專利名稱：來(lái)源于人蒼白桿菌的epsp合酶基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬微生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種來(lái)源于人蒼白桿菌的EPSP合酶基 因及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
草甘膦是一種廣譜滅生性、內(nèi)吸傳導(dǎo)型優(yōu)秀除草劑，廣泛用于果園、膠園、非耕地、 免耕地中玉米、大豆、棉花播前或播后處理，以及出苗后定向處理。1974年在美國(guó)注冊(cè)登記 以來(lái)，至今已在世界100多個(gè)國(guó)家注冊(cè)，成為世界上使用面積最大的除草劑品種之一。但是 該除草劑同樣是一種非選擇性除草劑，對(duì)農(nóng)作物同樣有著殺死作用。為在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用 草甘膦，必須培育出具有草甘膦抗性或者降解性的農(nóng)作物。草甘膦(N-phosphonomethyl-glycine，glyphosate)毒性作用機(jī)理是競(jìng)爭(zhēng)性抑制 莽草酸途徑中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(簡(jiǎn)稱EPSP合成酶)的活性。EPSP合 成酶是植物和微生物體內(nèi)芳香族氨基酸(包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等)生物合成過(guò)程 中的一個(gè)關(guān)鍵酶，該酶由aroA基因編碼，目前使用的有潛在的生物安全性問(wèn)題。目前種植抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物的國(guó)家越來(lái)越多，面積也迅速增加，種植面積不斷 擴(kuò)大，占全球種植轉(zhuǎn)基因作物的78%以上。根據(jù)2002年資料表明，耐草甘膦大豆依舊是美 國(guó)、阿根廷、加拿大、墨西哥、羅馬尼亞、烏拉圭和南非等七國(guó)的主要商品化轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物。 耐草甘膦除草劑大豆在全球范圍內(nèi)種植3650萬(wàn)公頃，占全球總轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物種植面積的 62%。然而現(xiàn)在主要研究的抗草甘膦基因主要是I型的，因而發(fā)掘新型的II類的EPSP合 成酶基因?qū)⑹潜匾摹?br>
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種來(lái)源于人蒼白桿菌的EPSP合酶基因及 其應(yīng)用，并對(duì)該基因進(jìn)行功能驗(yàn)證，以證明它具有相對(duì)較高的草甘膦耐受性。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)一種來(lái)源于人蒼白桿菌的EPSP合酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，其 編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。所述來(lái)源于人蒼白桿菌的EPSP合酶基因長(zhǎng)3100bp，含1353個(gè)堿基，編碼的氨基酸 451 個(gè)。所述來(lái)源于人蒼白桿菌的EPSP合酶基因應(yīng)用于草甘膦耐受性中。所述來(lái)源于人蒼白桿菌的EPSP合酶基因采用人工方法合成，具體包括以下步驟1)抗草甘膦菌株的篩選采集草甘膦頻繁使用果園地里土壤中的樣品，用0. 9% (w/v)氯化鈉溶液混合，之 后將樣品涂布于含有60mM草甘膦的LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)Mh。將長(zhǎng)出來(lái)的菌株再次涂布 于含有200mM草甘膦LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)Mh，最后將僅有的一個(gè)生長(zhǎng)很好的菌株挑選出 來(lái)進(jìn)行進(jìn)一步研究。
2)菌株總DNA的提取及鑒定將分離獲得的細(xì)菌單株在IOml液體LB培養(yǎng)基(5g/L酵母提取物，5g/LNaCl, IOg/ L胰蛋白胨，磷酸緩沖液pH = 7. 5)中培養(yǎng)過(guò)夜(16小時(shí))，菌體培養(yǎng)液以60001 重力加速 度離心5min，得到菌體沉淀。這些沉淀在_20°C下冷凍lh。之后使用TE(10mM Tris-HCl, ImM EDTA, pH 8.0)溶液清洗一次。加入濃度為10mg/mL溶菌酶(Sigma-Aldrich)的無(wú)菌 水懸浮，在37°C下?lián)u床培養(yǎng)Ih。加入0. 5M EDTA, 10% (w/v) SDS和濃度為5M的NaCl輕輕 振蕩混勻。再加入濃度為20mg/mL蛋白激K(Takara日本)，反應(yīng)物在37°C下培養(yǎng)lh。用與 培養(yǎng)菌液液體體積相當(dāng)1倍體積的苯酚氯仿異戊醇05 24 1)提取DNA。水相用 與相當(dāng)水相體積1/2倍體積的氯仿異戊醇04 1)萃取。振蕩混勻后離心5min。水相 中加入與水相體積相當(dāng)(倍體積的異戊醇。振蕩混勻后離心15min。取沉淀，用70% (ν/ν) 酒精沖洗DNA，干燥，之后在TE緩沖液中重懸浮。所得總DNA儲(chǔ)存于4°C下備用。以 16SR(5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，)禾口16SF(5，-ACGGCTACCT TGTTACGACTTC-3，)為擴(kuò)增引物，以菌株的 DNA 為模板進(jìn)行 16S rDNA的PCR擴(kuò)增。隨后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠回收，克隆和測(cè)序。3)基因組文庫(kù)的構(gòu)建菌株DNA用Sau3A I酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠回收2-41ADNA片斷備用。