他莫西芬抗腫瘤藥物敏感度檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及的是一種分子生物技術領域的藥物敏感度檢測方法，包括引物、探針 及其試劑盒，具體是一種用于他莫西芬抗腫瘤藥物敏感度檢測的方法，針對他莫西芬藥物 使用者基因內(nèi)3個生物標記的引物、探針及其試劑盒。
【背景技術】
[0002] 化療在目前是惡性腫瘤治療的重要手段，臨床化療的效果對于腫瘤患者的治療和 提高生存期有著至關重要的影響。對于不同的患者，不同的化療藥物的效果差異很大。腫 瘤患者對化療的反應不同，很多時候是由于對化療藥物敏感性存在差異。由于臨床醫(yī)生往 往只能憑經(jīng)驗對不同患者使用某種化療藥物或化療方案，帶有一定的盲目性，因此很多腫 瘤患者的化療效果并不理想，往往達不到化療的預期目的。所以，一個能夠在化療前篩選出 針對性強、患者敏感度較高化療藥物的檢測方法，對于提高個體化治療效果，提高化療的成 功率，有著重要的意義。
[0003] 近年來國內(nèi)外腫瘤和化療藥物研究領域相繼創(chuàng)建了一系列體內(nèi)或體外預測腫瘤 化療藥物敏感性的方法。常用的有裸鼠皮下移植藥敏測定法、人體腫瘤細胞集落測定法、 放射性標記代謝物前體摻入法、MTT比色、三磷酸腺苷法和快速熒光分析等等。這些方法均 存在一些缺點，要么費用昂貴且檢測周期長，不適合常規(guī)使用；要么需要在體外培養(yǎng)原發(fā)腫 瘤，檢測成功率低。這些缺陷把腫瘤化療藥敏實驗限制在了研究性的實驗室里，很少有大規(guī) 模使用的報道。
[0004] 藥物基因組學（pharmacogenomics)研究的進展為從分子水平研制和開發(fā)新一代 的，針對藥物敏感性進行檢測的方法提供了理論基礎和大量的實驗數(shù)據(jù)。實驗證明，個體基 因水平上的差異，包括基因多態(tài)性、基因突變和表達差異等，與腫瘤患者對藥物的敏感性密 切相關。通過檢測患者在這些基因上與藥物敏感性相關的生物標記，可以預測患者對腫瘤 化療藥物的敏感性，幫助進一步指導選擇合理的化療方案。我們通過設計試劑盒，檢測人類 基因上的多個SNP生物標記，可以方便、快速的預測他莫西芬藥物對患者個體的療效。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是利用SNP標記檢測方便快捷，準確率高的優(yōu)點，采用Seqnome檢測 技術，提供一種用于他莫西芬抗腫瘤藥物敏感度檢測的方法，包括PRC引物、延伸引物和試 劑盒。
[0006] 本發(fā)明涉及一種用于他莫西芬抗腫瘤藥物敏感度檢測的PCR擴增引物，含有SEQ ID No. 1 ~3所示的上游引物和SEQ ID No. 4~6所示的下游引物。
[0007] 本發(fā)明涉及一種用于他莫西芬抗腫瘤藥物敏感度檢測的單堿基延伸引物，含有 SEQ ID No. 7~9所示的單堿基延伸引物。
[0008] 本發(fā)明設計一種試劑盒，由PCR擴增試劑組、SAP酶試劑組和iPLEX試劑組構成， 其中PCR擴增試劑組含有：PCR緩沖液、MgCl 2、dNTP混合液、Hotstar Taq酶、純水和如SEQ ID No. 1 ~3所示的上游引物和如SEQ ID No. 4~6所示的下游引物；SAP酶試劑組含有：SAP 緩沖液、SAP酶和純水；iPLEX試劑組含有：iPLEX緩沖液、ddNTP混合液、iPLEX聚合酶、純 水和如SEQ ID No. 7~9所示的單堿基延伸引物。
