專利名稱：三環(huán)縮醛內(nèi)酯素及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及三環(huán)縮醛內(nèi)酯素類化合物、用白淺灰鏈霉菌制備三環(huán)縮醛內(nèi)酯素類化合物的方法；本發(fā)明還涉及該類化合物在制備細胞周期抑制劑、細胞凋亡誘導劑或抗腫瘤劑中的用途。
背景技術：
微生物發(fā)酵產(chǎn)物或植物材料中具有細胞周期抑制、細胞凋亡誘導或抗腫瘤活性的化合物已在文獻[長田裕之等，新規(guī)物質(zhì)トリプロスタチン、その製造法、細胞周期阻害剤および抗腫瘍剤，日本專利，公開特許広報(A)，特開平9-59275，公告日平成9年(1997年)3月4日；長田裕之等，新規(guī)物質(zhì)ァセトフタリジン、細胞周期阻害剤および抗腫瘍剤，日本專利，公開特許広報(A)，特開平9-87269，公告日平成9年(1997年)3月31日]及文獻[崔承彬等，咔唑生物堿類細胞周期抑制劑、細胞凋亡誘導劑及其制備，中國專利CN1309964A；崔承彬等，咔唑生物堿類抗癌藥物及其制備，中國專利CN1357327A]中曾有報道。但以上這些文獻所報道的化合物的化學結(jié)構(gòu)屬咔唑類等不同母體結(jié)構(gòu)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種全新化學骨架結(jié)構(gòu)的具有細胞周期抑制、細胞凋亡誘導以及直接殺傷癌細胞等抗腫瘤活性的化合物。
本發(fā)明人通過堅韌不拔的努力，發(fā)現(xiàn)了全新化學骨架結(jié)構(gòu)的三環(huán)縮醛內(nèi)酯素(tricyclacetalactonin)類新化合物，如式I所示
式I式I中，R1為氨基或羥基；R2為羥基、氨基或氫。
其結(jié)構(gòu)特征是分子骨架結(jié)構(gòu)是由一個五元碳環(huán)和兩個六元氧雜環(huán)組成的三環(huán)骨架結(jié)構(gòu)，其中，五元碳環(huán)是結(jié)構(gòu)的基本碳骨架，一個六元氧雜環(huán)是由該五元碳環(huán)上的一個醛基通過與該醛基的鄰位一個側(cè)鏈碳上的烯醇羥基縮合形成的一個縮醛烯醚類六元氧雜環(huán)，而另一個六元氧雜環(huán)則是由該醛基經(jīng)與烯醇羥基縮合產(chǎn)生的半縮醛羥基與連在五元碳環(huán)上的一個羧基上的羥基進一步縮合形成的一個縮醛內(nèi)酯類六元氧雜環(huán)，在上述三環(huán)骨架結(jié)構(gòu)的不同位置上連接不同的取代基，本發(fā)明采用麗絲胺羅丹明B(sulforhodamine B，SRB)法和流式細胞術結(jié)合顯微鏡下檢測細胞形態(tài)特征的方法，測試了式I化合物對小鼠乳腺癌tsFT210細胞、人慢性髓性白血病K562細胞及人大腸癌HCT-15細胞的細胞增殖抑制、細胞周期抑制和細胞凋亡誘導以及對該細胞的直接殺傷等作用。實驗證實，式I化合物對腫瘤細胞可通過抑制細胞周期周轉(zhuǎn)、誘發(fā)癌細胞凋亡或直接的殺傷等方式，顯示抑制腫瘤細胞增殖的生物學活性，從而發(fā)揮其抗腫瘤作用。
因此本發(fā)明的式I化合物可用作細胞周期抑制劑、細胞凋亡誘導劑、或腫瘤細胞殺傷劑。
式I化合物與各種藥物可接受的載體、賦形劑或輔料配伍，可制成抗腫瘤藥物，用于腫瘤的治療。
式I化合物還可作為抑制細胞周期或誘發(fā)細胞凋亡的低分子生物探針用于生命科學研究。當把式I化合物作為細胞周期抑制劑或細胞凋亡誘導劑用于生命科學研究時，可溶于甲醇、水或含水甲醇中，也可溶于二甲基亞砜的含水溶液中加以應用。
本發(fā)明的式I化合物可通過發(fā)酵培養(yǎng)能夠生產(chǎn)三環(huán)縮醛內(nèi)酯素的微生物，獲取含有三環(huán)縮醛內(nèi)酯素類化合物的發(fā)酵物，然后從發(fā)酵物中分離純化而得到。
所述分離純化包括利用本領域技術人員熟知的天然產(chǎn)物分離純化的常規(guī)方法，如液液萃取、柱層析、薄層層析及重結(jié)晶等。
所述能夠產(chǎn)生三環(huán)縮醛內(nèi)酯素的微生物包括鏈霉菌屬產(chǎn)素菌等，如鏈霉菌屬的白淺灰鏈霉菌(Streptomyces albogriseolus)。
在本發(fā)明的一個實驗例中，所用產(chǎn)素菌是從青島近海海泥樣品中分離得到的，經(jīng)分類學研究鑒定為白淺灰鏈霉菌(Streptomyces albogriseolus)的A2-2002株。該菌株已于2003年9月18日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(保藏編號CGMCC1005)。該白淺灰鏈霉菌(Streptomyces albogriseolus)A2-2002 CGMCC 1005株具有如下微生物菌學特征
1各種培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征和形態(tài)特征培養(yǎng)特征在高氏合成一號瓊脂、蔗糖察氏瓊脂、甘油天門冬素瓊脂、克氏合成1號瓊脂、無機鹽淀粉瓊脂、燕麥粉瓊脂、馬鈴薯浸汁瓊脂等7種培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)7-12天后觀察菌絲體的顏色和色素的產(chǎn)生等情況，有關特征見表1。
表1 A2-2002菌株在7種培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征培養(yǎng)基 氣生菌絲 基內(nèi)菌絲 可溶性色素高氏合成一號瓊脂 白淺灰色 淺黃褐無蔗糖察氏瓊脂 白淺灰色 橄欖褐無甘油天門冬素瓊脂 灰白色 杏仁黃無克氏合成1號瓊脂灰白色 象牙黃無無機鹽淀粉瓊脂 灰白色 棕褐色淺褐色燕麥粉瓊脂 灰白色 淡黃色淡黃色馬鈴薯浸汁瓊脂 灰白色 污褐色淡褐色形態(tài)特征在高氏合成一號瓊脂和蔗糖察氏瓊脂上28℃插片培養(yǎng)7～10天后，取插片用光學顯微鏡和電子顯微鏡進行菌絲體的形態(tài)觀察，結(jié)果觀察到菌株的基內(nèi)菌絲體無橫隔，不斷裂；氣生菌絲體生長豐茂；孢子絲緊密和松敞螺旋形；孢子卵圓形，表面粗糙帶疣(光學顯微鏡照片和電子顯微鏡照片略)。
