用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲的納米結(jié)構(gòu)微流控芯片及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】一種用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲及治療的納米結(jié)構(gòu)微流控芯片及其制備方法，屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明設(shè)計(jì)了兩種納米結(jié)構(gòu)，硅納米線(xiàn)陣列和SiO2及TiO2反蛋白結(jié)構(gòu)的光子晶體，納米結(jié)構(gòu)具有粗糙的表面形貌，尺寸上能與循環(huán)腫瘤細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)有效接觸，對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行倒置捕獲。在芯片的組裝過(guò)程采用簡(jiǎn)易的膠水封裝，使得芯片的制作過(guò)程更加簡(jiǎn)單易行。此外，結(jié)合納米磁性復(fù)合材料的光動(dòng)力治療作用，在芯片內(nèi)實(shí)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的原位治療，為了進(jìn)一步實(shí)用化，我們?cè)O(shè)計(jì)并在芯片內(nèi)嵌入光纖，導(dǎo)入激光，方便的實(shí)現(xiàn)芯片內(nèi)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的原位治療。最后，我們還進(jìn)一步提出微流控芯片可植入的開(kāi)放設(shè)想。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲的納米結(jié)構(gòu)微流控芯片及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞(循環(huán)腫瘤細(xì)胞是脫離原發(fā)腫瘤部位的癌細(xì)胞，作為一種癌癥監(jiān)測(cè)的標(biāo)志物)捕獲及治療的納米結(jié)構(gòu)微流控芯片及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]癌癥作為人類(lèi)致死的重大疾病，之所以死亡率如此地高以及難以治愈，主要是在于癌癥發(fā)現(xiàn)晚及擴(kuò)散。早期診斷和對(duì)癌細(xì)胞擴(kuò)散的抑制乃至治療對(duì)改善癌癥治療現(xiàn)狀有著重要意義。
[0003]癌癥患者血液外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的數(shù)量極少，循環(huán)腫瘤細(xì)胞的數(shù)目為I?10個(gè)/mL，故從幾百萬(wàn)的白細(xì)胞和數(shù)十億的紅細(xì)胞中有效地分選富集并將稀少的循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲成為一個(gè)難題。
[0004]早期應(yīng)用免疫磁珠富集技術(shù)，分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞[1]，然而這種方法的檢測(cè)靈敏度不足，技術(shù)成本高;之后開(kāi)始利用細(xì)胞的物理特性進(jìn)行分離[2]，例如循環(huán)腫瘤細(xì)胞相比較血液中的白細(xì)胞和紅細(xì)胞尺寸存在差異，制備一定尺寸的過(guò)濾膜，對(duì)細(xì)胞流體進(jìn)行過(guò)濾，從而分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞，這種方法的特異性不足。2007年通過(guò)光刻蝕得到微柱[3]，并結(jié)合微流控芯片對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行捕獲，微流控芯片被開(kāi)始應(yīng)用于解決循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲的問(wèn)題。
[0005]2009年提出應(yīng)用化學(xué)法刻蝕制備了硅納米線(xiàn)陣列[4]，由于納米結(jié)構(gòu)增加了與細(xì)胞接觸的表面積，并且增加了表面粗糙度，與細(xì)胞的偽足絨毛等表面結(jié)構(gòu)的尺寸相當(dāng)，依靠細(xì)胞與納米結(jié)構(gòu)界面之間的接觸可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的捕獲，化學(xué)法刻蝕形成的納米結(jié)構(gòu)相比較光刻蝕制備的納米微柱微結(jié)構(gòu)，尺寸上更小，表面形貌更為豐富，制備工藝及成本也更加有優(yōu)勢(shì)，成為微流控芯片微結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的新形勢(shì)。
[0006]然而現(xiàn)存方法對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的捕獲效率及捕獲純度與臨床應(yīng)用需求仍然存在很大差距，由于抗原抗體的相互反應(yīng)需要充分接觸及反應(yīng)時(shí)間，微流控芯片不能實(shí)現(xiàn)快速的檢測(cè)，而且捕獲效率和捕獲純度仍然有限。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明為了改善目前微流控芯片存在的問(wèn)題，結(jié)合已有的循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲方法，將化學(xué)法制備的納米結(jié)構(gòu)作為細(xì)胞捕獲結(jié)構(gòu)，與玻璃片或PDMS基底通過(guò)封裝膠水組裝成簡(jiǎn)易微流控芯片，進(jìn)一步利用表面修飾抗體的納米磁性復(fù)合材料首先與循環(huán)腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合，再通過(guò)設(shè)有外磁場(chǎng)的微流控芯片體系，從細(xì)胞懸液或全血中依靠磁力的物理作用進(jìn)行分離，進(jìn)一步到達(dá)置于上層的納米結(jié)構(gòu)層，納米結(jié)構(gòu)具有粗糙的表面形貌，尺寸上能與細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)有效接觸，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行倒置捕獲。