心30
秒；
5.移去上清，加入1.5mlZ Buffer，重懸使細(xì)胞分散均勾，可以Vortex;
6.10，000g室溫離心30秒收集細(xì)胞。去上清，加入300μ1 Z Buffer，(所以濃縮倍數(shù)為
1.5ml/0.3ml=5)；
7.取其中0.1ml重懸液到新EP管中；
8.將管子放入液氮中0.5-1分鐘，使細(xì)胞充分凍結(jié)；
9.將凍住的管子放入37°C水浴鍋0.5-1分鐘使其溶解；
10.重復(fù)9、10步驟2次以上，是的細(xì)胞充分破裂；
11.在空白管中加入0.1ml Z Buffer；
12.加入0.7mlZ Buffer + β-Me到空白管及測(cè)試管中。(注意:Z Buffer + β-Me不能再反復(fù)凍融前加)；
13.開(kāi)始計(jì)時(shí)，并迅速加入160μ1ONPG到空白管及測(cè)試管中；
14.將管子放入30°C保溫；
15.當(dāng)黃色生成后，加入0.4mlIM Na2CO3到反應(yīng)液中，并記下終止反應(yīng)時(shí)間； 16.14, OOO轉(zhuǎn)/分鐘室溫離心5分鐘去掉細(xì)胞殘??；
17.將分光光度計(jì)調(diào)到0D42Qnm，用空白管調(diào)到O，測(cè)試其他測(cè)試樣品OD值；
18.0D值應(yīng)該在0.02-1.0范圍內(nèi)，否則會(huì)影響準(zhǔn)確性，需要加倍濃縮或者稀釋酵母；
19.計(jì)算0-Galactosidase(0-半乳糖苷酶)活力單位；
20.1U=每分鐘每個(gè)細(xì)胞分解ΙμΜ ONPG所需要的酶量；
21.β-Galactosidase單位=1 ,OOOOD420/(?νΟ?θοο)；
22.t=孵育的分鐘數(shù)；
23.v=0.1ml濃縮倍數(shù);
24.0D6QQ=Iml酵母OD值。
[0058]結(jié)果:圖13中可以看到，對(duì)ZmMADS47全長(zhǎng)以及其各分段的轉(zhuǎn)錄激活檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，ZmMADS47全長(zhǎng)不具備轉(zhuǎn)錄激活能力，而C端轉(zhuǎn)錄激活能力較強(qiáng)。
[0059]實(shí)施例八:基因槍轉(zhuǎn)化觀察ZmMADS47的亞細(xì)胞定位，具體步驟如下:
I.取新鮮洋蔥，用手術(shù)刀切割約22cm2的內(nèi)皮正置于MS培養(yǎng)基(MS粉末4.33g/L，蔗糖30g/L，用2M/L的KOH調(diào)pH至5.8,0.7%瓊脂粉)中，25°C暗培養(yǎng)至少8個(gè)小時(shí)；
2.將實(shí)現(xiàn)配置好的鎢粉或者金粉重新渦旋5分鐘，取8μ1分裝于進(jìn)口EP管內(nèi)；
3.依次加入以下試劑并且繼續(xù)渦旋至少2分鐘:
Iyg質(zhì)粒；
8μ1 2.5M/L CaCl2;
4μ1 0.1M/L 亞精胺;
4.以最大轉(zhuǎn)速不超過(guò)4000轉(zhuǎn)/分鐘的速度進(jìn)行瞬間的短離，使鎢粉或金粉沉淀；
5.棄上清，用70%乙醇清洗鎢粉或者金粉2次。最終加入8μ1無(wú)水乙醇待用；
6.將鎢粉或者金粉均勻涂在基因槍大載體(B1-Rad)中間位置，利用PDS-1000/HeB1listic Particle Delivery System(B1-Rad)以IlOOpsi壓力的條件對(duì)洋蔥進(jìn)行真空轟擊；
7.將轉(zhuǎn)化過(guò)后的洋蔥細(xì)胞繼續(xù)置于25°C暗培養(yǎng)至少8個(gè)小時(shí)或者培養(yǎng)過(guò)夜，用于顯微鏡觀察。
[0060]結(jié)果:將融合有CFP的ZmMADS47全長(zhǎng)以及分段通過(guò)基因槍瞬時(shí)轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞后，利用共聚焦顯微鏡對(duì)ZmMADS47進(jìn)行觀察。從圖14中可以看到，相比于負(fù)對(duì)照CFP空載，ZmMADS47具有顯著的核定位能力。