此片斷經(jīng)過(guò)末 端去磷酸化連接到同樣去磷酸化的PACYC184質(zhì)粒載體。上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E. coli DH5 α 電擊感受態(tài)細(xì)胞，涂布與LB固體培養(yǎng)基，37°C下培養(yǎng)24h后進(jìn)行質(zhì)粒大抽。這樣就構(gòu)建成 了包含有目的基因的基因組文庫(kù)。4)篩選草甘膦抗性轉(zhuǎn)化子將大抽質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌ER2799 (NEB公司)分別涂布與含有50、100、150mM草甘 膦的LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h，發(fā)現(xiàn)有一個(gè)菌落能在含有150mM草甘膦的LB固體培養(yǎng)基上 生長(zhǎng)，對(duì)其進(jìn)行測(cè)序。5)草甘膦耐受試驗(yàn)及蛋白表達(dá)純化以 Pl (5，-gagagaggatccatgtcccattctgcatc-3，)和P2(5，-gagctctcatcgcgcgtcgctcagttcgat-3，)為弓丨物，以 ρAroA-O. anthropi 為 模板進(jìn)行EPSP合酶基因AroA-O. anthropi的PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)BamH I和Mc I酶切 后連接如同樣經(jīng)BamH I and Sac I酶切的pYPX251載體。將大腸桿菌ER2799，ER2799 (攜帶 p251-AroA_0. anthropi 質(zhì)粒)及 ER2799 (攜帶 p251-AroA-E. coli質(zhì)粒)接種到含0_150mM草甘膦的M9液體培養(yǎng)基上進(jìn)行耐受性試驗(yàn)。以 P5(5， -gagagaccatggatgtcccattctgcatc-3，)和P6(5，-gtctcgagtcatcgcgcgtcgctcagttcgat-3，)為弓丨物，以人工合成的 EPSP 基 因的陽(yáng)性克隆為模板進(jìn)行EPSP合酶基因的PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)Nco I和)(h0 I酶切后連 接入同樣經(jīng)Nco I和Bio I酶切的ρΕΤ48ει載體(Novagen公司)。然后將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸 桿菌 BL21(DE3) (Novagen 公司)，轉(zhuǎn)化子用 HisTrap HP kit (Amersham Biosciences)試劑 盒進(jìn)行蛋白表達(dá)純化，并進(jìn)行EPSP酶活測(cè)定和動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定。本發(fā)明的來(lái)源于人蒼白桿菌的EPSP合酶不僅具有較高的草甘膦抗性，而且還保 持著與PEP較強(qiáng)的親和性，這些特征將為用于轉(zhuǎn)基因作物的培育提供可能。


圖1為本發(fā)明的EPSP合酶的草甘膦耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中A代表在草甘膦濃度為OmM時(shí)大腸桿菌(Escherichia coli) ER2799 (攜帶 p251-AroA-O. anthropi 質(zhì)粒)、ER2799 (攜帶 p251-AroA_E. coli 質(zhì)粒)和大腸桿菌 ER2799 生長(zhǎng)情況；B代表在草甘膦濃度為50mM時(shí)大腸桿菌ER2799 (攜帶p251-AroA_0. anthropi質(zhì) 粒)、ER2799 (攜帶p251-AroA-E. coli質(zhì)粒)和大腸桿菌ER2799生長(zhǎng)情況；C代表在草甘膦濃度為IOOmM時(shí)大腸桿菌ER2799(攜帶p251-AroA-O. anthropi質(zhì) 粒)、ER2799 (攜帶p251-AroA-E. coli質(zhì)粒)和大腸桿菌ER2799生長(zhǎng)情況；D代表在草甘膦濃度為150mM時(shí)大腸桿菌ER2799(攜帶p251-AroA-0. anthropi質(zhì) 粒)、ER2799 (攜帶p251-AroA-E. coli質(zhì)粒)和大腸桿菌ER2799生長(zhǎng)情況。圖2為本發(fā)明的EPSP合酶與I型的來(lái)自于大腸桿菌的EPSP合酶和II型的來(lái)自 于農(nóng)桿菌CP4的EPSP合酶的氨基酸序列的比較。圖3為本發(fā)明的EPSP合酶與典型的I型和II型EPSP合酶的系統(tǒng)發(fā)育比較結(jié)果。圖4為本發(fā)明的EPSP合酶3D結(jié)構(gòu)及其與來(lái)自于農(nóng)桿菌CP4的EPSP合成酶的3D 結(jié)構(gòu)的比較。圖5為本發(fā)明的EPSP合酶的SDS-PAGE電泳圖，其中的1代表用HiS1TrapHP試劑 盒純化的來(lái)源于人蒼白桿菌的EPSP合酶蛋白；2代表在大腸桿菌BL21(DE!3)過(guò)量表達(dá)的來(lái) 源于人蒼白桿菌的EPSP合酶蛋白、3代表蛋白分子量MARKER。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案 而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理 解，可以對(duì)發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范 圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。本發(fā)明所用的試劑若未經(jīng)說(shuō)明，均購(gòu)自西格瑪-奧德里奇(Sigma-Aldrich)公司。本發(fā)明涉及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，如沒有特別注明，均參考自《分子克隆》一書(J.