本發(fā)明設(shè)計(jì)了兩種納米結(jié)構(gòu):硅納米線(xiàn)陣列和S12及T12反蛋白結(jié)構(gòu)的光子晶體;在芯片的組裝過(guò)程采用簡(jiǎn)易的膠水封裝，使得芯片的制作過(guò)程更加簡(jiǎn)單易行。此外，結(jié)合納米磁性復(fù)合材料的光動(dòng)力治療作用，在芯片內(nèi)實(shí)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的原位治療，為了進(jìn)一步實(shí)用化，我們?cè)O(shè)計(jì)并在芯片內(nèi)嵌入光纖，導(dǎo)入激光，方便的實(shí)現(xiàn)芯片內(nèi)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的原位治療。最后，我們還進(jìn)一步提出微流控芯片可植入的開(kāi)放設(shè)想。
[0008]—種用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲的納米結(jié)構(gòu)微流控芯片及其制備方法，
[0009](I)納米結(jié)構(gòu)的制備
[0010]硅納米線(xiàn)陣列的制備:將硅片超聲清洗10?30min，再用去離子水沖洗后放入濃硫酸和過(guò)氧化氫組成的piranha溶液(食人魚(yú)溶液)中浸泡2?12h，取出的娃片用去離子水沖洗后，放入硝酸銀和氫氟酸組成的刻蝕溶液中避光反應(yīng)I?3h;然后再將刻蝕后的硅片放入體積分?jǐn)?shù)為15?30%的硝酸水溶液中浸洗I?2h，從而在硅片表面得到垂直于硅片表面生長(zhǎng)的娃納米線(xiàn)陣列，娃納米線(xiàn)的直徑為50?10nm，長(zhǎng)度5?50μηι，單位面積內(nèi)納米線(xiàn)的密度是30?40個(gè)Λ?2。
[ΟΟ??] 反蛋白石結(jié)構(gòu)光子晶體的制備:將20mL?30mL MMA(甲基丙稀酸甲酷)用100?200mL、濃度為0.03?0.04mol/L的氫氧化鈉水溶液清洗3?4遍，將2?5mL清洗過(guò)的MMA和30?50mL的去離子水混合后加熱，在80?90°C條件下加入10?20mg的K2S2O8反應(yīng)60?lOOmin，得到單分散的PMMA納米球溶液，PMMA納米球的尺寸為200?600nm;將干凈的載玻片垂直插入單分散的PMMA納米球液體中，在30?40 °C條件下保持20?24h，烘干，再在100?120 °(:條件下烘40?60min (強(qiáng)化結(jié)構(gòu))，從而在載玻片表面上得到PMMA蛋白石結(jié)構(gòu);該蛋白石結(jié)構(gòu)為緊密排列的球陣列，厚度為130?900nm(可以為多層球陣列)，球心間距為200?600nm;將S12或T12前驅(qū)體溶液(T12前驅(qū)體溶液是由化學(xué)純鈦酸丁酯8?12mL、無(wú)水乙醇8?12mL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)65%?68%硝酸水溶液0.5?2mL混合后配制而成；S12前驅(qū)體溶液由質(zhì)量分?jǐn)?shù)25?30 %的硅酸乙酯3?4mL、無(wú)水乙醇8?12mL和質(zhì)量分?jǐn)?shù)30?40 %的鹽酸水溶液0.0I?0.05mL混合后配制而成)逐滴滴到PMMA蛋白石結(jié)構(gòu)表面(其自行慢慢滲入)，然后在450?550°C進(jìn)行熱處理2?4h，在載玻片表面得到380?980nm光子帶隙的反蛋白石結(jié)構(gòu)光子晶體，為規(guī)則的反蛋白石結(jié)構(gòu)，反蛋白石結(jié)構(gòu)為原PMMA球緊密堆積的蛋白石結(jié)構(gòu)在滲入T12或S12前驅(qū)體溶液后，經(jīng)熱處理后PMMA納米球被去除，剩下圍繞球堆積輪廓的T12或S12的結(jié)構(gòu)，反蛋白石結(jié)構(gòu)的孔中心之間的距離為130?420nm。
[0012](2)對(duì)所得的納米結(jié)構(gòu)進(jìn)行抗體修飾(采用傳統(tǒng)的巰基-馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)硅烷化偶聯(lián)法):將硅納米線(xiàn)陣列或反蛋白石結(jié)構(gòu)光子晶體依次放入體積分?jǐn)?shù)為4%的MPTS溶液(3-巰基丙基三甲氧基硅燒MPTS的乙醇溶液)、ΙμΜ的GMBS溶液(N-(4-馬來(lái)酰亞胺丁酰基氧)琥珀酸亞胺GMBS的二甲基亞砜溶液)、1yg/mL鏈和親霉素的磷酸緩沖鹽溶液(pH = 7.2?7.4)、10yg/mL生物素化的EpCAM抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，Cat.Number: bs_0593R-b1)的磷酸緩沖鹽溶液，反應(yīng)時(shí)間分別為30?60min，從而獲得修飾抗體的納米結(jié)構(gòu)基板；
[0013](3)芯片封裝:將步驟(2)制備的修飾抗體的納米結(jié)構(gòu)基板和載玻片或嵌入光纖的PDMS(聚二甲基硅氧烷)之間用多層封口膜(美國(guó)Parafilm實(shí)驗(yàn)室封口膜)進(jìn)行隔離，使用封口膜形成的芯片高度(即多層封口膜的厚度)為120μπι?Imm;然后用膠水將基板和載玻片或嵌入光纖的PDMS的較長(zhǎng)一側(cè)封裝，待膠水完全固化、芯片結(jié)構(gòu)固定后取出封口膜(從而在基板和載玻片或嵌入光纖的PDMS之間留有空隙)，再用膠帶將進(jìn)樣管和出樣管分別粘貼在基板和載玻片或嵌入光纖的PDMS的較短一側(cè)，并用膠水將整個(gè)芯片進(jìn)行封裝，從而制備得到一種用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲的納米結(jié)構(gòu)微流控芯片。
[0014]進(jìn)一步地，步驟(I)中所述的硅片為P型單面拋光硅片，電阻率為5?10 Ω.cm，晶向[100]，厚度為 360 ?400μπι;
