離心分離，沉淀不溶物，獲得上清；及(c)分取所述步驟(b)獲得的上清。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述檢測方法，其特征在于所述步驟(A)在步驟(a)和步驟(b)之間還有步驟(al)，即對步驟(a)獲得的混合物 進(jìn)行物理處理，使DNA從細(xì)胞中游離，在所述步驟(b)將所述步驟(al)獲得的產(chǎn)物進(jìn)行離心分離，沉淀不溶物，獲得上清。
4.一種判斷組織是否處于重度不典型增生以上階段的判斷方法，包括以下步驟(A)從受檢者組織制備含有DNA的試樣；(B)將所述步驟(A)獲得的試樣中所含DNA中的非甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)換為其他堿基，獲取 轉(zhuǎn)換試樣；(C)用所述步驟(B)獲得的轉(zhuǎn)換試樣、第一引物和第二引物，以由第一引物雜交部位到 第二引物雜交部位之間的連續(xù)的堿基序列構(gòu)成的核酸為擴(kuò)增對象進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，其中 第一引物與HPV的Ll區(qū)或L2區(qū)有CpG部位的堿基序列中由存在于CpG部位以外的胞嘧啶 轉(zhuǎn)換為其他堿基的堿基序列構(gòu)成的核酸雜交，第二引物與HPV的LCR或E6區(qū)有CpG部位的 堿基序列中由胞嘧啶轉(zhuǎn)換為其他堿基的堿基序列構(gòu)成的核酸雜交；及(D)根據(jù)所述步驟(C)的核酸擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果，判斷組織是否處于重度不典型增生以上 階段。
5.權(quán)利要求4所述判斷方法，其特征在于組織為宮頸部位的組織。
6.一種引物對，這種引物對通過核酸擴(kuò)增反應(yīng)擴(kuò)增在由非甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)換為其他堿 基的HPV基因組DNA堿基序列構(gòu)成的核酸中由第一引物雜交部位到第二引物雜交部位之間 的連續(xù)的堿基序列構(gòu)成的核酸，該引物對包括第一引物，與HPV的Ll區(qū)或L2區(qū)中有CpG部位的堿基序列中由存在于CpG部位以外 的胞嘧啶轉(zhuǎn)換為其他堿基的堿基序列構(gòu)成的核酸雜交，第二引物，與HPV的LCR或E6區(qū)中有CpG部位的堿基序列中由胞嘧啶轉(zhuǎn)換為其他堿基 的堿基序列構(gòu)成的核酸雜交。
7.權(quán)利要求6所述引物對，其特征在于第一引物是一種與HPV的Ll區(qū)中有CpG部位的堿基序列中由存在于CpG部位以外的胞嘧啶轉(zhuǎn)換為其他堿基的堿基序列構(gòu)成的核酸雜交的引物。
8.權(quán)利要求6所述引物對，其特征在于第二引物是一種與HPV的LCR中有CpG部位的堿基序列中由胞嘧啶轉(zhuǎn)換為其他堿基的 堿基序列構(gòu)成的核酸雜交的引物。
9.權(quán)利要求6所述引物對，其特征在于其他堿基指尿嘧啶或胸腺嘧啶。
10.權(quán)利要求6所述引物對，其特征在于第一引物和第二引物均用于通過聚合酶鏈?zhǔn)?反應(yīng)法、鏈置換反應(yīng)法、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法或轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增法擴(kuò)增核酸。
11.一種起因于HPV的癌癥診斷用試劑盒，它包括權(quán)利要求6所述引物對和將核酸中的 非甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)換為其他堿基的非甲基化胞嘧啶誘變劑。
12.權(quán)利要求11所述診斷用試劑盒，其特征在于非甲基化胞嘧啶誘變劑是亞硫酸氫鹽。
13.權(quán)利要求11所述診斷用試劑盒，其特征在于起因于HPV的癌癥為宮頸癌、口腔癌 或咽喉癌。
14.一種不典型增生階段診斷用試劑盒，包括權(quán)利要求6所述引物對和將核酸中的非 甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)換為其他堿基的非甲基化胞嘧啶誘變劑。
全文摘要
本發(fā)明提供一種能夠精確、簡便地檢測起因于HPV的癌細(xì)胞、判斷組織是否為重度不典型增生以上階段組織的引物對、方法及其試劑盒。所用引物對包括第一引物和第二引物，其中第一引物與HPVL1區(qū)或L2區(qū)中有CpG部位的堿基序列中由在CpG部位以外的胞嘧啶轉(zhuǎn)換為其他堿基的堿基序列構(gòu)成的核酸雜交，第二引物與LCR或E6區(qū)中有CpG部位的堿基序列中由胞嘧啶轉(zhuǎn)換為其他堿基的堿基序列構(gòu)成的核酸雜交。
文檔編號C12Q1/68GK101978075SQ20098011019
公開日2011年2月16日 申請日期2009年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月21日
發(fā)明者岡智子, 梶田昌裕 申請人:希森美康株式會社