2化學分類學特征胞壁化學組分分析按照Hasegawa的薄層層析(TLC)法進行了全細胞水解液DAP(二氨基庚二酸)氨基酸和糖型分析，結(jié)果表明，A2-2002菌株全細胞水解液含有LL-DAP(左旋二氨基庚二酸，Diaminopimelic acid)，甘氨酸；無特征性糖(糖型C)。細胞壁化學組分屬于I型。
3生理生化特征參照《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》Vol.IV的內(nèi)容對菌株進行了生理生化鑒定。A2-2002菌株的生理生化特征見表2。
表2 A2-2002菌株的生理生化特征


由上述試驗結(jié)果，根據(jù)形態(tài)特征與細胞壁化學組分相結(jié)合定屬的原則，A2-2002菌株的基內(nèi)菌絲體無橫隔、不斷裂；孢子絲螺旋形，孢子表面粗糙帶疣，細胞壁化學組分I型，屬于鏈霉菌屬(Streptomyces)。根據(jù)培養(yǎng)特征和生理生化特征定種的原則，A2-2002菌株的氣生菌絲白淺灰，灰白色調(diào)，基內(nèi)菌絲淺黃，褐色調(diào)，綜合生理生化特征的實驗結(jié)果均與白淺灰鏈霉菌十分相似，故A2-2002菌株定名為白淺灰鏈霉菌(Streptomyces albogriseolus)。
需要特別說明的是，經(jīng)發(fā)酵微生物制取本發(fā)明式I化合物的方法可采用其它任何能生產(chǎn)三環(huán)縮醛內(nèi)酯類化合物的鏈霉菌屬微生物，只要能生產(chǎn)三環(huán)縮醛內(nèi)酯素類化合物的鏈霉菌屬微生物均可用作產(chǎn)素菌用于制備式I化合物。


圖1是化合物I在甲醇中的紫外吸收光譜；圖2是化合物I的紅外吸收光譜(KBr)；圖3是化合物I在氘代吡啶中的1H核磁共振譜；圖4是化合物I在氘代吡啶中的13C核磁共振譜；圖5是化合物I的單晶X線衍射晶體結(jié)構(gòu)；圖6是化合物II在甲醇中的紫外吸收光譜；圖7是化合物II的紅外吸收光譜(KBr)；圖8是化合物II在氘代吡啶中的1H核磁共振譜；圖9是化合物II在氘代吡啶中的13C核磁共振譜；圖10是小鼠乳腺癌tsFT210細胞經(jīng)不同濃度的化合物I處理17小時后測得的流式細胞直方圖。左上圖為空白對照組，其余五個為不同濃度的化合物I(濃度見每個圖右上方)處理組，圖中曲線部為實測數(shù)據(jù)，黑色填充部為計算值。
圖11是人慢性髓性白血病K562細胞經(jīng)不同濃度的化合物I處理24小時后測得的流式細胞術直方圖。左上圖為空白對照組，其余五個為不同濃度的化合物I(濃度見每個圖右上方)處理組，圖中曲線部為實測數(shù)據(jù)，黑色填充部為計算值。
圖12是人大腸癌HCT-15細胞經(jīng)不同濃度的化合物I處理24小時后測得的流式細胞術直方圖。左上圖為空白對照組，其余五個為不同濃度的化合物I(濃度見每個圖右上方)處理組，圖中曲線部為實測數(shù)據(jù)，黑色填充部為計算值。
圖13是小鼠乳腺癌tsFT210細胞經(jīng)不同濃度的化合物II處理17小時后測得的流式細胞直方圖。左上圖為空白對照組，其余五個為不同濃度的化合物II(濃度見每個圖右上方)處理組，圖中曲線部為實測數(shù)據(jù)，黑色填充部為計算值。
圖14是人慢性髓性白血病K562細胞經(jīng)不同濃度的化合物II處理24小時后測得的流式細胞術直方圖。左上圖為空白對照組，其余五個為不同濃度的化合物II(濃度見每個圖右上方)處理組，圖中曲線部為實測數(shù)據(jù)，黑色填充部為計算值。
圖15是人大腸癌HCT-15細胞經(jīng)不同濃度的化合物II處理24小時后測得的流式細胞術直方圖。左上圖為空白對照組，其余五個為不同濃度的化合物II(濃度見每個圖右上方)處理組，圖中曲線部為實測數(shù)據(jù)，黑色填充部為計算值。
具體實施例方式在如下的實施例中所指的化合物I的化學結(jié)構(gòu)是式I化合物，其中R1為氨基；R2為羥基；化合物II的化學結(jié)構(gòu)是式I化合物，其中R1為氨基；R2為氫 式I式中，阿拉伯數(shù)字是化學結(jié)構(gòu)中碳原子的標位。
實施例1 化合物I的發(fā)酵生產(chǎn)及分離精制1發(fā)酵生產(chǎn)產(chǎn)素菌的發(fā)酵培養(yǎng) 按培養(yǎng)微生物的常規(guī)方法，取白淺灰鏈霉菌Streptomycesalbogriseolus A2-2002株適量，接種到高氏合成1號瓊脂固體斜面培養(yǎng)基上，在28攝氏度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天。
取斜面培養(yǎng)4天的白淺灰鏈霉菌Streptomyces albogriseolus A2-2002株適量，接種到一個含100毫升種子培養(yǎng)液[培養(yǎng)基組成(克/升)葡萄糖20.0，K2HPO40.5，MgSO40.5，牛肉膏3.0，玉米漿3.0，酵母膏10.0，淀粉10.0，CaCO32.0，pH7.0]的三角燒瓶中，在28℃、120轉(zhuǎn)/分鐘條件下?lián)u床培養(yǎng)48小時，獲得白淺灰鏈霉菌的種子培養(yǎng)液。取該種子培養(yǎng)液適量，按5％接種量分別接種于100個內(nèi)裝100毫升生產(chǎn)培養(yǎng)液[培養(yǎng)基組成(克/升)葡萄糖20.0，K2HPO40.5，MgSO40.5，牛肉膏3.0，玉米漿3.0，酵母膏10.0，淀粉10.0，CaCO32.0，pH7.0]的三角燒瓶中，裝載于28℃、120轉(zhuǎn)/分鐘搖床上進行為期7天的生產(chǎn)發(fā)酵，獲得含有取代三環(huán)縮醛內(nèi)酯類目標化合物的白淺灰鏈霉菌Streptomyces albogriseolusA2-2002株的發(fā)酵培養(yǎng)物約10升。