薩 姆布魯克、E. F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，1994，科學(xué)出版社。)實(shí)施例1高耐受草甘膦的DNA片斷克隆1、草甘膦頻繁使用水稻地里土壤樣品的采集從一年至少使用四次并且連續(xù)使用十年以上的果園的土壤中采集土壤樣品。2、抗草甘膦菌株的篩選稱取草甘膦頻繁使用果園土壤樣品lg，加入0.9% (w/v)氯化鈉溶液lml，5000轉(zhuǎn) /分震蕩混勻，3000轉(zhuǎn)/分輕離心，倒掉上清，再加入0. 9% (w/v)氯化鈉溶液1ml，5000轉(zhuǎn) /分震蕩混勻，冰上IOmin靜置，吸取150 μ 1溶液涂布與含有60mM草甘膦的LB固體培養(yǎng)基 中培養(yǎng)Mh。將長(zhǎng)出來(lái)的單菌落接種與加入1.6mlLB液體培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng)48h， 然后吸取150 μ 1的培養(yǎng)液再次涂布與含有200mM草甘膦的LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)Mh，最后 將僅有的一個(gè)生長(zhǎng)良好的菌落人蒼白桿菌(Ochrobactrum anthropi)選出來(lái)進(jìn)行進(jìn)一步研究。3、菌株總DNA的提取及鑒定將實(shí)施例2中分離獲得的細(xì)菌單株在IOml液體LB培養(yǎng)基(5g/L酵母提取物，5g/ L NaCl，10g/L胰蛋白胨，磷酸緩沖液pH= 7. 5)中培養(yǎng)16h，菌體培養(yǎng)液以6000轉(zhuǎn)/分速度 離心5min，得到菌體沉淀。這些沉淀在_20°C下冷凍lh。之后使用TE(10mM Tris_HCl，lmM EDTA，pH = 8. 0)溶液清洗一次。加入含有20 μ 1濃度為10mg/mL溶菌酶(Sigma-Aldrich) 的無(wú)菌水懸浮，在37°C下?lián)u床培養(yǎng)lh。加入50 μ L 0. 5Μ EDTA, 50 μ 1 10% (w/v) SDS和 50 μ 1濃度為5Μ的NaCl輕輕振蕩混勻。再加入10 μ 1濃度為20mg/mL蛋白激K (Takara日 本)，反應(yīng)物在37°C下培養(yǎng)lh。用與培養(yǎng)菌液液體體積相當(dāng)1倍體積的苯酚氯仿異戊 醇05 24 1)提取DNA。水相用與相當(dāng)水相體積1/2倍體積的氯仿異戊醇Q4 1) 萃取。振蕩混勻后離心5min。水相中加入與水相體積相當(dāng)1倍體積的異戊醇。振蕩混勻后 離心15min。取沉淀，用70% (ν/ν)酒精沖洗DNA，干燥，之后在TE緩沖液中重懸浮。所得 總DNA儲(chǔ)存于4°C下備用。以抽提的總DNA為模板，利用人蒼白桿菌的16sRNA特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增的 引物為 16SR(5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，)和 16SF(5，_ACGGCTACCT TGTTACGACTTC-3，)。 以KOD Plus (Toyobo日本)為TaqDNA聚合酶，擴(kuò)增條件依次為94 "C 30s, 55 "C 30s， 72°C 120s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后，加入2U的rtaq酶(大連寶生物工程公司)，72°C 延伸90s，擴(kuò)增片段長(zhǎng)1500bp。PCR結(jié)束后，(w/v)瓊脂糖凝膠回收，取10 μ 1直接與T/ A克隆載體相連(大連寶生物工程公司)，4°C連接過(guò)夜。再將該載體轉(zhuǎn)化入DH5 α感受態(tài) 中。利用ABI Prism Big Dye的ΑΒΙ3700毛細(xì)管自動(dòng)化測(cè)序儀測(cè)序，測(cè)得的序列通過(guò)Blast 程序與GenBank中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比分析，得到菌株與人蒼白桿菌中的16s rRNA有99 %的 同源性，從而證實(shí)分離菌株為人蒼白桿菌。4、人蒼白桿菌基因組文庫(kù)的構(gòu)建人蒼白桿菌DNA用Sau3A I酶切在10 μ 1反應(yīng)體系進(jìn)行部分酶切試驗(yàn)，Sau3A I 酶按 1 100 稀釋，37 °C 分別酶切 lOmin，20min, 30min, 40min, 50min, 60min 后加入 10X loading buffer 1 μ 1終止反應(yīng)，電泳檢測(cè)最適酶切反應(yīng)時(shí)間。而后選擇相同的體系 酶切30min進(jìn)行大量酶切。經(jīng)0. 7% (w/v)瓊脂糖凝膠電泳后，切下長(zhǎng)度為2-41Λ的DNA 片段，用凝膠試劑盒(上海生物工程公司)回收。質(zhì)粒載體pACYC184(NEB公司)用BamHI 完全酶切后SAP堿性磷酸酯酶進(jìn)行末端去磷酸化，以減少載體自連。上述回收后的菌株 DNA(200ng)和末端去磷酸化的質(zhì)粒載體pACYC184 (150ng)用2U的T41igase在4°C下連接 16h。連接產(chǎn)物用正丁醇沉淀后，用70% (ν/ν)的乙醇離心洗滌，最后用10 μ 1的超純水 溶解，將連接物進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，電擊參數(shù)為電脈沖為2. 5 μ F， 電壓2. 5kV，電阻200 Ω，電擊時(shí)間為4. 5. S。復(fù)蘇后，將菌液涂布于LB (含有50 μ g/mL氨芐 青霉素)平板上，37°C培養(yǎng)12-1他。而后用質(zhì)粒大量提取試劑盒(美國(guó)Omega公司)進(jìn)行 質(zhì)粒提取。這樣就構(gòu)建成了包含有目的基因的基因組文庫(kù)。5、篩選草甘膦抗性轉(zhuǎn)化子將大量提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌ER2799 (NEB公司)涂布與含有50mM草甘膦的M9 平板上培養(yǎng)48h，發(fā)現(xiàn)有三個(gè)菌落生長(zhǎng)良好。