[0015]進(jìn)一步地，步驟(I)中所述的piranha溶液中濃硫酸溶液和雙氧水溶液的體積比為3?7:1，濃硫酸溶液和雙氧水溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為95?98%和20?40%。
[0016]進(jìn)一步地，步驟(I)中所述的刻蝕溶液中，HF水溶液的濃度為4.4?4.6mo I/L，AgNO3水溶液的濃度為0.0I?0.0 2mo I /L，兩者的用量體積比為1:4。
[0017]進(jìn)一步地，步驟(3)中所述的嵌入光纖的PDMS的制備:將聚二甲基硅氧烷PDMS與固化劑以質(zhì)量比5:1的比例混合均勻后倒入方形模具，將I?10根光纖嵌入PDMS中，80?90°C固化I?3h;PDMS的厚度為I?5mm，光纖垂直嵌入TOMS中，光纖頂端位于PDMS厚度一半左右的位置。
[0018]進(jìn)一步地，步驟(3)中所述的單層封口膜的厚度為120?130μπι。
[0019](4)將循環(huán)腫瘤細(xì)胞與連有抗體的納米磁性復(fù)合材料共同孵育。
[0020]將細(xì)胞培養(yǎng)皿中的腫瘤細(xì)胞用胰蛋白酶消化后用細(xì)胞培養(yǎng)基(HyCloneRPMIMedium Modified)重懸，得到細(xì)胞懸浮液。再加入連有抗體的納米磁性復(fù)合材料共同孵育3h，得到結(jié)合了納米磁性復(fù)合材料的循環(huán)腫瘤細(xì)胞懸浮液，細(xì)胞與復(fù)合材料的用量比例:在2?3mL培養(yǎng)基中，2 X 14?3 X 14個(gè)細(xì)胞中加入10yL?200yL的復(fù)合材料。在全血中捕獲細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)需要將循環(huán)腫瘤胞與全血(24h以?xún)?nèi)新鮮的正常人抗凝血)共同混合后，其中全血被稀釋10?20倍后使用，全血與細(xì)胞的混合比例為2?4mL稀釋后的血液中加入2 X 14?2X 12個(gè)細(xì)胞，加入連有抗體的納米磁性復(fù)合材料共同孵育，加入材料的比例為在2?3mL稀釋后的血液與循環(huán)腫瘤細(xì)胞的混合液中加入50yL?10yL的連有抗體的納米磁性復(fù)合材料共同孵育3h，循環(huán)腫瘤細(xì)胞被納米磁性復(fù)合材料特異的連接，其中所涉及的納米磁性復(fù)合材料以及連有抗體的納米磁性復(fù)合材料參考張勇[5，6]課題組及崔大祥課題組[7]的工作制備合成。
[0021]然后以2?12mL/h的流速將結(jié)合了納米磁性復(fù)合材料的循環(huán)腫瘤細(xì)胞懸浮液細(xì)胞或結(jié)合了納米磁性復(fù)合材料稀釋血液與循環(huán)腫瘤細(xì)胞混合液。通過(guò)注射栗及注射器經(jīng)由進(jìn)樣管注入到上側(cè)置有磁鐵的納米結(jié)構(gòu)微流控芯片中，此時(shí)，可以在共聚焦顯微鏡下實(shí)時(shí)觀(guān)測(cè)并記錄循環(huán)腫瘤細(xì)胞的捕獲情況。捕獲實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，為除去芯片中殘留的非特異性捕獲的細(xì)胞，將磷酸緩沖鹽溶液(pH = 7.2?7.4)以2?12mL/h的流速通過(guò)注射栗及注射器經(jīng)由進(jìn)樣管注入到該微流控芯片中進(jìn)行清洗。
[0022]在捕獲實(shí)驗(yàn)中，捕獲率計(jì)算通過(guò)血球計(jì)數(shù)板及流式細(xì)胞儀給出通入芯片內(nèi)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的原始數(shù)目，再將通入芯片后的細(xì)胞懸浮液或血液進(jìn)行收集，再次統(tǒng)計(jì)其中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的數(shù)目，即捕獲率=“(通入芯片前原始循環(huán)腫瘤細(xì)胞的數(shù)目一通入芯片后收集到細(xì)胞的數(shù)目)/原始循環(huán)腫瘤細(xì)胞的數(shù)目X 100%”。捕獲實(shí)驗(yàn)結(jié)束后可以進(jìn)一步在共聚焦顯微鏡上以用635nm(光敏劑為Ce6)或544nm(光敏劑為MC540)激光對(duì)捕獲到的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行原位光動(dòng)力治療:635nm或544nm激光下照射I?5min。對(duì)于嵌入光纖的芯片，捕獲細(xì)胞后可以直接通過(guò)超連續(xù)光源提供645nm、544nm的激光，經(jīng)光纖在芯片內(nèi)實(shí)現(xiàn)被捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞的光動(dòng)力治療:635nm或544nm激光下照射I?5min。其中，光動(dòng)力治療的效果通過(guò)輻照后細(xì)胞染色來(lái)觀(guān)察，用5?1yL染料AO及5?1yL染料EB加入500?100yL磷酸緩沖鹽溶液中并注入芯片中，染色5?1min后在共聚焦顯微鏡下觀(guān)察。染料AO對(duì)染活細(xì)胞，呈現(xiàn)綠色；染料EB只染凋亡細(xì)胞，呈現(xiàn)紅色。
【附圖說(shuō)明】
[0023]圖1:為捕獲循環(huán)細(xì)胞的硅納米線(xiàn)陣列結(jié)合載玻片的微流控芯片的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0024]各部件名稱(chēng)為:放置在芯片上表面的磁鐵I，用于形成外磁場(chǎng);表面修飾抗體的硅納米線(xiàn)陣列12，載玻片基底13，進(jìn)樣管4，出樣管5;
[0025]圖2:為捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞的反蛋白石結(jié)構(gòu)結(jié)合載玻片的微流控芯片的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0026]各部件的名稱(chēng)為:放置在芯片上表面的磁鐵I，用于形成外磁場(chǎng);表面修飾抗體的反蛋白石結(jié)構(gòu)22，載玻片基底23，進(jìn)樣管4，出樣管5。
[0027]圖3:為捕獲及治療循環(huán)腫瘤細(xì)胞的硅納米線(xiàn)陣列結(jié)合嵌入光纖的PDMS的微流控芯片的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0028]各部件名稱(chēng)為:放置在芯片上表面的磁鐵I，用于形成外磁場(chǎng);表面修飾抗體的硅納米線(xiàn)陣列32，嵌入光纖的PDMS基底33，進(jìn)樣管4，出樣管5，光纖6;