2含化合物I的菌體粗提物的制備將白淺灰鏈霉菌Streptomyces albogriseolus A2-2002株的發(fā)酵培養(yǎng)物(約10升)抽濾，棄濾液，得到菌體830克。將該菌絲體用1.5升80％丙酮水溶液浸泡并在室溫下攪拌過夜提取，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，取上清液，減壓濃縮至不含丙酮，所得水層用等體積乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液減壓濃縮，得含化合物I的菌絲體粗浸膏(2.5克)。
3化合物I的分離精制取含化合物I的白淺灰鏈霉菌Streptomyces albogriseolus A2-2002株發(fā)酵培養(yǎng)物的菌絲體粗浸膏(2.5克)，用10毫升氯仿-甲醇(9∶1)混合溶劑溶解后加10克200-300目硅膠G(青島海洋化工集團公司產(chǎn)品)拌樣，上到裝填有30克青島海洋化工集團公司產(chǎn)薄層層析用硅膠G的玻璃減壓柱上，以石油醚-氯仿-甲醇混合液為洗脫溶劑系統(tǒng)，進行減壓柱層析，洗脫溶劑的極性通過分別加大石油醚中氯仿的用量或氯仿中甲醇的用量來梯度遞增，每個流份分別為50毫升，經(jīng)薄層層析檢測，進行合并，共得到14個組份，即Fr-1(20毫克，石油醚洗脫物)，F(xiàn)r-2(65毫克，石油醚-氯仿1∶1洗脫物)，F(xiàn)r-3(120毫克，石油醚-氯仿1∶1洗脫物)，F(xiàn)r-4(260毫克，氯仿及氯仿-甲醇99∶1洗脫物)，F(xiàn)r-5(70毫克，氯仿-甲醇99∶1洗脫物)，F(xiàn)r-6(80毫克，氯仿-甲醇99∶1→98∶2洗脫物)，F(xiàn)r-7(90毫克，氯仿-甲醇98∶2洗脫物)，F(xiàn)r-8(150毫克，氯仿-甲醇97∶3洗脫物)，F(xiàn)r-9(124毫克，氯仿-甲醇97∶3→96∶4洗脫物)，F(xiàn)r-10(190毫克，氯仿-甲醇96∶4洗脫物)，F(xiàn)r-11(108毫克，氯仿-甲醇95∶5洗脫物)，F(xiàn)r-12(252毫克，氯仿-甲醇94∶6→90∶10洗脫物)，F(xiàn)r-13(250毫克，氯仿-甲醇90∶10→60∶40洗脫物)，F(xiàn)r-14(93毫克，氯仿-甲醇50∶50→100∶0洗脫物)。繼而，采用溫敏型小鼠乳腺癌tsFT210細胞的流式細胞術結(jié)合形態(tài)學檢測的篩選模型，以細胞周期抑制、細胞凋亡誘導以及細胞壞死活性為抗癌指標，檢測每個組份的活性，確定了Fr-11具有相關生物活性，從而得到含化合物I的層析組份Fr-11(108毫克)。在減壓回收溶劑的過程中，組份Fr-11給出化合物I的淡黃色粗結(jié)晶，經(jīng)在甲醇中反復重結(jié)晶精制，得到化合物I純品無色透明粒狀晶體49毫克。
化合物I 無色透明方晶，mp236.9-237.9℃，[α]D27-377.9°(c1.0，MeOH)，分子式C10H9NO5，TOF-MS m/z224[M+H]+，246[M+Na]+；Positive HR-TOF-MS m/z實測值224.0585[M+H]+，計算值224.0559(C10H10NO5[M+H]+)；Negative HR-TOF-MS m/z實測值222.0379[M-H]-，計算值222.0402(C10H8NO5[M-H]-)。UV λmaxnm(logε)in MeOH219(399)，末端吸收。IRνmaxcm-1(KBr)3437(NH)，3314，3184(OH)，3095，3002(olefin protons)，2947(methine protons)，1746(lactone carbonyl)，1690(amide I absorption，-CON＜)，1654，1602(amide II absorption，NH2)，1406(C＝C)，1324，1181(＝C-O)，1136，1115，1097(C-O)，1004，953(m)，937(m)，917(vs)，847(m)，791(m)，775(m)，697(m)，675(m)，642(m)，576(s)，530(m)，419(m)。1H及13CNMR數(shù)據(jù)見表3。
表3化合物I在氘代氯仿中的600MHz1H和150MHz13CNMR數(shù)據(jù)a)位置標號 δH(Jin Hz)1H-1H COSYb)δCHMBCc)1 ——163.00s 32 ——144.27s 3，4，9，N-Ha3 6.82d(5.8) 4 106.35d 44 3.39td(ca.5.8，1.5) 3，8，9d)49.30d 3，6，7，95 ——85.03s 4，6，7，86 6.43d(5.9) 7 143.37d 7，87 6.28dd(5.9，3.3)6，8 133.18d 6，88 2.95m 4，7，9 41.30d 3，4，6，79 6.16dd(ca.1.8，1.5) 4d)，8 97.42d 4，6e)10 ——172.84s 4，9N-Ha8.62brs N-Hb——N-Hb8.30brs N-Ha——5-OH9.06brs ——