將這三個(gè)菌落分別接種到含有100mM、150mM草甘膦的M9平板上培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)只有1個(gè)克隆能在含150mM草甘膦的M9平板上生長(zhǎng)，其所含 的質(zhì)粒命名為pAroA-0. anthropi,即本發(fā)明的EPSP合酶。從該克隆抽提的質(zhì)粒pAroA-0. anthropi再次轉(zhuǎn)入大腸桿菌ER2799(NEB公司)中，將轉(zhuǎn)化子用無(wú)菌牙簽點(diǎn)與含150mM草甘 膦的M9固體培養(yǎng)基上檢驗(yàn)抗性，結(jié)果證明這個(gè)克隆所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子均具有抗草甘膦特性， 表明抗草甘膦特性確實(shí)是由于轉(zhuǎn)入本發(fā)明的pAroA-0. anthropi EPSP合酶引起的。6、草甘膦耐受實(shí)驗(yàn)以 Pl (5，-gagagaggatccatgtcccattctgcatc-3，)和P2(5，-gagctctcatcgcgcgtcgctcagttcgat-3，)為弓丨物，以 pAroA-0. anthropi 為 模板進(jìn)行EPSP合酶基因AroA-O. anthropi的PCR擴(kuò)增。以KOD Plus (Toyobo日本)為Taq DNA聚合酶，擴(kuò)增條件依次為94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 90s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后， 加入2U的rtaq酶(大連寶生物工程公司)，72°C延伸90s，擴(kuò)增片段長(zhǎng)1353bp (如下)。選 擇pG251 (CN1338515NCBI)作為表達(dá)載體，用限制性核酸內(nèi)切酶BamH I (大連寶生物工程公 司)酶切并進(jìn)行膠回收。對(duì)酶切的載體質(zhì)粒進(jìn)行去磷酸化操作，以降低質(zhì)粒自連，并對(duì)堿 性磷酸酶進(jìn)行失活操作后Sambrook分子克隆手冊(cè)1989，再與外源的DNA片段(即長(zhǎng)度 為1353bp的EPSP合酶基因AroA-0. anthropi)連接。連接前，將回收的部分酶解的細(xì)菌基 因組DNA片段與pG251載體DNA，用瓊脂糖凝膠電泳的方法估計(jì)濃度，確保連接反應(yīng)中外源 DNA的濃度至少是載體濃度3-5倍。反應(yīng)溫度16°C，連接時(shí)間為10-1池。再將該載體轉(zhuǎn)化 入DH5a感受態(tài)中。利用ABI Prism Big Dye的ABI3700毛細(xì)管自動(dòng)化測(cè)序儀測(cè)序，確定 重組質(zhì)粒即(p251-AroA-0. anthropi)的正確性。采用同樣的方法用以下引物P3 (5，-CGGGATCCGTTAATGCCGAAATTTTGCTTAATC-3，)禾口P4 (5，-CGGAGCTCAGGTCC GAAAAAAAACGCCGAC-3，)擴(kuò)增大腸桿菌的EPSP合酶基因AroA-E. coli,同樣連接到pG251得到 p251-AroA-E. coli 重組質(zhì)粒。將大腸桿菌ER2799(攜帶 p251-AroA_0. anthropi 質(zhì)粒)和 ER2799 (攜帶 p251-AroA-E. coli質(zhì)粒)接種到含0_150mM草甘膦的M9液體培養(yǎng)基中，經(jīng)過(guò)37°C、3Mi的 搖床培養(yǎng)后，測(cè)定培養(yǎng)物的0D660進(jìn)行耐受性試驗(yàn)，同時(shí)以無(wú)插入片斷的質(zhì)粒的大腸桿菌 ER2799為陰性對(duì)照。結(jié)果將大腸桿菌ER2799(攜帶p251-AroA_0. anthropi質(zhì)粒)和ER2799(攜帶 p251-AroA-E. coli質(zhì)粒)接種到含0_150mM草甘膦的M9液體培養(yǎng)基中，經(jīng)過(guò)37°C、3他的搖 床培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)陰性對(duì)照在M9中幾乎不能生長(zhǎng)；而ER2799 (攜帶p251-AroA_E. coli質(zhì)粒) 在50mM草甘膦的M9液體培養(yǎng)基中嚴(yán)重受到抑制；而ER2799 (攜帶p251-AroA-O. anthropi 質(zhì)粒)在含有150mM草甘膦的M9液體培養(yǎng)基中還能生長(zhǎng)(參見圖1)。實(shí)施例2高耐受草甘膦的DNA片斷的序列分析及EPSP合酶功能驗(yàn)證1、高耐受草甘膦的DNA片斷的序列分析利用逐步序列測(cè)定方法對(duì)實(shí)施例1中所篩選獲得的高耐受草甘膦質(zhì)粒pAroA-0. anthropi，即本發(fā)明的EPSP合酶基因全序列進(jìn)行DNA測(cè)序。分析結(jié)果表明插入的片斷大 小為3100bp，其中包含了一個(gè)1353的閱讀框，其序列如SEQID NO 1所示，它包含的多核苷酸序列全長(zhǎng)為1353個(gè)堿基，編碼的氨基酸451個(gè)，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。氨基酸序列同源性分析結(jié)果表明AroA-0. anthropi氨基酸序列與II型的來(lái)自 于農(nóng)桿菌CP4的EPSP合酶有82. 89%的同源性(參見圖2)，而與I型的來(lái)自于大腸桿菌 的EPSP合酶的同源性不足30%，說(shuō)明AroA-O. anthropi EPSP合酶屬于II的EPSP合酶。 AroA-O. anthropi EPSP合酶與典型的I型和II型EPSP合酶的系統(tǒng)發(fā)育比較結(jié)果參見圖 3。用在線軟件Swiss-model對(duì)AroA-O. anthropi EPSP合酶進(jìn)行3D結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(參 見圖4)，結(jié)果表明其3D結(jié)構(gòu)與來(lái)自于農(nóng)桿菌CP4的EPSP合酶的3D結(jié)構(gòu)非常相似。