[0029]圖4:為實(shí)施例1制備的硅納米線(xiàn)陣列掃描電鏡照片，從圖中可以看到規(guī)則的硅納米線(xiàn)陣列垂直生長(zhǎng)在硅片表面，其中插圖為硅線(xiàn)的截面圖，可以看到硅納米線(xiàn)陣列沿著硅片表面縱向生成，均勻分布。硅納米線(xiàn)的直徑在10nm左右，硅線(xiàn)長(zhǎng)度為5μπι左右，單位面積內(nèi)納米線(xiàn)的密度是34個(gè)Λ?2。
[0030]圖5:為實(shí)施例2制備的反蛋白石結(jié)構(gòu)光子晶體掃描電鏡照片，為規(guī)則的反蛋白石結(jié)構(gòu)，中心為空心狀，而周?chē)暾木S持住球堆積輪廓。反蛋白石結(jié)構(gòu)的孔中心之間的距離為420nm。
[0031]圖6:為實(shí)施例1制備的硅納米線(xiàn)陣列微流控芯片捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞的掃描電鏡照片;可以看到循環(huán)腫瘤細(xì)胞的偽足與硅線(xiàn)納米陣列緊密結(jié)合。
[0032]圖7:為實(shí)施例2制備的反蛋白石結(jié)構(gòu)微流控芯片捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞的共聚焦顯微鏡成像照片;可以看到循環(huán)腫瘤細(xì)胞(圖片中灰色的斑點(diǎn))被大量地捕獲。
[0033]圖8:為實(shí)施例1在芯片內(nèi)對(duì)被捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行原位治療，可以在芯片內(nèi)實(shí)現(xiàn)原位治療。即在共聚焦顯微鏡下用635nm激光以20倍鏡進(jìn)行輻照，輻照l(shuí)min，之后用10μL AO及1yLEB染料加入500yL磷酸緩沖鹽溶液中并注入芯片中，染色5min后以10倍鏡進(jìn)行成像，中間有一個(gè)明顯的區(qū)別圓圈(白色圓圈內(nèi)部區(qū)域)，即為激光輻照產(chǎn)生治療的部分，細(xì)胞發(fā)生凋亡與周?chē)幢徽丈涞募?xì)胞形成對(duì)比。
[0034]圖9:為實(shí)施實(shí)例3通過(guò)嵌入光纖微流控芯片在芯片內(nèi)對(duì)被捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行原位治療。即在由超連續(xù)光源提供635nm激光通過(guò)光纖進(jìn)行輻照，輻照l(shuí)min，之后用1yLAO及1yL EB染料加入500yL磷酸緩沖鹽溶液中并注入芯片中，染色5min后在共聚焦顯微鏡下觀(guān)察，觀(guān)察光纖輻照區(qū)域(a)的細(xì)胞發(fā)生凋亡，染色呈現(xiàn)紅色(由EB染色)；而未經(jīng)過(guò)輻照部分細(xì)胞未發(fā)生凋亡(b)，呈現(xiàn)綠色(由染料AO染色)ο圖片經(jīng)過(guò)灰化處理。
【具體實(shí)施方式】
[0035]下面結(jié)合附圖及實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述:
[0036]實(shí)施例1:基于硅納米線(xiàn)陣列結(jié)構(gòu)的微流控芯片的制備及實(shí)驗(yàn)[0037 ]表面修飾抗體的娃納米線(xiàn)陣列的制備
[0038]清洗:將硅片切為4cmX2cm大小的矩形形狀，硅片為P型單面拋光硅片，晶向[100]，電阻率5?10Ω.cm，厚度380±15μπι，放入燒杯中，依次用去離子水、丙酮、乙醇在超聲清洗儀中分別清洗1min，取出用去離子水沖洗，放入piranha洗液中浸泡24h !piranha洗液由30mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)98 %的濃硫酸和1mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30 %的雙氧水混合而成。
[0039]刻蝕:將清洗后的硅片放入裝有刻蝕溶液的聚四氟乙烯燒杯中，刻蝕溶液為6mL濃度為4.6mol/L的HF溶液和24mL濃度為0.0lmol/L的AgNO3溶液(以上溶液均為水溶液)混合，避光反應(yīng)lh，然后放置于20mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%的硝酸中浸洗lh?？涛g得到規(guī)則的硅納米線(xiàn)陣列，如附圖3所示，娃納米線(xiàn)陣列垂直于娃表面，娃線(xiàn)的直徑在?10nm，長(zhǎng)度?5μηι。
[0040]修飾:硅納米線(xiàn)陣列依次放入體積分?jǐn)?shù)為4%的MPTS溶液(3-巰基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液)、ΙμΜ的GMBS溶液(Ν-(4_馬來(lái)酰亞胺丁?；?琥珀酸亞胺的DMSO溶液)、10μg/mL鏈和親霉素的磷酸緩沖鹽溶液(pH= 7.2?7.4)、10yg/mL生物素化的EpCAM抗體的磷酸緩沖鹽溶液，依次在室溫下反應(yīng)lh，獲得修飾抗體的納米結(jié)構(gòu)的基板。
[0041]芯片封裝:首先將上述制備的基板和載玻片之間用封口膜進(jìn)行隔離，單層的封口膜的厚度為127μπι，使用單層封口膜形成127μπι芯片高度;然后用膠水在基板和載玻片的長(zhǎng)邊兩側(cè)固定結(jié)構(gòu)，待膠水完全固化，取出封口膜，用膠帶將進(jìn)樣管和出樣管分別粘貼在未封裝的短邊兩側(cè)，并用膠水將整個(gè)芯片進(jìn)行封裝，形成如附圖1所示結(jié)構(gòu)的納米結(jié)構(gòu)微流控芯片。
