一種檢測(cè)雞住白細(xì)胞原蟲的方法和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及雞住白細(xì)胞原蟲的檢測(cè)。
【背景技術(shù)】
[0002] 住白細(xì)胞原蟲屬于原生動(dòng)物門、復(fù)頂亞門、孢子蟲綱、血孢子蟲亞目、瘧原蟲科、住 白細(xì)胞蟲屬。雞住白細(xì)胞蟲病是由住白細(xì)胞蟲屬的多種住白細(xì)胞蟲寄生于雞的白細(xì)胞和紅 細(xì)胞引起的一種急性血孢子原蟲病。病雞因紅細(xì)胞被破壞及廣泛性出血，雞冠呈蒼白色，故 又名白冠病。近年來該病在我國(guó)許多地區(qū)暴發(fā)流行，對(duì)養(yǎng)雞業(yè)的危害日趨嚴(yán)重。
[0003] 對(duì)于該疾病的檢測(cè)，一般是利用PCR方法檢測(cè)雞住白細(xì)胞原蟲，這通常需要先提 取待檢雞樣品的DNA，因?yàn)闃悠分械囊恍┮种苿?huì)對(duì)PCR反應(yīng)的聚合酶產(chǎn)生抑制作用。然而 對(duì)于大規(guī)模雞養(yǎng)殖業(yè)而言，提取樣品中的DNA耗費(fèi)時(shí)間過長(zhǎng)，成本太高，非常不適用。本領(lǐng) 域中急需要一種能夠快速且低成本的檢測(cè)雞住白細(xì)胞原蟲的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)雞住白細(xì)胞原蟲的方法以及相應(yīng)的試劑盒，能夠 免提取DNA，從而解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題。
[0005] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：
[0006] -種檢測(cè)雞住白細(xì)胞原蟲的方法，包括以待檢雞樣品為模板，以PCR的方法檢測(cè) 雞住白細(xì)胞原蟲是否存在，PCR的反應(yīng)試劑包括上游引物、下游引物、TaqMan熒光探針、Taq 酶、Taq酶稀釋液，其中，所述方法不包括從待檢雞樣品中提取DNA的過程。
[0007] 優(yōu)選地，所述Taq酶稀釋液包含高聚復(fù)合物M，所述高聚復(fù)合物Μ是通過將雙（環(huán) 戊二烯）鎂（分子式：C1QH1QMg)和曲拉通X-114(TritonX-114)，按質(zhì)量比140~160 : 1， 在200~210°C、300~350kpa、l~3小時(shí)條件下進(jìn)行加成反應(yīng)而形成的，為白色粉末，完 全溶于水。
[0008] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述雙（環(huán)戊二烯）鎂和曲拉通X-114的質(zhì)量比是154 : 1，所述 反應(yīng)條件為207°C、314kpa、2小時(shí)。
[0009] 優(yōu)選地，所述Taq酶稀釋液中，高聚復(fù)合物Μ的含量為0.1 %~0.6%W/V。
[0010] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述Taq酶稀釋液的成分為：20mMTris-HCl，0.ImMEDTA，100mM KCl，lmMDTT，0.5% (V/V)NP-40(乙基苯基聚乙二醇），0·5% (V/V)吐溫-20,50% (V/V) 甘油，0. 1% (W/V)高聚復(fù)合物Μ。
[0011] 優(yōu)選地，所述Taq酶稀釋液將Taq酶稀釋至1U/μL，再將稀釋的Taq酶按比例加入 PCR反應(yīng)體系中。
[0012] 優(yōu)選地，所述方法通過檢測(cè)雞住白細(xì)胞原蟲的cytb基因檢測(cè)雞住白細(xì)胞原蟲是 否存在。
[0013] 優(yōu)選地，所述上游引物為：LB-F:5 ' -CCACCACATACCCATGAGATTAGTC-3'（SEQID NO. 1)，所述下游引物為：LB-R:5'-AACTGCCTTCTTAGGTTATGTATTACCAT-3'（SEQIDNO. 2)，所 述TaqMan熒光探針為：LB-P :5' -Fam-TTACAGTTGCACCCCAGAAACTCATTTGG-3' BHQ1 (SEQ ID NO. 3)〇
[0014] 優(yōu)選地，所述待檢雞樣品為雞任何部位，優(yōu)選為全血。
[0015] 優(yōu)選地，所述方法包括步驟：以待檢雞樣品的全血為模板，加入針對(duì)cytb基因的 上游引物、下游引物和熒光探針以及用Taq酶稀釋液處理的Taq酶、PCR緩沖液、dNTP混合 物等PCR反應(yīng)試劑，通過變性、退火、延伸等PCR程序擴(kuò)增cytb基因上的目標(biāo)片段，從而判 斷雞住白細(xì)胞原蟲是否存在。
[0016] 一種檢測(cè)雞住白細(xì)胞原蟲的試劑盒，包括上游引物、下游引物、TaqMan熒光探針、 Taq酶、Taq酶稀釋液、PCR緩沖液、dNTP混合物。
[0017] 優(yōu)選地，所述上游引物為：LB-F :5'-CCACCACATACCCATGAGATTAGTC-3'（SEQ ID NO.1)，所述下游引物為：LB-R :5'-AACTGCCTTCTTAGGTTATGTATTACCAT-3'（SEQ IDNO.2)，所 述TaqMan熒光探針為：LB-P :5' -Fam-TTACAGTTGCACCCCAGAAACTCATTTGG-3' BHQ1 (SEQ ID NO.3)〇
[0018] 優(yōu)選地，所述Taq酶稀釋液包含高聚復(fù)合物M，所述高聚復(fù)合物M是通過將雙（環(huán) 戊二烯）鎂（分子式：C1QH1QMg)和曲拉通X-114,按質(zhì)量比140~160 : 1，在200~210°C、 300~350kpa、l~3小時(shí)條件下進(jìn)行加成反應(yīng)而形成。
[0019] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述雙（環(huán)戊二烯）鎂和曲拉通X-114的質(zhì)量比是154 : 1，所述 反應(yīng)條件為207°C、314kpa、2小時(shí)。