但是 它們之間有一個(gè)區(qū)域存在著非常明顯的氨基酸差異，這個(gè)區(qū)域位于高度保守的Glu-3M和 Arg-357附近。Glu-3M和Arg-357是一個(gè)由12個(gè)氨基酸0347-358)組成的一個(gè)環(huán)的一部 分，這個(gè)環(huán)不但影響著PEP或者glyphosate結(jié)合，而且影響著這個(gè)球狀結(jié)構(gòu)從“開放”到“關(guān) 閉”狀態(tài)。實(shí)施例3高耐受草甘膦的EPSP合酶基因的人工合成以基因合成方法Nucleic Acids Research，2004，32，e98將上述高耐受草甘膦 的EPSP合酶基因克隆。設(shè)計(jì)的引物如下1. AroA-I :Tm = 54，60merATG，TCC，CAT, TCT，GCA，TCC，CCG，AAA, CCA，GCA，ACC，GCC，CGC，CGG，TCG，GAG， GCA，CTT，ACG，GGC2. AroA-2 :Tm = 54，60merACG，ATG，CGA，GAT，GGA，TTT，GTC，ACC，CGG，AAT，GCG，AAT，TTC，GCC，CGT，AAG， TGC, CTC, CGA, GCG3. AroA-3 :Tm = 54，60merGAC, AAA, TCC, ATC, TCG, CAT, CGT, TCC, TTC, ATG, TTC, GGC, GGC, CTT, GCA, TCG, GGT，GAA，ACC，CGC4. AroA-4 : Tm = 54，60merGGT，ATT，GAT，GAC，GTC，TTC，GCC，TTC，CAG，AAG，GCC，GGT，GAT，GCG，GGT，TTC， ACC，CGA，TGC，AAG5. AroA-5 :Tm = 54，60merGGC, GAA, GAC, GTC, ATC, AAT, ACC, GGT, CGC, GCC, ATG, CAG, GCC, ATG, GGC, GCG, AAA, ATC，CGC，AAG6. AroA-6 :Tm = 54，60merGCC，GTT，GCC，GAC，GCC，ATT，GAT，GAT，CCA，GGC，ATC，GCC，ATC，CTT，GCG，GAT， TTT，CGC，GCC，CAT7. AroA-7 :Tm = 54，60merATC，AAT，GGC，GTC，GGC，AAC，GGC，TGC，CTG，TTG，CAG，CCC，GAA，GCA，GCG，CTC， GAC，TTC，GGC，AAT8. AroA-8 :Tm = 54，60merGCC，GAC，AAG，GCC，CAT, GGT，GAG, GCG，CGC，ACC，GGT，TCC，GGC，ATT，GCC，GAA，
8GTC, GAG, CGC, TGC9. AroA-9 :Tm = 54，60merCTC，ACC，ATG，GGC，CTT，GTC，GGC，ACC，TAT，GAC，ATG，AGA，ACC，TCC，TTT，ATC， GGC, GAT, GCC, TCG10. AroA-IO :Tm = 54，60merCAA，CGG，GTT，CAG，CAC，GCG，ACC，CAT, CGG，GCG，CTT，GGA，AAG，CGA，GGC，ATC， GCC，GAT，AAA, GGA11. AroA-11 : Tm = 54，60merGGT，CGC，GTG，CTG，AAC，CCG，TTG，CGT，GAA，ATG，GGC，GTT，CAG，GTG，GAA，GCA， GCC, GAA, GGC, GAC12. AroA-12 :Tm = 54，60merATT，GGC，CGT，CTT，GGG，GCC，GAT，CAG，CGT，CAG，CGG，CAT, GCG，GTC，GCC，TTC， GGC, TGC, TTC, CAC13. AroA-13 :Tm = 54，60merATC, GGC, CCC, AAG, ACG, GCC, AAT, CCG, ATC, ACC, TAT, CGC, GTG, CCG, ATG, GCA, TCC，GCA，CAG，GTC14. AroA-14 :Tm = 54，60merGCC，CGG，CGT，GTT，GAG, ACC，GGC，GAG, CAG，CAC，GGC，GGA，TTT，GAC，CTG，TG C, GGA, TGC, CAT, CGG15. AroA-15 :Tm = 54,60merGCC, GGT, CTC, AAC, ACG, CCG, GGC, GTT, ACC, ACC, GTC, ATC, GAG, CCG, GTC, ATG, ACC，CGC，GAC，CAC16. AroA-16 :Tm = 54,60merCGA，AAG，ATC，GGC，GCC，AAA, GCC，CTG，CAG，CAT, CTT，TTC，GGT，GTG，GTC，GCG， GGT，CAT, GAC，CGG17. AroA-17 :Tm = 54,60merGGC，TTT，GGC，GCC，GAT，CTT，TCG，GTT，GAA，ACC，GAC，AAG，GAC，GGC，GTG，CGC， CAT, ATC，CGC，ATC18. AroA-18 :Tm = 54,60merTAC，GTC，GAT，GGT，CTG，GCC，GAT，AAG，CTT，GCC，CTG，TCC，GGT，GAT，GCG，GAT， ATG，GCG，CAC，GCC19. AroA-19 :Tm = 54,60merATC，GGC，CAG，ACC，ATC，GAC，GTA，CCG，GGT，GAT，CCA，TCG，TCA，ACG，GCT，TTC， CCG，CTC，GTT，GCC20. AroA-20 :Tm = 54,60merGTT, GCG, GAT, GGT, AAC, ATC, CGA, ACC, TTC, GAC, CAG, AAG, GGC, GGC, AAC, GAG, CGG，GAA，AGC，CGT21. AroA-21 : Tm = 54，60merTCG，GAT，GTT，ACC，ATC，CGC，AAC，GTG，CTG，ATG，AAC，CCG，ACC，CGT，ACC，GGC，CTG, ATC, CTG, ACG22. AroA-22 :Tm = 54,60merGGC, ATT, GAG, CAC, TTC, GAT, ATC, GGC, GCC, CAT, TTC, CTG, CAA, CGT, CAG, GAT, CAG，GCC，GGT，ACG23. AroA-23 :Tm = 