[0061 ]實(shí)施例九:凝膠阻滯，具體步驟為:
1.選取zIA醇溶蛋白啟動(dòng)子上游400bp的序列，將其按照每50bp依次拆分成8個(gè)片段，合成生物素標(biāo)記的探針；
2.在0.5ml離心管中按順序?qū)⑾铝薪M份混勻:
純化后的蛋白:Iyl
探針:Iyl Poly dIdC:0.5yl 10XBuffer:2yl 超純水:15.5μ1
室溫孵育20分鐘后加入上樣緩沖液； 3.在非變性條件下10V電泳40分鐘后轉(zhuǎn)膜；
4.紫外交聯(lián)，并且加入5ml稀釋后的BlockingBuffer，50°C封閉15分鐘；
5.在BlockingBuffer中加入，繼續(xù)50°C孵育15分鐘；
6.加入5ml洗滌緩沖液洗滌5遍，每遍5分鐘；
7.加入5ml平衡緩沖液，室溫平衡5分鐘；
8.加入事先配置好的顯色液，進(jìn)行顯影。
[0062]結(jié)果:從圖15中可以看出，ZmMADS47可以特異結(jié)合ZlA醇溶蛋白啟動(dòng)子2號(hào)與3號(hào)片段。對(duì)圖15中2號(hào)與3號(hào)片段進(jìn)行進(jìn)一步的拆分后，可以看到ZmMADS47可以結(jié)合其中2-1和3-1片段中的CATGT結(jié)構(gòu)域(圖16)。為了對(duì)ZmMADS47結(jié)合CATGT結(jié)構(gòu)域進(jìn)行進(jìn)一步的確認(rèn)，分別將ACTGT及其周邊序列進(jìn)行兩兩突變以及冷探針競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)(圖17，18)。結(jié)果表明，ZmMADS47的確可以結(jié)合CATGT結(jié)構(gòu)域。
[0063]實(shí)施例十:雙熒光酶活測(cè)試，具體步驟為:
1.用液氮研磨基因槍轉(zhuǎn)化后的洋蔥表皮細(xì)胞；
2.加入300μ1稀釋后的Passive Lysis Buffer；
3.12,OOOrpm 4°C離心10分鐘，取上清;
4.取20μ1上清至酶標(biāo)板中，另外加入事先配置好的LARII(將LuciferaseAssaySubstrate重懸于1ml Luciferase Assay Buffer II中)；
5.立即放入酶標(biāo)儀中進(jìn)行Luciferase酶活的測(cè)試；
6.加入ΙΟΟμΙ事先配置好的IX Stop&Glo試劑(將I體積50 X Stop&Glo ? Substrate加入49體積的Stop &Glo Buffer中)；
7.立即放入酶標(biāo)儀中進(jìn)行海腎熒光素酶酶活的測(cè)試。
[0064]結(jié)果:從圖19中可以看到，ZmMADS47可以在和02互作后，與02 —同進(jìn)一步促進(jìn)19kD，22kD以及50kD醇溶蛋白啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活。為了進(jìn)一步探究02與ZmMADS47對(duì)醇溶蛋白調(diào)控的機(jī)制，我們分別對(duì)ZmMADS47，02以及醇溶蛋白啟動(dòng)子進(jìn)行突變改造。圖20中，我們?nèi)笔Я?02的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，將其與ZmMADS47以及z IA啟動(dòng)子一同轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ZmMADS47和缺失了轉(zhuǎn)錄激活能力的02互作后，依然能夠激活z IA的表達(dá)，證明是02和ZmMADS47互作后釋放了其轉(zhuǎn)錄激活能力，激活下游基因表達(dá)。圖21中，我們對(duì)50kD醇溶蛋白啟動(dòng)子進(jìn)行缺失，使其只能結(jié)合ZmMADS47，而失去結(jié)合02的能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，02即使不能結(jié)合50kD醇溶蛋白啟動(dòng)子也依然能夠和ZmMADS47結(jié)合釋放其轉(zhuǎn)錄激活能力。