[0042]接下來(lái)進(jìn)行細(xì)胞捕獲實(shí)驗(yàn):將細(xì)胞培養(yǎng)皿中的腫瘤細(xì)胞用胰蛋白酶消化后用細(xì)胞培養(yǎng)基重懸，與納米磁性復(fù)合材料共同孵育3h。其中納米磁性復(fù)合材料參考張勇課題組及崔大祥課題組的工作制備合成:首先合成納米磁性材料Fe304，取1.62g FeCl3.6H20和0.58g FeCl2.4H20混合在1mL去離子水中，并加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28%的氨水調(diào)節(jié)體系pH=9，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌30min，經(jīng)過(guò)磁鐵分離得到納米磁性材料FesO^0.1mL C0_520(非離子表面活性劑)、6mL環(huán)己燒、4mL 2mg/mL的Fe304的環(huán)己燒溶液，攪拌1miη，加入0.4mL C0-520、0.08mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30 %的氨水，超聲30min，之后加入0.04mL正娃酸乙酯，充分混合攪拌24h，加入丙酮得到二氧化硅包覆的Fe304。取1mg 二氧化硅包覆的Fe3O4分散在乙醇和去離子水的混合液體中(乙醇15mL，去離子水3mL)，加入300yL氨水，30yL 2-[甲氧基(聚氧乙烯)丙基]-三甲氧基硅烷，攪拌24h，通過(guò)磁鐵吸引，除去上層清液，進(jìn)一步分散到6mL二甲基亞砜中，5yL APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)以及l(fā).lmg NHS(N_羥基丁二酰亞胺)和1.6mgH)S(碳化二亞胺)，混合攪拌12h，經(jīng)過(guò)磁鐵分離后用二甲基亞砜和乙醇清洗三次。進(jìn)一步取5mg經(jīng)過(guò)修飾的Fe304與Img Ce6在ImL二甲基亞砜中混合，在室溫下混合超聲30min，并攪拌12h，得到納米磁性復(fù)合材料。
[0043]將細(xì)胞培養(yǎng)皿中MCF-7細(xì)胞(乳腺癌細(xì)胞)加入ImL胰蛋白酶進(jìn)行消化，再用磷酸緩沖鹽溶液(pH = 7.2?7.4)稀釋成I X 104cell/mL的細(xì)胞懸浮液，加入納米磁性復(fù)合材料共同孵育3h，材料的用量為10yL納米磁性復(fù)合材料加入到2mL細(xì)胞懸液中，細(xì)胞懸液濃度為IX 104。取ImL加入到注射器中，將注射器與芯片的進(jìn)樣口相連，在芯片上表面放置磁鐵，通過(guò)注射栗，以4mL/h注入到芯片中，另一端出樣管端進(jìn)行收集。此時(shí)，可以在共聚焦顯微鏡下實(shí)時(shí)觀(guān)測(cè)并記錄細(xì)胞捕獲情況。
[0044]將捕獲細(xì)胞的芯片進(jìn)行處理:
[0045]固定:取出硅片放入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加入2mL的I3BS緩沖液，置于水平搖床上，60rpm洗1min，重復(fù)兩次。之后用移液槍將I3BS緩沖液吸出，加入2mL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5 %戊二醛固定液，60rpm室溫固定2h。
[0046]脫水:固定結(jié)束后，用2mLPBS緩沖液洗去剩余的固定液，吸凈細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)液體。然后按以下順序進(jìn)行脫水步驟:質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%乙醇，60rpm，1min，重復(fù)兩次;質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%乙醇，60rpm，1min，重復(fù)兩次;質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%乙醇，60rpm，1min，重復(fù)兩次；質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%乙醇;60rpm, 1min，重復(fù)兩次;質(zhì)量分?jǐn)?shù)95%乙醇，60rpm, 1min，重復(fù)兩次;質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%乙醇，60rpm，1min，重復(fù)兩次。
[0047]干燥:照射掃描電鏡之前，用移液槍吸凈平皿內(nèi)質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%乙醇，室溫干燥2h。進(jìn)行掃描電鏡測(cè)試，可以得到附圖5，結(jié)合附圖5，被捕獲的細(xì)胞被固定后照射掃面電鏡，可以看到細(xì)胞緊密的結(jié)合在硅納米線(xiàn)上。
[0048]在微流控芯片中被捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，可以在芯片內(nèi)實(shí)現(xiàn)原位治療將細(xì)胞。即在共聚焦顯微鏡下用635nm激光以20倍鏡進(jìn)行輻照，輻照l(shuí)min，之后用1yLAO及1yL EB染料加入500yL磷酸緩沖鹽溶液中并注入芯片中，染色5min，可以明顯看到光動(dòng)力治療效果。以10倍鏡進(jìn)行成像，如附圖7所示看到中間有一個(gè)明顯的區(qū)別圓圈(白色圓圈內(nèi)部區(qū)域)，即為激光輻照產(chǎn)生治療的部分，細(xì)胞發(fā)生凋亡與周?chē)幢徽丈涞募?xì)胞形成對(duì)比。
[0049]實(shí)施例2:基于T12反蛋白石結(jié)構(gòu)的微流控芯片的制備及實(shí)驗(yàn)方法
[0050]反蛋白石結(jié)構(gòu)光子晶體的制備:首先合成PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)納米球溶液，PMMA納米球的尺寸為340nm;取30mL MMA(甲基丙烯酸甲酯)與200mL氫氧化鈉溶液(濃度為0.037mol/L)，清洗3?4遍;將2?5mL清洗過(guò)的MMA和40mL的去離子水混合后加熱，在90°C條件下加入18mg的K2S2O8反應(yīng)90min，得到單分散的PMMA納米球溶液。
[0051]用清水洗或用酒精洗，然后再用擦鏡紙將載玻片擦干凈，垂直插入單分散的PMMA納米球液體中，置于烘箱中320C烘干24h，再進(jìn)一步120°C烘干40min，得到PMMA蛋白石結(jié)構(gòu)，將制備好T12前驅(qū)體溶液(鈦酸丁酯1mL、無(wú)水乙醇1mL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)66 %的硝酸ImL混合后配制而成)，滴到PMMA蛋白石模板上，對(duì)樣品進(jìn)行熱處理500°C處理3h，得到980nm光子帶隙的反蛋白石結(jié)構(gòu)的光子晶體，反蛋白石結(jié)構(gòu)的孔中心之間的距離為420nm，如附圖4所示。