a)本表信號歸屬基于DEPT、PFG1H-1H COSY、PFG HMQC及PFG HMBC圖譜解析結(jié)果。碳信號的多重度利用DEPT方法確定并分別用s(單重峰)、d(二重峰)、t(三重峰)和q(四重峰)表示。b)此欄中的數(shù)字和代號分別代表在PFG1H-1H COSY譜中與相應行中的1H給出偶合相關信號的1H核。c)此欄中的數(shù)字和代號分別代表在PFGHMBC(1JCH＝8Hz)中與相應行中的碳信號給出遠程雜核相關(HMBC)信號的1H核。d)從PFG1H-1H COSY譜中在4-H和9-H之間檢測到雖然弱但比較顯著的相隔四根鍵的遠程相關信號。e)從PFG HMBC譜(1JCH＝8Hz)中在C-9和6-H之間檢測到相隔四根鍵的遠程雜核相關信號。
實施例2 化合物II的發(fā)酵生產(chǎn)及分離精制1發(fā)酵生產(chǎn)取白淺灰鏈霉菌Streptomyces albogriseolus A2-2002株適量，完全按實施例1中所述相同方法和步驟，在相同條件下進行生產(chǎn)發(fā)酵，獲得含有取代三環(huán)縮醛內(nèi)酯類目標化合物的白淺灰鏈霉菌Streptomyces albogriseolus A2-2002株的發(fā)酵培養(yǎng)物約10升。
2含化合物II的發(fā)酵液粗提物的制備將白淺灰鏈霉菌Streptomyces albogriseolus A2-2002株的發(fā)酵培養(yǎng)物(約10升)抽濾，菌體用適量蒸餾水在抽濾漏斗上直接洗滌、抽濾兩次，合并濾液，得到發(fā)酵濾液10升。將該發(fā)酵濾液(10升)，減壓濃縮至1升，用等體積乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液，減壓濃縮，得到含化合物II的發(fā)酵濾液粗浸膏(6克)。
3化合物II的分離精制與跟蹤活性分離純化化合物I的過程一樣，分離純化化合物II的下述實驗的每一步驟都采用溫敏型小鼠乳腺癌tsFT210細胞的流式細胞術結(jié)合形態(tài)學檢測的篩選模型，以細胞周期抑制、細胞凋亡誘導以及細胞壞死活性為抗癌指標，在檢測每個組分的活性并確定活性組份的基礎上，選擇活性組份，進一步實施下一步分離操作。
取含化合物II的白淺灰鏈霉菌Streptomyces albogriseolus A2-2002株發(fā)酵培養(yǎng)物的濾液粗浸膏(6克)，用5毫升氯仿溶解后加5克200-300目硅膠G(青島海洋化工集團公司產(chǎn)品)拌樣，上到裝填有15克青島海洋化工集團公司產(chǎn)薄層層析用硅膠G的玻璃減壓柱上，以石油醚、氯仿-甲醇溶劑系統(tǒng)為洗脫劑，進行減壓柱層析，洗脫溶劑的極性在由石油醚更換為氯仿后通過增加氯仿中甲醇的用量來梯度遞增，接收每個流份分別為20毫升，經(jīng)薄層層析檢測，進行合并，共得到5個組份，即A-1(200毫克，石油醚洗脫和氯仿洗脫物)，A-2(2.5克，氯仿、氯仿-甲醇98∶2→95∶5洗脫物)，A-3(580毫克，氯仿-甲醇95∶5→92∶8洗脫物)，A-4(740毫克，氯仿-甲醇92∶8→90∶10洗脫物)，A-5(910毫克，氯仿-甲醇80∶20→50∶50及甲醇洗脫物)。
取活性組份A-2(2.5克)，用適量甲醇溶解，上Sephadex LH-20柱，用單一甲醇作為洗脫劑洗脫，按流出先后順序接受，分為五個組份B-1(50毫克)、B-2(2克)、B-3(130毫克)、B-4(83毫克)、B-5(127毫克)。其中，B-2為活性組份。
取B-2(2克)，用氯仿2毫升溶解后加4克200-300目硅膠G(青島海洋化工集團公司產(chǎn)品)拌樣，上到裝填有10克青島海洋化工集團公司產(chǎn)薄層層析用硅膠G的玻璃減壓柱上，以氯仿-甲醇溶劑系統(tǒng)為洗脫劑進行減壓柱層析，洗脫溶劑的極性通過增加氯仿中甲醇的用量來梯度遞增，每個流份分別為10毫升，經(jīng)薄層層析檢測，進行合并，共分為4個組份，即C-1(54毫克，氯仿洗脫物)、C-2(70毫克，氯仿洗脫物)、C-3(1.4克，氯仿及氯仿-甲醇95∶5→90∶10洗脫物)、C-4(192毫克，氯仿-甲醇80∶20及甲醇洗脫物)。其中，C-3為活性組份。
將組份C-3(1.4克)濕法上反相硅膠(RP-18 6克)柱(2.2cm×7.5cm)，用水-甲醇-氯仿溶劑系統(tǒng)梯度洗脫，經(jīng)薄層檢測合并，得到5個組份，D-1(25毫克，水洗脫物)、D-2(49毫克，5％甲醇水洗脫物)、D-3(1.1克，5％→30％甲醇水洗脫物)、D-4(72毫克，50％甲醇及甲醇洗脫物物)、D-5(34毫克，氯仿洗脫物)。其中，D-3為活性組份。
取組份D-3(1.1克)，濕法上減壓硅膠G(5克)柱(2.5cm×7cm)，用石油醚-氯仿-甲醇溶劑系統(tǒng)梯度洗脫，通過薄層檢測并合并相關流份，得到10個組份，E-1(27毫克，石油醚及石油醚-氯仿80∶20→70∶30洗脫物洗脫物)，E-2(700毫克，石油醚-氯仿70∶30、氯仿及氯仿-甲醇99∶1→98∶2洗脫物)，E-3(46毫克，氯仿-甲醇97∶3洗脫物)，E-4(50毫克，氯仿-甲醇96∶4→95∶5洗脫物)，E-5(46毫克，氯仿-甲醇95∶5→94∶6洗脫物)，E-6(31毫克，氯仿-甲醇93∶7洗脫物)，E-7(23毫克，氯仿-甲醇92∶8→90∶10洗脫物)，E-8(30毫克，氯仿-甲醇90∶10洗脫物)，E-9(51毫克，氯仿-甲醇90∶10→60∶40洗脫物)，E-10(12毫克，甲醇洗脫物)。其中，E-2為活性組份。
取組份E-2(700毫克)，濕法上加壓硅膠G(10克)柱(2.5cm×7cm)，用氯仿-甲醇-水(10∶3∶3)混合溶劑恒梯度洗脫，按洗脫順序接收各流份，經(jīng)薄層層析檢測后合并，得到7個組份，F(xiàn)-1(300毫克)，F(xiàn)-2(33毫克)，F(xiàn)-3(24毫克)，F(xiàn)-4(15毫克)，F(xiàn)-5(17毫克)，F(xiàn)-6(8毫克)，F(xiàn)-7(59毫克)。其中，F(xiàn)-1為活性組份。