54，60merGAT, ATC, GAA, GTG, CTC, AAT, GCC, CGT, CTT, GCC, GGC, GGC, GAG, GAT, GTC, GCC, GAT, CTG, CGC, GTG24. AroA-24 : Tm = 54，60merTTC, CGG, CGG, AAC, GAC, AAC, GCC, CTT, CAG, CTT, CGA, GGC, CTT, CAC, GCG, CAG, ATC，GGC，GAC，ATC25. AroA-25 :Tm = 54，60merGGC, GTT, GTC, GTT, CCG, CCG, GAA, CGC, GCT, CCG, TCG, ATG, ATC, GAT, GAA, TAT, CCG，GTT，CTG，GCC26. AroA-26 :Tm = 54，60merGTC, CAT, CAC, GGT, TTC, GCC, TTC, CGC, GAA, GGA, CGC, GGC, GAT, GGC, CAG, AAC， CGG，ATA，TTC，ATC27. AroA-27 :Tm = 54，60merGAA，GGC，GAA，ACC，GTG，ATG，GAC，GGT，CTC，GAC，GAA，CTG，CGC，GTC，AAG，GAA， TCG, GAT, CGT, CTG28. AroA-28 :Tm = 54，60merATC，GAC，GCC，ATT，GGC，TTC，AAG，GCC，GCG，TGC，AAC，CGC，TGC，CAG，ACG，ATC， CGA，TTC，CTT，GAC29. AroA-29 :Tm = 54，60merCTT，GAA，GCC，AAT，GGC，GTC，GAT，TGC，ACC，GAA，GGC，GAG, ATG，TCG，CTG，ACG， GTC, CGT, GGT, CGC30. AroA-30 :Tm = 54，60merGGT, TGC, GAC, TGT, GCC, ACC, GCC, CAG, TCC, CTT, GCC, GTC, GGG, GCG, ACC, ACG, GAC，CGT，CAG，CGA31. AroA-31 : Tm = 54，60merGGC，GGT，GGC，ACA，GTC，GCA，ACC，CAT, CTC，GAT，CAC，CGC，ATC，GCG，ATG，AGC， TTC，CTC，GTC，ATG32. AroA-32 :Tm = 54，60merGCT, GTC, GTC, AAC, CGT, CAC, CGG, CTT, TTC, CGA, TGC, AAG, GCC, CAT, GAC, GAG, GAA, GCT, CAT, CGC33. AroA-33 :Tm = 54，60merCCG，GTG，ACG，GTT，GAC，GAC，AGC，ACC，ATG，ATC，GCC，ACG，TCC，TTC，CCC，GAA， TTC，ATG，GAC，ATG34. AroA-34 : Tm = 54，34merTCA，GTC，CCG，GCA，TCA，TGT，CCA，TGA，ATT，CGG，GGA，A
利用PCR進(jìn)行EPSP合酶基因擴(kuò)增，在100 μ 1反應(yīng)體系中，AroA-2-AroA_33共32 個(gè)引物的添加量為2ng，外側(cè)引物AroA-I和AroA_34添加量為30ng，擴(kuò)增條件為94°C預(yù)熱 Imin ;94°C，30s，50°C，30s，72°C，2min，使用的 Taq DNA 聚合酶為 KOD FX taq 酶 CToyobo 公 司，日本)，共25個(gè)循環(huán)。 PCR結(jié)束后，1 %瓊脂糖膠回收，取10 μ 1直接與Τ/Α克隆載體相連(大連寶生物公 司)。4°C連接過(guò)夜，高效轉(zhuǎn)化DH5ci感受態(tài)中。獲得陽(yáng)性克隆。實(shí)施例4高耐受草甘膦的EPSP表達(dá)上述人工合成的EPSP基因的陽(yáng)性克隆用引物P5 (5，-gagagaccatggatgtcccatt ctgcatc-3，)禾口 P6(5，-gtctcgagtcatcgcgcgtcgctcagttcgat-3，)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，以 KOD Plus (Toyobo日本)為Taq DNA聚合酶，擴(kuò)增條件依次為:94°C 30s，55°C 30s，72°C 90s，擴(kuò)增 30個(gè)循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后，加入2U的rtaq酶(大連寶生物工程公司)，72°C延伸90s，擴(kuò)增片 段長(zhǎng)1353bp。PCR產(chǎn)物用Nco I and Xho I酶切后，連入相同酶切的載體pET48a(NEB公 司)得到重組質(zhì)粒pET-AroA-0. anthropi并將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3) (Novagen公司)， 將轉(zhuǎn)化子涂布在LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h。用凝膠-蛋白純化試劑盒Hi sTrap HP (Amersham Biosciences公司)對(duì)其進(jìn)行蛋白表達(dá)純化，SDS-PAGE電泳檢測(cè)。經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)， 蛋白大小約48kDa，與預(yù)測(cè)值相符(參見圖5)。實(shí)施例5EPSP酶活測(cè)定和動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定1.測(cè)定方法無(wú)機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)曲線IOmM無(wú)機(jī)磷按1 10稀釋，分別取O、1、2、3……20μ1與1.5ml Eppendorf離心管中，加入純水至100 μ 1混勻，加入MAT溶液0. 8ml混勻，計(jì)時(shí)三分鐘后加 入SC溶液100 μ 1迅速混勻，室溫靜置20min后測(cè)定0D660值。重復(fù)三次。以無(wú)機(jī)磷濃度 為橫坐標(biāo)，0D660值為總縱坐標(biāo)作圖得到無(wú)機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)曲線。