[0052]修飾:硅納米線(xiàn)陣列依次放入體積分?jǐn)?shù)為4%的MPTS溶液(3-巰基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液)、ΙμΜ的GMBS溶液(N-(4_馬來(lái)酰亞胺丁?；?琥珀酸亞胺的DMSO溶液)、10μg/mL鏈和親霉素的磷酸緩沖鹽(ρΗ=7.2?7.4)溶液、10yg/mL生物素化的EpCAM抗體的磷酸緩沖鹽溶液的溶液，依次在室溫下反應(yīng)lh，獲得修飾抗體的納米結(jié)構(gòu)的基板。
[0053]芯片封裝:首先將上述制備的基板和載玻片之間用封口膜進(jìn)行隔離，單層的封口膜的厚度為127μπι，使用單層封口膜形成127μπι芯片高度;然后用膠水在基板和載玻片的長(zhǎng)邊兩側(cè)固定結(jié)構(gòu)，待膠水完全固化，取出封口膜，用膠帶將進(jìn)樣管和出樣管分別粘貼在未封裝的短邊兩側(cè)，并用膠水將整個(gè)芯片進(jìn)行封裝，形成如附圖2所示結(jié)構(gòu)的納米結(jié)構(gòu)微流控芯片。
[0054]接下來(lái)進(jìn)行細(xì)胞捕獲實(shí)驗(yàn):將細(xì)胞培養(yǎng)皿中的腫瘤細(xì)胞用胰蛋白酶消化后用細(xì)胞培養(yǎng)基重懸，與納米磁性復(fù)合材料共同孵育3h。其中納米磁性復(fù)合材料參考張勇課題組及崔大祥課題組的工作制備合成:首先合成納米磁性材料Fe304，取1.62g FeCl3.6H20和
0.58g FeCl2.4H20混合在1mL去離子水中，并加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28%的氨水調(diào)節(jié)體系pH=9，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌30min，經(jīng)過(guò)磁鐵分離得到納米磁性材料FesO^0.1mL C0_520(非離子表面活性劑)、6mL環(huán)己燒、4mL 2mg/mL的Fe304的環(huán)己燒溶液，攪拌1miη，加入0.4mL C0-520、0.08mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30 %的氨水，超聲30min，之后加入0.04mL正娃酸乙酯，充分混合攪拌24h，加入丙酮得到二氧化硅包覆的Fe304。取1mg 二氧化硅包覆的Fe3O4分散在乙醇和去離子水的混合液體中(乙醇15mL，去離子水3mL)，加入300yL氨水，30yL 2-[甲氧基(聚氧乙烯)丙基]-三甲氧基硅烷，攪拌24h，通過(guò)磁鐵吸引，除去上層清液，進(jìn)一步分散到6mL二甲基亞砜中，5yL APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)以及l(fā).lmg NHS(N_羥基丁二酰亞胺)和1.6mgH)S(碳化二亞胺)，混合攪拌12h，經(jīng)過(guò)磁鐵分離后用二甲基亞砜和乙醇清洗三次。進(jìn)一步取5mg經(jīng)過(guò)修飾的Fe304與Img Ce6在ImL二甲基亞砜中混合，在室溫下混合超聲30min，并攪拌12h，得到納米磁性復(fù)合材料。
[0055]將細(xì)胞培養(yǎng)皿中MCF-7細(xì)胞(乳腺癌細(xì)胞)加入ImL胰蛋白酶進(jìn)行消化，再用磷酸緩沖鹽溶液稀釋成I X 14CelΙ/mL的細(xì)胞懸浮液，加入納米磁性復(fù)合材料共同孵育3h，材料的用量為10yL納米磁性復(fù)合材料加入到2mL細(xì)胞懸液中，細(xì)胞懸液濃度為I X 104。取ImL加入到注射器中，將注射器與芯片的進(jìn)樣口相連，在芯片上表面放置磁鐵，通過(guò)注射栗，以4mL/h注入到芯片中，另一端出樣管端進(jìn)行收集。此時(shí)，可以在共聚焦顯微鏡下實(shí)時(shí)觀(guān)測(cè)并記錄細(xì)胞捕獲情況。實(shí)時(shí)拍攝的捕獲照片如附圖6所示。結(jié)合附圖6可以看到有這種反蛋白石的結(jié)構(gòu)具有捕獲細(xì)胞的能力。
[0056]實(shí)施例3:基于硅納米線(xiàn)陣列結(jié)構(gòu)結(jié)合嵌入光纖的微流控芯片的制備及實(shí)驗(yàn)
[0057]清洗:將硅片切為4cmX 2cm大小的矩形形狀，硅片為P型單面拋光硅片，晶向[100]，電阻率5?10Ω.Cm，厚度380±15μπι，放入燒杯中，依次用去離子水、丙酮、乙醇在超聲清洗儀中分別清洗1min，取出用去離子水沖洗，放入piranha洗液中浸泡24h !piranha洗液由30mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)98 %的濃硫酸和1mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30 %的雙氧水混合而成。
[0058]刻蝕:將清洗后的硅片放入裝有刻蝕溶液的聚四氟乙烯燒杯中，刻蝕溶液為6mL、濃度為4.6mol/L的HF溶液和24mL、濃度為0.0lmol/L的AgNO3溶液(以上溶液均為水溶液)混合，避光反應(yīng)lh，然后放置于20mL體積分?jǐn)?shù)15%的硝酸中浸洗lh?？涛g得到規(guī)則的硅納米線(xiàn)陣列，如附圖3所示，硅納米線(xiàn)陣列垂直于硅表面，硅線(xiàn)的直徑在?lOOnm，長(zhǎng)度?5μπι。
[0059]修飾:硅納米線(xiàn)陣列依次放入體積分?jǐn)?shù)為4%的MPTS溶液(3-巰基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液)、ΙμΜ的GMBS溶液(Ν-(4_馬來(lái)酰亞胺丁酰基氧)琥珀酸亞胺的DMSO溶液)、10μg/mL鏈和親霉素的磷酸緩沖鹽溶液(pH= 7.2?7.4)、10yg/mL生物素化的EpCAM抗體的磷酸緩沖鹽溶液，依次在室溫下反應(yīng)lh，獲得修飾抗體的納米結(jié)構(gòu)的基板。
[0060]嵌入光纖的PDMS的制備:將聚二甲基硅氧烷與固化劑以質(zhì)量比5:1混合均勻后倒入方形模具，將4根光纖垂直嵌入PDMS，80 °C固化Ih IDMS的厚度2mm，光纖嵌入一半的厚度。[0061 ]芯片封裝:首先將上述制備的基板和嵌入光纖PDMS用封口膜進(jìn)行隔離，單層的封口膜的厚度為127μπι，使用單層封口膜形成127μπι芯片高度;然后用膠水在基板和載玻片的長(zhǎng)邊兩側(cè)固定結(jié)構(gòu)，待膠水完全固化，取出封口膜，用膠帶將進(jìn)樣管和出樣管分別粘貼在未封裝的短邊兩側(cè)，并用膠水將整個(gè)芯片進(jìn)行封裝，形成如附圖1所示結(jié)構(gòu)的納米結(jié)構(gòu)微流控芯片。