將含化合物II的活性組份F-1(300毫克)用適量甲醇溶解，上甲醇中浸泡填裝的Sephadex LH-20柱，用甲醇洗脫層析，截取含目標化合物的洗脫流份，減壓濃縮，得到油狀化合物II的純品190毫克。
化合物II 淡棕魚油狀物，[a]D31-531.7°(c0.5，CHCl3)，分子式C10H9NO4，TOF-MS m/z208[M+H]+，225[M+H2O]+，230[M+Na]+；Positive HR-TOF-MS m/z實測值208.0585[M+H]+，計算值208.0559(C10H10NO4[M+H]+)；Negative HR-TOF-MS m/z實測值207.0379[M-H]-，計算值207.0402(C10H8NO4[M-H]-)。UVλmaxnm(logε)in MeOH216(3.95)，末端吸收。IRνmaxcm-1(KBr)3428(NH)，3085(olefin protons)，2987，2930(methine protons)，1754(lactonecarbonyl)，1687(amide I absorption，-CON＜)，1649，1595(amide II absorption，NH2)，1406(C＝C)，1369，1320(＝C-O)，1199，1122，1096，1066(C-O)，991(m)，964(s)，911(m)，840(m)，805(w)，771(m)，695(m)，638(w)，596(m)，554(w)，474(vw)。1H及13C NMR數(shù)據(jù)見表4。
表4化合物II在氘代吡啶中的600MHz1H和150MHz13CNMR數(shù)據(jù)a)位置標號 δH(Jin Hz)1H-1HCOSYb)δCHMBCc)1 —— 163.23s 32 —— 144.04s 3，4，9，N-Ha3 6.59d(5.8) 4 107.43d 44 3.02m 3，5，8，9d)42.11d3，6，7，8，95 3.42m 4，652.29d4，6，7，86 6.27AB type5 136.69d 7.87 6.27AB type8 135.22d 5，68 2.66m 4，7，9 38.93d3，4，5，6，79 6.06dd(ca1.8，1.4) 4d)，8 96.29d410—— 168.78s 4，5，6，9N-Ha 8.59brsN-Hb——N-Hb 8.29brsN-Ha——a)本表信號歸屬基于DEPT、PFG1H-1H COSY、PFG HMQC及PFG HMBC圖譜解析結(jié)果。碳信號的多重度利用DEPT方法確定并分別用s(單重峰)、d(二重峰)、t(三重峰)和q(四重峰)表示。b)此欄中的數(shù)字和代號分別代表在PFG1H-1H COSY譜中與相應行中的1H給出偶合相關信號的1H核。c)此欄中的數(shù)字和代號分別代表在PFGHMBC(1JCH＝8Hz)譜中與相應行中的碳信號給出遠程雜核相關(HMBC)信號的1H核。d)從PFG1H-1H COSY譜中在4-H和9-H之間檢測到雖然弱但比較顯著的相隔四根鍵的遠程相關信號。
實施例3 對癌細胞的增殖抑制、細胞周期抑制、凋亡誘導及細胞殺傷活性測試1實驗樣品及實驗方法被測樣品溶液的配制測試樣品為上述實施例1和實施例2中分離精制的純品化合物I和化合物II。精密稱取適量樣品，用甲醇配制成所需濃度的溶液，供測活性。
細胞系及細胞的繼代培養(yǎng)活性測試采用小鼠乳腺癌tsFT210細胞、人慢性髓性白血病K562細胞及人大腸癌HCT-15細胞等哺乳動物的癌細胞系。各種細胞均用含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，在32℃(tsFT210細胞)或在37℃(K562細胞及HCT-15細胞)于通入5％二氧化碳的培養(yǎng)箱中繼代培養(yǎng)。
細胞增殖抑制活性測試方法(SRB法)本法明采用SRB(sulforhodamine B，麗絲胺羅丹明B)法，測試評價了被測試樣品對癌細胞增殖的抑制活性。該SRB法是近來開發(fā)并用于抗癌藥物篩選和評價的新的比色法。麗絲胺羅丹明B即SRB是一種亮粉紅色的氨基夾氧雜蒽類染料(aminoxanthene dye)，分子中具有兩個磺酸基。在微酸性條件下，SRB可定量地結(jié)合到經(jīng)三氯醋酸固定的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸殘基上，從而提供測定細胞蛋白質(zhì)含量的很靈敏的定量指標。細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的含量與活細胞的密度呈線性關系，因此，SRB法可用于評價抗癌藥物對癌細胞增殖的抑制活性。
活性測試時，取對數(shù)生長期的tsFT210、K562或HCT-15細胞，用新鮮的RPMI-1640培養(yǎng)基配制成密度為每毫升2×105個細胞的細胞懸液，按每孔200微升接種于96孔板中，每孔加入2微升不同濃度的樣品溶液，32℃下培養(yǎng)17小時(tsFT210細胞)或37℃下培養(yǎng)24小時(K562細胞和HCT-15細胞)。取藥物作用下培養(yǎng)后的細胞，首先在光學顯微鏡下觀察藥物處理引起的形態(tài)學變化，判斷有無細胞周期抑制，細胞凋亡或細胞壞死的形態(tài)學特征，繼而在4℃、3000轉(zhuǎn)/分鐘條件下下離心3分鐘，吸去上清。每孔細胞中加入20％三氯醋酸50微升，置于4℃固定1小時，用水沖洗5次并空氣干燥。每孔加入0.4％SRB的醋酸溶液50微升并在室溫靜置30分鐘。用1％醋酸水清洗4次，除去未結(jié)合的游離SRB染料。每孔加入150微升Tris緩沖液(10mmol/L，pH10.5)溶解蛋白結(jié)合染料并利用MD公司產(chǎn)SPECTRAMAXPlus型酶標儀測定每孔在520nm處的光密度(OD)值。在同一塊96孔板中樣品的每個濃度均設置三孔，另設三孔作為空白對照。取三孔平均OD值按IR％＝(OD空白對照-OD樣品)/OD空白對照×100％式計算每個濃度下的細胞增殖抑制率(IR％)，再利用Bliss方法，由各種濃度的抑制率(IR％)求得半數(shù)抑制濃度(IC50)。同樣的測試和計算分別進行三次，求得IC50的平均值和標準差。