[0065]綜上所述，我們得出結(jié)論:02和ZmMADS47互作后可以釋放ZmMADS47的轉(zhuǎn)錄激活能力，從而影響下游基因表達(dá)。ZmMADS47和02互作比其中任意單個(gè)蛋白在調(diào)控玉米籽粒19kD醇溶蛋白，22kD醇溶蛋白以及50kD醇溶蛋白含量中都有更強(qiáng)的效應(yīng)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmMADS47基因，其特征在于所述基因?yàn)镾EQID NO:1所示的堿基序列。2.—種載體，其特征在于該載體含有根據(jù)權(quán)利要求1所述的玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmMADS47基因。3.—種質(zhì)粒，其特征在于該載體含有根據(jù)權(quán)利要求2所述的載體。4.一種酵母，其特征在于該酵母含有根據(jù)權(quán)利要求3所述的質(zhì)粒。5.—種克隆根據(jù)權(quán)利要求1所述的玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmMADS47基因的方法，其特征在于該方法的具體步驟為:首先獲得均一化的玉米籽粒cDNA片段，將該cDNA片段與雙雜載體pGADT7-Rec連接轉(zhuǎn)化，獲得了約1.0乂106個(gè)克隆，選取了包含621?結(jié)構(gòu)域以及核定位信號(hào)又屏蔽了其轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的02-2片段，將其連入pGBK-T7載體中，通過(guò)PEG/LiAc法將構(gòu)建的庫(kù)質(zhì)粒以及餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母AH109中，得到16個(gè)酵母轉(zhuǎn)化子，通過(guò)DDO與QDO的篩選，共獲得了 50個(gè)疑似陽(yáng)性克隆，對(duì)這些克隆質(zhì)粒抽提、測(cè)序分析以及回轉(zhuǎn)酵母，篩選出一個(gè)與水稻0sMADS47 同源的基因 ZmMADS47。6.—種根據(jù)權(quán)利要求所述的玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmMADS47基因與0paque2基因相互作用在RNAi轉(zhuǎn)基因沉默過(guò)程中的應(yīng)用。7.—種根據(jù)權(quán)利要求所述的玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmMADS47基因與0paque2基因相互作用在調(diào)控下游基因19kD醇溶蛋白，22kD醇溶蛋白以及50kD醇溶蛋白表達(dá)中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmMADS47基因及其應(yīng)用。該基因?yàn)镾EQ？ID？NO：1所示的堿基序列。該序列編碼的蛋白可與bZIP類轉(zhuǎn)錄因子Opaque2發(fā)生蛋白互作。利用RNA干擾技術(shù)將<i>ZmMADS47</i>基因片段轉(zhuǎn)化玉米幼胚，并獲得基因沉默的轉(zhuǎn)基因植株。相對(duì)野生型籽粒而言，RNAi轉(zhuǎn)基因玉米籽粒含有較小且不規(guī)則的蛋白體，以及α醇溶蛋白與50kD醇溶蛋白含量下降。
【IPC分類】C12N15/63, C12N15/10, C12N15/29, C12N1/19
【公開(kāi)號(hào)】CN105441459
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201511002504
【發(fā)明人】宋任濤, 喬禎逸, 王茜, 金穎, 祁巍巍, 梅冰, 唐遠(yuǎn)平
【申請(qǐng)人】上海大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年3月30日
【申請(qǐng)日】2015年12月29日