[0020] 優(yōu)選地，所述Taq酶稀釋液中，高聚復(fù)合物Μ的含量為0· 1 %~0· 6%W/V。
[0021] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述Taq酶稀釋液的成分為：20mM Tris-HCl，0.1 mM EDTA，100mM KCl，lmM DTT，0.5% (V/V)NP-40(乙基苯基聚乙二醇），0·5% (V/V)吐溫-20,50% (V/V) 甘油，0. 1% (W/V)高聚復(fù)合物Μ。
[0022] 本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，TaqMan熒光探針是一種寡核苷酸探針，熒光基團(tuán)連接在探 針的5'末端，而淬滅劑則連接在3'末端。PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異 性的熒光探針，探針完整時(shí)，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶 的Y-3'外切酶活性將探針酶切降解，使熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè) 系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的 累積與PCR產(chǎn)物的形成完全同步。
[0023] 本發(fā)明中的高聚復(fù)合物Μ可以保護(hù)結(jié)合的Taq酶耐受更高的溫度；借由更高的變 性溫度，一方面，可以使復(fù)雜的模板更容易地變性，使Taq酶可以更容易結(jié)合這些復(fù)雜的模 板；另一方面，此高聚復(fù)合物Μ會(huì)阻擋一些抑制劑（如金屬離子），從而使得反應(yīng)體系可以 擴(kuò)增全血等待檢測(cè)雞樣品，不需要提取DNA。
[0024] 本發(fā)明引入了特異性擴(kuò)增引物和熒光探針，用以保證反應(yīng)的特異性。并加入了高 聚復(fù)合物Μ，使得PCR體系可以進(jìn)行血液直擴(kuò)，無需提取DNA，降低了樣品處理的復(fù)雜度，能 夠?qū)﹄u住白細(xì)胞原蟲進(jìn)行快速檢測(cè)，應(yīng)用極為方便，適合在家禽養(yǎng)殖企業(yè)、檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)等 進(jìn)行推廣應(yīng)用，具有廣泛的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0025]圖1為使用本發(fā)明的試劑盒對(duì)雞住白細(xì)胞原蟲檢測(cè)的敏感性實(shí)驗(yàn)，從左到右依次 為1X106、1X105、1X104、1X103、1X102拷貝/μ1的標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增結(jié)果。
[0026]圖2為使用本發(fā)明的試劑盒對(duì)雞減蛋綜合征病毒（EDSV)、禽白血病病毒（ALV)、雞 傳染性貧血病病毒（CIAV)樣本檢測(cè)的特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0027]圖3為使用未添加高聚復(fù)合物Μ的PCR體系檢測(cè)雞住白細(xì)胞原蟲、雞減蛋綜合征 病毒（EDSV)、禽白血病病毒（ALV)、雞傳染性貧血病病毒（CIAV)樣本的對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0028] 圖4為雙（環(huán)戊二烯）鎂單體的分子式。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本
【發(fā)明內(nèi)容】
。
[0030] 實(shí)施例一：特異性引物及探針的設(shè)計(jì)
[0031] 根據(jù)從Genbank上檢索到的住白細(xì)胞蟲屬的核酸序列（gi| 296011935、 gi|296011933、gi|568261041、gi|568261039、gi|568261037、gi|296011937、 gi|296011925、gi|296011923、gi|296011921、gi|296011929、gi|296011931、 giI296011927)，設(shè)計(jì)用于檢測(cè)雞住白細(xì)胞原蟲cytb基因的引物和探針，并逐一進(jìn)行實(shí)驗(yàn) 驗(yàn)證，最終確定如下引物和探針：
[0032]上游引物：LB-F:5' -CCACCACATACCCATGAGATTAGTC-3'（SEQIDNO. 1)，
[0033]下游引物：LB-R:5' -AACTGCCTTCTTAGGTTATGTATTACCAT-3'（SEQIDNO. 2)，
[0034]熒光探針：LB-P:5' -Fam-TTACAGTTGCACCCCAGAAACTCATTTGG-3'BHQ1(SEQID NO. 3),
[0035] 所述引物擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為114bp，序列如下：
[0036]CCACCACATACCCATGAGATTAGTCCAGGAATAAAATATAGTAAATTAGTAATTACAGTTGCACCCCAG AAACTCATTTGGCCCCATGGTAATACATAACCTAAGAAGGCAGTT(SEQIDNO. 4)〇
[0037] 實(shí)施例二：標(biāo)準(zhǔn)品的制備
[0038] 采集來自河北秦皇島市的病雞肺組織，用Roche公司的HighPurePCRTemplate PreparationKit提取DNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，步驟如下：
[0039] 1)PCR體系：