1)酶活測(cè)定蛋白定量采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法(Bradford，1976)。在冰上 與1.5ml Eppendorf離心管中加入以下溶液IOmM PEP溶液2 μ 1，10mMS3P溶液2 μ 1，0. 5M HEPES 溶液 2 μ 1，ImM(NH4)6MO7O24 · 4Η20 溶液 2 μ 1 和雙蒸水 12 μ 1 混勻，與 28°C溫浴 5min 后各管樣品間隔2s加入5μ 1純化蛋白并計(jì)時(shí)，2min后再間隔2s依次加入200 μ 1 MAT溶 液，顯色:3min后再間隔2s依次加入20 μ 1 34% SC溶液迅速混勻，室溫顯色20min后測(cè)定 0D660值。對(duì)照除不加純化蛋白外，其余同樣品管。樣品管與對(duì)照管的0D660值相減后，對(duì) 照無(wú)機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)曲線即可求得反應(yīng)釋放出的無(wú)機(jī)磷摩爾量，再除以反應(yīng)時(shí)間和酶蛋白量就得 到酶的酶活力(nkat/mg)。2)半抑制量(IC50)測(cè)定上述反應(yīng)液中添加OUOAlO^lO^lUOUOOjOOmM草 甘膦，所得酶比活力數(shù)據(jù)以草甘膦濃度為X軸，采用對(duì)數(shù)坐標(biāo)，以反應(yīng)速度(nkat/mg)為Y 軸作圖。3) Km (PEP)測(cè)定將S3P溶液濃度恒定于ImM，在不同PEP濃度(0. 05、 0. 067,0. 1,0. 2,0. 5,1. OmM)下按上述反應(yīng)體系測(cè)定酶反應(yīng)速度，所測(cè)數(shù)值按V_v/[S] (Eadic-Hofstee)法作圖。4) K^glyphosate)測(cè)定在不同草甘膦濃度(O、10、50、100 μ M)下測(cè)定PEP濃度為0. 05,0. 067,0. 1,0. 2,0. 5,1. OmM時(shí)EPSP的酶反應(yīng)速度。采取雙倒數(shù)作圖，得到1/V_1/[S] 直線，再將各直線的斜率作為縱坐標(biāo)，草甘膦的濃度作為橫坐標(biāo)得到一條新的直線，該直線 與X軸的交點(diǎn)即為Kjglyphosate)值。2.測(cè)定結(jié)果本發(fā)明的EPSP合酶活性為84. 52士0. 12nkat/mg，其動(dòng)力學(xué)參數(shù)如下表1所示。表1本發(fā)明的EPSP合酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)
—~ 動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定值
IC50 (glyphosate； mM) 0.8638 ±0.007^(PEP； mM)_0.43±0.11
K1 (glyphosate； μΜ)_121.34±8.8
K/Km_0,307 ±0.099根據(jù)該動(dòng)力學(xué)參數(shù)可知本發(fā)明的EPSP合酶不僅具有較高的草甘膦抗性，而且還 保持著與PEP較強(qiáng)的親和性，這些特性為將本發(fā)明的EPSP合酶用于轉(zhuǎn)基因作物的培育提供 了可能。附本申請(qǐng)中所涉及到的核苷酸/氨基酸序列表<110>上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院<120>來(lái)源于人蒼白桿菌的EPSP合酶基因及其應(yīng)用<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>SEQ ID No 1<211>1353<212>DNA<213> 人蒼白桿菌(Ochrobactrum anthropi)<400>ATGTCCCATTCTGCATCCCCGAAACCAGCAACCGCCCGCCGCTCGGAGGCACTTACGGGC60
GAAATTCGCATTCCGGGTGACAAATCCATCTCGCATCGTTCCTTCATGTTCGGCGGCCTT120
GCATCGGGTGAAACCCGCATCACCGGCCTTCTGGAAGGCGAAGACGTCATCAATACCGGT180
CGCGCCATGCAGGCCATGGGCGCGAAAATCCGCAAGGATGGCGATGCCTGGATCATCAAT240
GGCGTCGGCAACGGCTGCCTGTTGCAGCCCGAAGCAGCGCTCGACTTCGGCAATGCCGGA300
ACCGGTGCGCGCCTCACCATGGGCCTTGTCGGCACCTATGACATGAGAACCTCCTTTATC360
GGCGATGCCTCGCTTTCCAAGCGCCCGATGGGTCGCGTGCTGAACCCGTTGCGTGAAATG420
GGCGTTCAGGTGGAAGCAGCCGAAGGCGACCGCATGCCGCTGACGCTGATCGGCCCCAAG480
ACGGCCAATCCGATCACCTATCGCGTGCCGATGGCATCCGCACAGGTCAAATCCGCCGTG540
CTGCTCGCCGGTCTCAACACGCCGGGCGTTACCACCGTCATCGAGCCGGTCATGACCCGC600
GACCACACCGAAAAGATGCTGCAGGGCTTTGGCGCCGATCTTTCG GTTGAAACCGACAAG660
GACGGCGTGCGCCATATCCGCATCACCGGACAGGGCAAGCTTATC GGCCAGACCATCGAC720
GTACCGGGTGATCCATCGTCAACGGCTTTCCCGCTCGTTGCCGCC CTTCTGGTCGAAGGT780
TCGGATGTTACCATCCGCAACGTGCTGATGAACCCGACCCGTACC GGCCTGATCCTGACG840
TTGCA GGAAA TGGGCGCCGATATCG AAGTG CTCAA TGCCC GTCTT GCCGG CGGCG AGGAT 900
GTCGC CGATC TGCGCGTGAAGGCCT CGAAGCTGAAGGGCG TTGTC GTTCC GCCGG AACGC960
GCTCC GTOGA TGATCGATGAATATC CGGTTCTGGCCATCG CCGCG TCCTT’ CGCGG AAGGC1020