細胞周期抑制和細胞凋亡誘導活性的流式細胞術測試方法取對數(shù)生長期的tsFT210、K562或HCT-15細胞，用新鮮的RPMI-1640培養(yǎng)基配制成密度為每毫升2×105個細胞的細胞懸液，按每孔0.5毫升接種于24孔板中，每孔加入5微升不同濃度的樣品溶液，32℃下培養(yǎng)17小時(tsFT210細胞)或37℃下培養(yǎng)24小時(K562細胞和HCT-15細胞)。取藥物作用下培養(yǎng)后的細胞，首先在光學顯微鏡下觀察藥物處理引起的形態(tài)學變化，判斷有無細胞周期抑制，細胞凋亡或細胞壞死的形態(tài)學特征，必要時進行拍照。繼而將細胞分別從24孔板轉(zhuǎn)移至1.5毫升Eppendorf離心管中，4℃下3000轉(zhuǎn)/分離心3分鐘，吸去上清液，加0.5毫升磷酸緩沖溶液(PBS)震蕩洗滌一次，相同條件下離心收集細胞，加150微升碘化丙啶(PI)水溶液(在100毫升水中含5毫克PI、100毫克檸檬酸納和200毫克NP-40)，4℃下染色30分鐘后，加入150微升PBS稀釋，用流式細胞儀分析測定細胞中DNA的含量分布。細胞在細胞周期各時相中的分布利用庫爾特公司產(chǎn)計算機軟件WinCycle進行分析計算。
2實驗結(jié)果化合物I和化合物II的細胞增殖抑制活性用不同濃度的化合物I和II分別處理tsFT210細胞17小時、K562和HCT-15細胞各24小后用SRB法測試的活性結(jié)果見表5和表6。
表5化合物I細胞增殖抑制活性的SRB法測試結(jié)果(平均值±標準差，n＝3)濃度 抑制率％(μg/ml)tsFT210細胞K562細胞 HCT-15細胞0.395.2±6.1 4.6±2.9 9.8±11.40.787.1±4.9 13.8±1.7 6.2±2.61.5614.1±6.7 23.1±2.7 16.2±2.63.1323.8±10.6 39.3±1.5 21.5±17.46.2535.0±8.5 52.0±1.6 33.8±15.012.50 41.8±6.6 57.1±3.6 35.3±18.825.049.2±1.2 59.1±4.1 38.4±13.650.057.6±7.2 59.8±0.8 47.0±1.4100.0 63.6±5.9 60.2±1.3 59.6±6.5IC5020.4±5.9 5.6±0.4 55.1±13.2表6化合物II細胞增殖抑制活性的SRB法測試結(jié)果(平均值±標準差，n＝3)濃度 抑制率％(μg/ml)tsFT210細胞K562細胞 HCT-15細胞0.3910.4±11.6 8.3±2.9 6.6±3.80.786.8±5.8 14.1±2.8 7.0±5.3
1.5612.2±7.8 13.4±3.6 6.2±2.83.13-15±12.8 20.1±2.2 6.3±3.86.25-4.2±9.0 23.4±7.5 13.6±1.812.50 -4.4±2.7 33.7±5.3 22.1±4.825.07.2±7.5 49.7±1.8 33.9±6.450.013.4±2.5 56.2±2.3 45.1±1.5100.0 24.8±5.2 59.4±0.7 47.6±1.2IC50＞100 29.6±6.0 ＞100化合物I活性的流式細胞術分析檢測結(jié)果用不同濃度的化合物I分別處理tsFT210細胞17小時、K562和HCT-15細胞各24小后，用流式細胞術分析測得的化合物I對癌細胞的細胞周期抑制及凋亡誘導活性測試結(jié)果見表7、表8和表9。
表7 tsFT210細胞經(jīng)化合物I處理17小時后的測試結(jié)果(平均值±標準差，n＝3)濃度(μg/ml)sub-G0/G1％ G0/G1％ S％ G2/M％Cotroll 0.6±0.3 31.7±4.2 47.5±0.820.8±3.30.390.8±0.6 31.8±4.9 46.4±1.121.8±4.20.780.9±0.5 31.3±3.2 45.9±3.222.7±6.41.561.0±0.6 22.1±4.4 47.5±5.030.4±1.33.131.5±1.0 3.1±4.153.4±26.5 43.5±30.56.252.8±1.9 1.1±0.541.7±1.957.2±2.412.50 4.3±2.1 15.8±3.1 44.5±19.4 39.6±16.425.06.8±8.8 17.0±2.9 46.9±8.136.2±10.050.06.5±8.9 17.5±1.1 46.5±11.1 36.0±12.1100.0 0.9±0.5 14.1±2.9 56.3±2.729.7±5.5注本表數(shù)據(jù)系將tsFT210細胞經(jīng)碘化丙啶染色后用流式細胞術分析測得結(jié)果。
表8 K562細胞經(jīng)化合物I處理24小時后的測試結(jié)果(平均值±標準差，n＝3)濃度(μg/ml)sub-G0/G1％ G0/G1％ S％ G2/M％Cotroll 2.832.9 36.9±3.048.2±1.814.9±1.40.392.2±1.8 36.8±3.847.1±3.216.1±1.30.782.7±2.4 35.2±3.847.9±5.716.9±1.8