[0062]接下來(lái)進(jìn)行細(xì)胞捕獲實(shí)驗(yàn):將細(xì)胞培養(yǎng)皿中的腫瘤細(xì)胞用胰蛋白酶消化后用細(xì)胞培養(yǎng)基重懸，與納米磁性復(fù)合材料共同孵育3h。其中納米磁性復(fù)合材料參考張勇課題組及崔大祥課題組的工作制備合成:首先合成納米磁性材料Fe304，取1.62g FeCl3.6H20和
0.58g FeCl2.4H20混合在1mL去離子水中，并加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28%的氨水調(diào)節(jié)體系pH=9，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌30min，經(jīng)過(guò)磁鐵分離得到納米磁性材料FesO^0.1mL C0_520(非離子表面活性劑)、6mL環(huán)己燒、4mL 2mg/mL的Fe304的環(huán)己燒溶液，攪拌1miη，加入0.4mL C0-520、0.08mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30 %的氨水，超聲30min，之后加入0.04mL正娃酸乙酯，充分混合攪拌24h，加入丙酮得到二氧化硅包覆的Fe304。取1mg 二氧化硅包覆的Fe3O4分散在乙醇和去離子水的混合液體中(乙醇15mL，去離子水3mL)，加入300yL氨水，30yL 2-[甲氧基(聚氧乙烯)丙基]-三甲氧基硅烷，攪拌24h，通過(guò)磁鐵吸引，除去上層清液，進(jìn)一步分散到6mL二甲基亞砜中，5yL APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)以及l(fā).lmg NHS(N_羥基丁二酰亞胺)和1.6mgH)S(碳化二亞胺)，混合攪拌12h，經(jīng)過(guò)磁鐵分離后用二甲基亞砜和乙醇清洗三次。進(jìn)一步取5mg經(jīng)過(guò)修飾的Fe304與Img Ce6在ImL二甲基亞砜中混合，在室溫下混合超聲30min，并攪拌12h，得到納米磁性復(fù)合材料。
[0063]將細(xì)胞培養(yǎng)皿中MCF-7細(xì)胞(乳腺癌細(xì)胞)加入ImL胰蛋白酶進(jìn)行消化，再用磷酸緩沖鹽溶液(pH = 7.2?7.4)稀釋成I X 104cell/mL的細(xì)胞懸浮液，加入納米磁性復(fù)合材料共同孵育3h，材料的用量為10yL納米磁性復(fù)合材料加入到2mL細(xì)胞懸液中，細(xì)胞懸液濃度為IX 104。取ImL加入到注射器中，將注射器與芯片的進(jìn)樣口相連，在芯片上表面放置磁鐵，通過(guò)注射栗，以4mL/h注入到芯片中，另一端出樣管端進(jìn)行收集。此時(shí)，可以在共聚焦顯微鏡下實(shí)時(shí)觀(guān)測(cè)并記錄細(xì)胞捕獲情況。
[0064]嵌入光纖微流控芯片在芯片內(nèi)對(duì)被捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行原位治療。即由超連續(xù)光源提供635nm激光，通過(guò)光纖對(duì)芯片內(nèi)被捕獲樣品進(jìn)行輻照，輻照l(shuí)min，之后用1yL AO及1yL EB染料加入500yL磷酸緩沖鹽溶液中并注入芯片中，染色5min后在共聚焦顯微鏡下觀(guān)察，觀(guān)察光纖輻照區(qū)域的細(xì)胞發(fā)生凋亡附圖9(a)，染色呈現(xiàn)紅色(由EB染色)；而未經(jīng)過(guò)輻照部分細(xì)胞未發(fā)生凋亡附圖9(b)，呈現(xiàn)綠色(由染料AO染色)。圖片經(jīng)過(guò)灰化處理。
[0065]本文引用的所有文獻(xiàn)通過(guò)整體引用并入本文。為方便起見(jiàn)，以下列出本文引用的參考文獻(xiàn):
[0066]1.ffeiyi Qian,Yan Zhang,et al.Capturing Cancer:Emerging MicrofluidicTechnologies for the Capture and Characterizat1n of Circulating TumorCells.Small 32，3850-3872(2015).
[0067]2.Hadi Esmaeilsabzali，Timothy V.Beischlag,et al.Detect1n andisolat1n of circulating tumor celIs: Principles and methods.B1technologyAdvances 31，1063-1084(2013).
[0068]3.Sunitha NagrathjLecia V，et al.1solat1n of rare circulating tumourcells in cancer patients by microchip technology.Nature 450，1235-1239(2007).
[0069]4.Shutao Wang ,Hao Wang ,et a1.Three-Dimens1nal nanostructuredsubstrates toward efficient capture of circulating tumor cells.Angew.Chem 48，8970-8973(2009).
[0070]5.Niagara Muhammad Idris,Muthu Kumara Gnanasammandhan，et al.1n vivophotodynamic therapy using upconvers1n nanoparticles as remote-controllednanotransducers.Nature medicine 18，1580-1585(2012).
[0071]6.Zheng quan Li,Yong Zhang,et al.Multicolor core/she11-structuredupconvers1n fluorescent nanoparticIes.Adv.Mater 20,4765-4769(2008).
[0072]7.Peng HuangjZhi ming Li ,et al.Photosensitizer-conjugated magneticnanoparticles for in vivo simultaneous magnet fluorescent imaging andtargeting therapy.B1materials 32,3447-3458(2011).