GAAAC CGTGA TGGACGGTCTCGACG AACTGOGCGTCAAGG AATCG GATOG TCTGG CAGCG1080
GTTGC ACGCG GCCTTGAAGCCAATG GCGTCGATTGCACCG AAGGC GAGAT GTCGC TGACG1140
GTCCG TGGTC GCCCCGACGGCAAGG GACTGGGCGGTGGCA CAGTC GCAAC CCATC TCGAT1200
CACCG CATCG CGATGAGCTTCCTCG TCATGGGCCTTGCAT CGGAA AAGCC GGTGA CGGTT1260
GACGA CAGCA CCATGATCGCCACGT CCTTCCCCGA ATTCA TGGAC ATGAT GCCGG GACTG1320
GGCGC CAAGA TCGAACTGAGCGACG CGCGATGA1353
<210>SEQID No 2
<211>451
<212>PRT
<213>人蒼白桿菌(Ochrobactrumanthropi)
<400>
1METSerHisSerAlaSerProLysProAlaThrAlaArgArgSerGluAla LeuThrGly
21GlulieArglieProGlyAspLysSerlieSerHisArgSerPheMETPhe GlyGlyLeu
41AlaSerGlyGluThrArglieThrGlyLeuLeuGluGlyGluAspVallie AsnThrGly
61ArgAlaMETGlnAlaMETGlyAlaLyslieArgLysAspGlyAspAlaTrp lielieAsn
81GlyValGlyAsnGlyCysLeuLeuGlnProGluAlaAlaLeuAspPheGly AsnAlaGly
101ThrGlyAlaArgLeuThrMETGlyLeuValGlyThrTyrAspMETArgThr SerPhelie
121GlyAspAlaSerLeuSerLysArgProMETGlyArgValLeuAsnProLeu ArgGluMET
141GlyValGlnValGluAlaAlaGluGlyAspArgMETProLeuThrLeulie GlyProLys
161ThrAlaAsnProlieThrTyrArgValProMETAlaSerAlaGlnValLys SerAlaVal
181LeuLeuAlaGlyLeuAsnThrProGlyValThrThrVallieGluProVal METThrArg
201AspHisThrGluLysMETLeuGlnGlyPheGlyAlaAspLeuSerValGlu ThrAspLys
221AspGlyValArgHislieArglieThrGlyGlnGlyLysLeulieGlyGln ThrlieAsp
241ValProGlyAspProSerSerThrAlaPheProLeuValAlaAlaLeuLeu ValGluGly
261SerAspValThrlieArgAsnValLeuMETAsnProThrArgThrGlyLeu lieLeuThr
281LeuGlnGluMETGlyAlaAsplieGluValLeuAsnAlaArgLeuAlaGly GlyGluAsp
301ValAlaAspLeuArgValLysAlaSerLysLeuLysGlyValValValPro ProGluArg
321AlaProSerMETlieAspGluTyrProValLeuAlalieAlaAlaSerPhe AlaGluGly
341GluThrValMETAspGlyLeuAspGluLeu ArgValLysGluSerAspArg LeuAlaAla
361ValAlaArgGlyLeuGluAlaAsnGlyValAspCysThrGluGlyGluMET SerLeuThr
381ValArgGlyArgProAspGlyLysGlyLeuGlyGlyGlyThrValAlaThr HisLeuAsp
401HisArglieAlaMETSerPheLeuValMETGlyLeuAlaSerGluLysPro ValThrVal
421AspAspSerThrMETlieAlaThrSerPheProGluPheMETAspMETMET ProGlyLeu
441Gly AlaLyslieGluLeuSer Asp Ala Arg -
權(quán)利要求
1.一種來(lái)源于人蒼白桿菌的EPSP合酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的來(lái)源于人蒼白桿菌的EPSP合酶基因，其特征在于，其編碼的 蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的來(lái)源于人蒼白桿菌的EPSP合酶基因采用人工方法制備 而成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的來(lái)源于人蒼白桿菌的EPSP合酶基因在草甘膦耐受性中 的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種來(lái)源于人蒼白桿菌的EPSP合酶基因及其應(yīng)用，所述EPSP合酶基因含1353個(gè)堿基，編碼的氨基酸451個(gè)；所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO 1所示，其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。本發(fā)明的來(lái)源于人蒼白桿菌的EPSP合酶基因采用人工方法合成，與已報(bào)道的來(lái)源于農(nóng)桿菌CP4的EPSP合酶基因具有很高的同源性，且具有較高的草甘膦耐受性，可用于轉(zhuǎn)基因作物的培育中。
文檔編號(hào)C12R1/01GK102108363SQ20091020067
公開日2011年6月29日 申請(qǐng)日期2009年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月24日
發(fā)明者付曉燕, 姚泉洪, 彭日荷, 朱波, 熊愛生, 田永生, 趙偉, 金曉芬, 高峰 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院