1.56 2.5±1.8 24.5±10.655.4±3.820.1±6.93.13 4.7±1.4 7.43±11.670.1±1.322.4±12.06.25 16.7±6.923.7±0.9 59.0±2.017.3±2.912.5010.6±5.023.9±2.0 57.4±2.318.7±1.225.0 6.0±3.4 27.4±2.0 63.1±2.39.57±1.150.0 3.6±1.6 27.2±4.6 68.3±5.14.53±1.7100.01.8±1.2 15.3±11.670.9±10.0 13.8±8.1注本表數(shù)據(jù)系將K562細胞經(jīng)碘化丙啶染色后用流式細胞術分析測得結(jié)果。
表9 HCT15細胞經(jīng)化合物I處理24小時后的測試結(jié)果(平均值±標準差，n＝3)濃度(μg/ml)sub-G0/G1％ G0/G1％ S％ G2/M％Cotroll 3.6±1.9 38.5±2.6 39.2±4.0 22.3±2.10.395.4±4.6 34.8±4.4 39.5±5.5 25.7±1.10.785.8±2.6 24.3±6.1 43.6±1.2 32.1±5.71.569.8±5.3 4.40±3.6 32.1±5.2 63.5±1.63.1313.9±12.56.70±10.841.3±24.452.0±14.06.2530.2±6.6 12.8±5.2 56.8±12.430.4±7.312.50 22.6±6.2 12.2±4.6 64.6±2.6 23.2±7.125.020.3±7.5 28.9±2.7 24.6±7.9 46.5±5.750.014.8±6.1 16.5±9.8 50.5±3.4 32.9±7.9100.0 35.7±16.129.6±17.530.7±20.039.7±6.1注本表數(shù)據(jù)系將HCT-15細胞經(jīng)碘化丙啶染色后用流式細胞術分析測得結(jié)果。
化合物II活性的流式細胞術分析檢測結(jié)果用不同濃度的化合物II分別處理tsFT210細胞17小時、K562和HCT-15細胞各24小后，用流式細胞術分析測得的化合物I對癌細胞的細胞周期抑制及凋亡誘導活性測試結(jié)果見表10、表11和表12。
表10 tsFT210細胞經(jīng)化合物II處理17小時后的測試結(jié)果(平均值±標準差，n＝3)濃度(μg/ml) subG0/G1％ G0/G1％S％ G2/M％Cotroll 0.3±0.230.1±1.0 47.7±1.621.9±1.70.39 2.6±1.631.3±1.3 47.1±0.421.6±1.00.78 3.8±0.935.3±4.3 46.4±1.318.3±3.1
1.56 3.9±1.235.6±4.946.5±2.118.0±2.93.13 5.1±0.837.9±7.246.1±2.816.0±4.86.25 4.8±1.636.0±4.247.1±1.816.9±2.512.505.3±2.435.8±2.948.1±0.816.0±2.225.0 4.4±1.826.8±3.452.5±1.820.5±2.950.0 9.8±3.210.0±5.254.7±1.635.3±5.3100.010.0±2.9 18.9±0.751.8±0.429.2±0.5注本表數(shù)據(jù)系將tsFT210細胞經(jīng)碘化丙啶染色后用流式細胞術分析測得結(jié)果。
表11 K562細胞經(jīng)化合物II處理24小時后的測試結(jié)果(平均值±標準差，n＝3)濃度(μg/ml) sub-G0/G1％ G0/G1％S％ G2/M％Cotroll 2.6±1.0 45.8±7.4 44.2±10.0 10.0±2.50.39 2.1±1.8 43.9±4.3 46.0±7.2 10.0±2.90.78 2.1±1.9 44.1±4.7 45.5±12.0 10.4±3.31.56 2.0±1.9 42.5±3.5 46.5±12.2 11.0±4.73.13 2.3±2.1 42.9±4.4 46.2±7.6 10.8±3.36.25 1.7±1.3 37.0±1.0 47.6±7.5 15.4±7.412.502.0±1.7 17.1±15.4 54.2±3.1 28.7±17.625.0 5.2±1.2 2.8±3.0 51.2±13.7 46.1±16.350.0 7.1±1.6 11.5±0.9 57.0±2.6 32.9±2.8100.03.37±0.711.3±3.2 63.2±17.9 25.5±14.9注本表數(shù)據(jù)系將K562細胞經(jīng)碘化丙啶染色后用流式細胞術分析測得結(jié)果。
表12 HCT-15細胞經(jīng)化合物II處理24小時后的測試結(jié)果(平均值±標準差，n＝3)濃度(μg/ml) sub-G0/G1％ G0/G1％ S％ G2/M％Cotroll 5.2±2.0 43.8±2.1 40.6±1.515.5±0.90.39 5.1±1.6 40.7±2.7 44.3±1.414.9±1.40.78 5.1±0.7 41.0±2.6 44.8±0.814.3±1.91.56 4.3±0.3 39.1±2.0 46.4±1.114.5±1.93.13 4.2±0.4 39.4±0.6 46.6±1.414.1±0.86.25 5.2±0.7 34.2±1.8 45.4±1.020.4±1.012.50 9.1±3.2 16.6±0.6 39.5±1.443.9±1.925.0 22.4±0.8 24.3±9.4 55.3±9.520.4±3.2
50.0 9.8±3.4 28.7±1.0 26.6±2.844.6±3.6100.0 19.9±2.8 45.5±5.9 16.6±7.538.0±5.4注本表數(shù)據(jù)系將HCT-15細胞經(jīng)碘化丙啶染色后用流式細胞術分析測得結(jié)果?；衔颕和化合物II對癌細胞殺傷活性的形態(tài)學檢測結(jié)果在光學倒置顯微鏡下觀察到，tsFT210細胞當分別用化合物I和化合物II處理時，隨著樣品濃度增高細胞形態(tài)逐漸發(fā)生變化。在低濃度(化合物I低于0.78μg/ml，化合物II低于12.5μg/ml)時與空白對照組一樣，滿視野大多是體積較小的G0/G1細胞，隨著樣品濃度的提高，從化合物I為1.56μg/ml、化合物II為25-μg/ml時開始，視野中胞體飽滿且體積較大的G2/M期細胞逐漸多起來，呈典型的G2/M期抑制，并在化合物I為3.13-6.25μg/ml、化合物II為50μg/ml時達高峰。另外，經(jīng)化合物II高濃度(100μg/ml)處理后的tsFT210細胞中可觀測到部分雪花瓣狀或膜裹著碎片凋亡細胞。