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲的納米結(jié)構(gòu)微流控芯片的制備方法，其步驟如下: (1)納米結(jié)構(gòu)的制備 硅納米線(xiàn)陣列的制備:將硅片超聲清洗10?30min，再用去離子水沖洗后放入濃硫酸和過(guò)氧化氫組成的P iranha溶液中浸泡2?12h，取出的娃片用去離子水沖洗后，放入硝酸銀和氫氟酸組成的刻蝕溶液中避光反應(yīng)I?3 h;然后再將刻蝕后的硅片放入體積分?jǐn)?shù)為15?30%的硝酸水溶液中浸洗I?2h，從而在硅片表面得到垂直于硅片表面生長(zhǎng)的硅納米線(xiàn)陣列，娃納米線(xiàn)的直徑為50?10nm，長(zhǎng)度5?50μηι，單位面積內(nèi)納米線(xiàn)的密度是30?40個(gè)/μm2； 反蛋白石結(jié)構(gòu)光子晶體的制備:將20?30ml MMA用100?200ml、濃度為0.03?0.04mol/L的氫氧化鈉水溶液清洗3?4遍，將2?5ml清洗過(guò)的MMA和30?50ml去離子水混合后加熱，在80?90 °C條件下加入10?20mg的K2S2O8反應(yīng)60?lOOmin，得到單分散的PMMA納米球溶液，PMMA納米球的尺寸為200?600nm;將干凈的載玻片垂直插入單分散的PMMA納米球液體中，在30?40°C條件下保持20?24h，烘干，再在100?120°C條件下烘40?60min，從而在載玻片表面上得到PMMA蛋白石結(jié)構(gòu)；該蛋白石結(jié)構(gòu)為緊密排列的球陣列，厚度為130?900nm，球心間距為200?600nm;將S12或T12前驅(qū)體溶液逐滴滴到PMMA蛋白石結(jié)構(gòu)表面，然后在450?550 °C進(jìn)行熱處理2?4h，在載玻片表面得到380?980nm光子帶隙的反蛋白石結(jié)構(gòu)光子晶體，為規(guī)則的反蛋白石結(jié)構(gòu)，反蛋白石結(jié)構(gòu)為原PMMA球緊密堆積的蛋白石結(jié)構(gòu)在滲入T12或S12前驅(qū)體溶液后，經(jīng)熱處理后PMMA納米球被去除，剩下圍繞球堆積輪廓的T12或S12的結(jié)構(gòu)，反蛋白石結(jié)構(gòu)的孔中心之間的距離為130?420nm; (2)對(duì)所得的納米結(jié)構(gòu)進(jìn)行抗體修飾:將硅納米線(xiàn)陣列或反蛋白石結(jié)構(gòu)光子晶體依次放入體積分?jǐn)?shù)為4%的MPTS溶液、ΙμΜ的GMBS溶液、10yg/mL鏈和親霉素的磷酸緩沖鹽溶液、10yg/mL生物素化的EpCAM抗體的磷酸緩沖鹽溶液，反應(yīng)時(shí)間分別為30?60min，從而獲得修飾抗體的納米結(jié)構(gòu)基板； (3)芯片封裝:將步驟(2)制備的修飾抗體的納米結(jié)構(gòu)基板和載玻片或嵌入光纖的PDMS之間用多層封口膜進(jìn)行隔離，使用封口膜形成的芯片高度為120μπι?Imm;然后用膠水將基板和載玻片或嵌入光纖的PDMS的較長(zhǎng)邊一側(cè)封裝，待膠水完全固化、芯片結(jié)構(gòu)固定后取出封口膜，再用膠帶將進(jìn)樣管和出樣管分別粘貼在基板和載玻片或嵌入光纖的PDMS的較短邊一側(cè)，并用膠水將整個(gè)芯片進(jìn)行封裝，從而制備得到用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲的納米結(jié)構(gòu)微流控芯片。2.如權(quán)利要求一種用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲的納米結(jié)構(gòu)微流控芯片的制備方法，其特征在于:步驟(I)中所述的硅片為P型單面拋光硅片，電阻率為5?10 Ω.cm，晶向[100]，厚度為360 ?400μπι。3.如權(quán)利要求一種用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲的納米結(jié)構(gòu)微流控芯片的制備方法，其特征在于:步驟(I)中所述的piranha溶液中濃硫酸溶液和雙氧水溶液的體積比為3?7: I，濃硫酸溶液和雙氧水溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為95?98%和20?40%。4.如權(quán)利要求一種用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲的納米結(jié)構(gòu)微流控芯片的制備方法，其特征在于:步驟(I)中所述的刻蝕溶液中，HF水溶液的濃度為4.4?4.6mol/L，AgN03水溶液的濃度為0.01?0.0211101/1，兩者的用量體積比為1:4。5.如權(quán)利要求一種用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲的納米結(jié)構(gòu)微流控芯片的制備方法，其特征在于:步驟(I)中T12前驅(qū)體溶液是由化學(xué)純鈦酸丁酯8?12mL、無(wú)水乙醇8?12mL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)65%?68%硝酸水溶液0.5?2mL混合后配制而成;S12前驅(qū)體溶液由質(zhì)量分?jǐn)?shù)25?30%的硅酸乙酯3?4mL、無(wú)水乙醇8?12mL和質(zhì)量分?jǐn)?shù)30?40%的鹽酸水溶液0.01?0.05mL混合后配制而成。6.如權(quán)利要求一種用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲的納米結(jié)構(gòu)微流控芯片的制備方法，其特征在于:步驟(3)中所述的嵌入光纖的TOMS的制備是將聚二甲基硅氧烷PDMS與固化劑以質(zhì)量比5:1的比例混合均勻后倒入方形模具，將I?10根光纖嵌入TOMS中，80?90°C固化I?3h ；PDMS的厚度為I?5mm，光纖垂直嵌入PDMS中，光纖頂端位于PDMS厚度一半左右的位置。7.如權(quán)利要求一種用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲的納米結(jié)構(gòu)微流控芯片的制備方法，其特征在于:步驟(3)中所述的單層封口膜的厚度為120?130μπι。8.—種用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲的納米結(jié)構(gòu)微流控芯片，其特征在于:是由權(quán)利要求1?7任何一項(xiàng)方法制備得到。
【文檔編號(hào)】C12M1/42GK105950436SQ201610247371
【公開(kāi)日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年4月20日
【發(fā)明人】董彪, 許紅威, 徐詩(shī)函, 宋宏偉, 白雪, 徐琳, 孫雪珂
【申請(qǐng)人】吉林大學(xué)