[0009] 上述標記組合優(yōu)選利用飛行質譜（MALDI-T0F)方法進行檢測，檢測方法包括以下 步驟（1)提取基因組DNA，包括提取抗凝血DNA和口腔上皮細胞DNA ; (2)飛行質譜檢測SNP 多態(tài)；（3)根據(jù)SNP分型結果推斷他莫西芬藥物敏感度。
[0010] 本發(fā)明對ABCB1基因上的三個SNP生物標記進行分型，建立了一個快速，簡便，且 成本低廉的檢測試劑盒，該試劑盒準確度高，靈敏性好，具有很強的實用價值。 實施例
[0011] 以下實施例，對本發(fā)明的【具體實施方式】進行詳細描述，實施例用于說明本發(fā)明，但 不用來限制本發(fā)明的范圍，實施例1 :采用飛行質譜方法對腫瘤患者進行SNP分型及他莫西 芬藥物敏感度檢測方法： 一） 提取基因組DNA :本試驗的樣本是使用刮棒采集的口腔粘膜細胞，室溫保存。刮棒 采樣DNA提取的具體步驟如下： 1) 將口腔刮棒上的脫落細胞溶于400 yL IX裂解液中，加入1 yL蛋白酶K，56度水浴 30分鐘； 2) 取出樣品置冰水浴1分鐘，加入6mol/L NaCl 150 y L，劇烈振蕩15-20秒，13000轉 離心10分鐘； 3) 吸取上清液至新的離心管中，加入1. lmL無水乙醇，上下顛倒10次至絮狀DNA沉淀 出現(xiàn)。室溫放置10分鐘，13000轉離心2分鐘沉淀DNA ; 4) 棄去上清液，再加入0. 25mL70%乙醇洗滌DNA沉淀，室溫放置1分鐘后，13000轉離 心5分鐘； 5) 用移液器小心吸取乙醇，然后放入通風櫥中通風10分鐘，然后用35yL TE溶解DNA ; 6) DNA可在4度保存1-2個月，或者存放在-20度長期保存； 7) 使用18PL PCR Master Mix反應液以及2ML DNA模板，PCR擴增0-actin片斷， 1. 5%瓊脂糖凝膠，120V電泳15分鐘，觀察結果合格后轉移至PCR管中； 8) 紫外分光光度計SMA3000測定溶液中DNA的濃度和A260/A280比值，測量3次取平均 值，濃度應在30ng/ y L，A260/A280比值應該在1. 7-2. 0之間，合格的DNA 4°C取用或_20°C 保存； 二) 飛行質譜檢測SNP多態(tài)，采用本發(fā)明中所述試劑盒對樣本中的SNP生物標記進行檢 測，下面為檢測過程： 1) 引物與DNA稀釋以及質檢：PCR引物稀釋至終濃度為0. 5 yM ;根據(jù)Sequenom的稀釋 公式，按照單堿基延伸引物的分子量將引物稀釋至終濃度為7-14 iiM之間； 2) PCR擴增：在每個384孔PCR板中加入1 y L DNA和4 y L PCR擴增試劑，共5 y L，按 照PCR儀程序1進行擴增： PCR 耜序 1，94°C
1Bmin 56°C 30sec 45 cycles 72 °C lmin 72 °C 3min 4°C 00 PCR擴增結束后，將384孔板短暫離心后備用，可在4°C保存； 3) SAP酶處理：在PCR擴增后的產(chǎn)物加入2ML的SAP酶試劑，共7ML。按照PCR儀程序 2進行擴增： -**^PCR 程序 2 :37°C，40min 85〇C,5min 4°C, ^ SAP酶處理結束，將384孔板取出短暫離心備用； 4) iPLEX延伸：在SAP酶處理后的產(chǎn)物加入2ML的iPLEX試劑，共9ML。按照PCR儀程 序3進行擴增； PCR 程序 3:94°C 30sec
iPLEX延伸結束，將384孔板取出短暫離心備用； 5) 樹脂純化與數(shù)據(jù)收集 將反應產(chǎn)物(共9 y L)加入25 y L水進行稀釋，使用樹脂進行脫鹽；將脫鹽處理后的樣 品點在芯片靶點上，自然結晶，上機進行質譜檢測，并收集數(shù)據(jù)； 三）根據(jù)SNP分型結果推斷他莫西芬藥物敏感度： 根據(jù)腫瘤患者樣品DNA中3個SNP生物標記的分型結果，我們對患者他莫西芬藥物敏 感度進行評價，如果樣品DNA中含有對他莫西芬藥物耐藥的基因型，我們將對患者進行風 險提不。