同樣，當用不同濃度的化合物I和化合物II處理時，K562細胞的形態(tài)學變化也與上述tsFT210細胞相似，從化合物I為1.56μg/ml、化合物II為6.25μg/ml時開始，視野中G2/M期細胞逐漸多起來，呈典型的G2/M期抑制，并且在化合物I為3.13μg/ml、化合物II為25μg/ml時G2/M期抑制達高峰。同時，隨著藥物濃度提高，從化合物I為3.13μg/ml、化合物II為25μg/ml時開始，從視野中可觀測到部分凋亡細胞。
HCT-15細胞當分別用不同濃度的化合物I和化合物II處理時，形態(tài)學變化與上述tsFT210及K562細胞相似，從化合物I為0.78μg/ml、化合物II為6.25μg/ml時開始，視野中G2/M期細胞逐漸多起來，呈典型的G2/M期抑制，并在化合物I為1.56-3.13μg/ml、化合物II為12.5μg/ml時G2/M期抑制達高峰。但HCT-15細胞似乎對化合物I和化合物II更為敏感、更易于被化合物I和II誘發(fā)凋亡，從化合物I為1.56μg/ml、化合物II為12.5μg/ml時開始，從視野中就可觀測到比較顯著的部分凋亡細胞，而且當濃度達到化合物I為6.25μg/ml、化合物II為25μg/ml以上時，可觀測到非常顯著的凋亡細胞。
另外，當化合物I和化合物II的濃度超過100μg/ml時，無論tsFT210及K562細胞還是HCT-15細胞均有部分細胞呈胞體膨大且暗色不透明的典型的壞死細胞的形態(tài)特征，表明高濃度的化合物I和化合物II對這些癌細胞均具有直接的殺傷作用。
上述形態(tài)學觀測結(jié)果與流式細胞術檢測分析結(jié)果完全吻合(參見圖10-圖15以及表7-表12)。
總之，化合物I和化合物II均可顯著抑制tsFT210、K562、HCT-15等癌細胞的增殖，化合物I抑制這些癌細胞增殖的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為20.4±5.9μg/ml(tsFT210細胞)、5.6±0.4μg/ml(K562細胞)、55.1±13.2μg/ml(HCT-15細胞)；化合物II的IC50分別為IC50＞100μg/ml(tsFT210細胞，100μg/ml時的抑制率IR％為24.8±5.2％)、29.6±6.0μg/ml(K562細胞)、IC50＞100μg/ml(HCT-15細胞，100μg/ml時的抑制率IR％為47.6±1.2％)。
化合物I對tsFT210、K562和HCT-15細胞發(fā)揮細胞周期抑制作用的MIC值為1.56μg/ml(tsFT210細胞)、0.78μg/ml(K562細胞)和0.39μg/ml(HCT-15細胞)，發(fā)揮細胞凋亡誘導作用的MIC值為6.25μg/ml(tsFT210細胞)、3.13μg/ml(K562細胞)和0.39μg/ml(HCT-15細胞)?；衔颕I對tsFT210、K562和HCT-15細胞發(fā)揮細胞周期抑制作用的MIC值為25μg/ml(tsFT210細胞)、6.25μg/ml(K562細胞)和6.25μg/ml(HCT-15細胞)，發(fā)揮細胞凋亡誘導作用的MIC值為25μg/ml(tsFT210細胞)、50μg/ml(K562細胞)和6.25μg/ml(HCT-15細胞)。
3結(jié)論化合物I和化合物II對包括人在內(nèi)的哺乳動物來源的癌細胞具有直接殺傷(壞死性細胞殺傷作用)和細胞周期抑制及細胞凋亡誘導等抗腫瘤作用。
權利要求
1.式I化合物，其中R1為氨基或羥基；R2為羥基、氨基或氫。 式I
2.權利要求1所述的式I化合物，其中R1為氨基；R2為羥基或氫。
3.權利要求1所述式I化合物的制備方法，其特征是發(fā)酵培養(yǎng)鏈霉菌屬的三環(huán)縮醛內(nèi)酯素生產(chǎn)菌、獲取含有三環(huán)縮醛內(nèi)酯素類化合物的發(fā)酵物，然后從發(fā)酵物中分離純化出式I化合物。
4.權利要求3所述式I化合物的制備方法，所述鏈霉菌屬的三環(huán)縮醛內(nèi)酯素生產(chǎn)菌是白淺灰鏈霉菌(Streptomyces albogriseolus)A2-2002 CGMCC1005。
5.權利要求1所述的式I化合物用作細胞周期抑制劑、細胞凋亡誘導劑和腫瘤細胞殺傷劑的用途。
6.權利要求1所述的式I化合物用于抑制腫瘤細胞增殖的用途。
7.權利要求1所述的式I化合物用于制備抗腫瘤藥物的用途。
8.白淺灰鏈霉菌(Streptomyces albogriseolus)A2-2002 CGMCC1005。
9.權利要求8所述的菌株用于生產(chǎn)權利要求1所述的式I化合物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及三環(huán)縮醛內(nèi)酯素及其制備方法和用途。本發(fā)明用白淺灰鏈霉菌生產(chǎn)全新化學骨架結(jié)構(gòu)的三環(huán)縮醛內(nèi)酯素類化合物。經(jīng)實驗證實，該類化合物可作為細胞周期抑制劑、細胞凋亡誘導劑或抗腫瘤劑。
文檔編號C12P17/18GK1546494SQ20031011555
公開日2004年11月17日 申請日期2003年12月1日 優(yōu)先權日2003年12月1日
發(fā)明者崔承彬, 顧謙群, 古靜燕, 蔡兵, 張冬云, 管華詩 申請人:中國海洋大學