【主權項】
1. 一種用于他莫西芬抗腫瘤藥物敏感度檢測的PCR擴增引物，其特征在于，包含SEQ ID No. 1 ~3所示的上游引物和SEQ ID No. 4~6所示的下游引物。2. -種用于他莫西芬抗腫瘤藥物敏感度檢測的引物單堿基延伸引物，其特征在于，包 含SEQ ID No. 7~9所示的單堿基延伸引物。3. -種用于他莫西芬抗腫瘤藥物敏感度檢測的方法，其特征在于，由PCR擴增試劑組、 SAP試劑組、iPLEX試劑組構成，包括： 1. PCR擴增試劑組含有：PCR緩沖液、MgCl2、dNTP混合液、Hotstar Taq酶、純水和如 SEQ ID No. 1 ~3所示的上游引物和如SEQ ID No. 4~6所示的下游引物； 2. SAP酶試劑組含有：SAP緩沖液、SAP酶和純水； 3. iPLEX試劑組含有：iPLEX緩沖液、ddNTP混合液、iPLEX聚合酶、純水和如SEQ ID No. 7~9所示的單堿基延伸引物。4. 根據(jù)權利要求3所述方法制造的系列試劑盒，包括： 1) 根據(jù)權利要求3所述方法制造的試劑盒，其特征是，所述的PCR擴增緩沖液為10 X 緩沖液，含2mM MgCl2; 2) 根據(jù)權利要求3所述方法制造的試劑盒，其特征是，所述的MgCl2濃度為2mM ; 3) 根據(jù)權利要求3所述方法制造的試劑盒，其特征是，所述的dNTP混合液的濃度為 500 y M ; 4) 根據(jù)權利要求3所述方法制造的試劑盒，其特征是，所述的Hotstar Taq酶為0. 5U ; 5) 根據(jù)權利要求3所述方法制造的試劑盒，其特征是，所述的SAP緩沖液為IOX緩沖 液； 6) 根據(jù)權利要求3所述方法制造的試劑盒，其特征是，所述的SAP酶為I. 7 U/ y L的蝦 堿性磷酸酶； 7) 根據(jù)權利要求3所述方法制造的試劑盒，其特征是，所述的iPLEX緩沖液IOX緩沖 液； 8) 根據(jù)權利要求3所述的方法制造的試劑盒，其特征是，所述的ddNTP混合液為經(jīng)過 質量修飾的核苷酸； 9) 根據(jù)權利要求3所述的方法制造的試劑盒，其特征是，所述的單堿基延伸酶為iPLEX 聚合酶。
【專利摘要】一種分子生物技術領域的用于他莫西芬抗腫瘤藥物敏感度檢測方法包括引物、探針及以此制造的試劑盒，該試劑盒由PCR擴增試劑組、SAP酶試劑組、iPLEX試劑組構成。PCR擴增試劑組含有：PCR緩沖液、MgCl2、dNTP混合液、Hotstar？Taq酶、純水和如SEQ？ID？No.1~3所示的上游引物和如SEQ？ID？No.4~6所示的下游引物；SAP酶試劑組含有：SAP緩沖液、SAP酶和純水；iPLEX試劑組含有：iPLEX緩沖液、ddNTP混合液、iPLEX聚合酶、純水和如SEQ？ID？No.7~9所示的單堿基延伸引物。利用該項技術將腫瘤患者的DNA提取并處理后，利用飛行質譜方法，檢測引物擴增片段內(nèi)的生物標記，并基于檢測結果評價腫瘤患者對他莫西芬藥物的敏感度，結果準確，靈敏度高，方法快速簡便并且有很高通量。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開號】CN105132564
【申請?zhí)枴緾N201510590488
【發(fā)明人】王健, 郭景康
【申請人】上海大學
【公開日】2015年12月9日
【申請日】2015年9月17日