一種攜帶gfp的甜瓜壞死斑點病毒侵染性克隆載體的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種攜帶GFP的甜瓜壞死斑點病毒侵染 性克隆載體及其構建方法。
【背景技術】
[0002] 病毒的侵染性CDNA克隆是指RNA病毒具有侵染性的CDNA或CDNA具有侵染性的體外 轉錄物，接種寄主植物后表現與野生毒源一致的癥狀。cDNA侵染性克隆的建立克服了RNA病 毒難以遺傳操作的瓶頸，使在DNA水平上應用基因重組等相關技術開展分子生物學研究得 以實現。如:對病毒侵染性克隆利用定點突變技術研究病毒基因組及其基因功能;對其改造 為基因沉默載體開展植物功能基因組學的研究;將報告基因插入病毒侵染性克隆中直觀地 觀察和研究病毒在植物體內運動和積累情況;此外，還可研究病毒致病性方面的問題，如癥 狀發(fā)生、種子和昆蟲傳播等機理。
[0003] 在病原菌侵染寄主植物途徑的研究中，常利用熒光素酶基因 （lux )和β-葡萄糖 苷酸酶基因（gus)等標記病原菌，進行跟蹤檢測，但熒光素酶檢測時需向試驗材料內滲入 熒光素;而葡萄糖苷酸酶進行組織化學分析時，需要昂貴的反應底物，并且基因標記能夠 破壞病原菌，在進行組織處理時也會阻斷植物病原菌的繼續(xù)侵染。因此，在病原菌侵染寄主 植株途徑的研究中一直未取得可靠的實時實態(tài)過程。綠色焚光蛋白（Green fluorescent protein，GFP)是1962年從發(fā)光水母中發(fā)現，由于其本身是一種發(fā)光蛋白，具有穩(wěn)定、直觀、 操作方便的熒光性質。利用GFP標記靶標微生物是目前研究微生物和宿主互作的重要手段， 與抗生素抗性標記和放射性同位素標記等方法相比，GFP標記因為對菌株影響小，易操作， 并可以直接觀察和評估定殖效果而受到國內外研究者的重視。作為報告基因，GFP具有如下 優(yōu)點：（1)綠色熒光蛋白基因的表達不需要借助輔助因子以及其他外源底物，在熒光顯微鏡 下就能直接觀察到綠色熒光，具有方便、快速、靈敏度高等特點，且還可以通過熒光強度，衡 量其在單細胞水平的表達量。（2)綠色熒光蛋白無毒性，對活細胞無毒害，不影響目的基因 的功能，轉化后細胞仍可連續(xù)傳代，其分子結構及熒光特性相當穩(wěn)定，對光漂白、堿性、適當 高溫、除垢劑、有機溶劑和大多數普通酶等有較強的耐受性。（3)易于載體構建:綠色熒光蛋 白的編碼序列較小僅717bp左右，可與目的基因整合到同一個質粒中，避免載體過大而引 起帶來轉化效率過低的問題。（4)能夠對活細胞進行實時定位觀察。通過GFP標記病原菌 研究其侵染寄主的過程，最大程度的接近自然真實狀態(tài)。
[0004] MNSV屬于香石竹斑駁病毒屬(Carmovirys)，主要通過種子、土壤真菌和黃瓜黑頭 葉甲、機械摩擦接種進行傳播，該病害隨種子調運遠距離傳播將會嚴重影響我國甜瓜生產。 MNSV基因組很小，只有4.3kb，是非常好的基因工程材料，侵染性克隆的成功使對該病毒的 研究易于在DNA水平上進行操作，通過基因工程改造該基因，加快MNSV功能基因組學的研 究，為揭示其基因功能奠定基礎。GFP穩(wěn)定性好，表達載體容易構建，適合作為標記基因跟 蹤病原菌研究其發(fā)生發(fā)展規(guī)律。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的就在于克服現有技術的不足而提供一種攜帶GFP的甜瓜壞死斑點病 毒侵染性克隆載體及其構建方法。
[0006] 本發(fā)明的目的是以下述技術方案實現的： 一種攜帶GFP的甜瓜壞死斑點病毒侵染性克隆載體，它是由GFP全長基因融合到麗SV侵 染性克隆載體PCB301-MNSV的cp基因后面獲得的。
[0007] 如上甜瓜壞死斑點病毒侵染性克隆載體的構建方法，包括以下步驟： (1) 分別利用RT-PCR的方法獲得GFP和甜瓜壞死斑點病毒侵染性克隆全長基因； (2) 將步驟（1)獲得的GFP片段和甜瓜壞死斑點病毒侵染性克隆全長基因通過 Infusion-HD酶連接，轉化大腸桿菌DH5a，篩選并提取獲得含有GFP的甜瓜壞死斑點病毒侵 染性克隆載體pMNSV-GFP。
[0008] 步驟(1)中用來擴增甜瓜壞死斑點病毒侵染性克隆全長基因的引物為:MNSV-GFP-F：5;-CAT GGC ATG GAT GAA CTA TAC AAA TTTAATTTATTGCACTCCAAATC_3\MNSV-GFP-RJ'-AAA AGT TCT TCT CCT TTA CT CAT GGC GAG GTAG GCT GTT TCC GGA G_3';該 引物用來擴增MNSV的全基因組序列，并去掉cp基因終止密碼子，劃線部分為融合的GFP序 列。
[0009] 步驟（1)用來擴增GFP全長基因序列的引物為:GFP-F: 5 ^ ~CTC CGG AAA CAG CCT ACC TCGCC ATG AGT AAA GGA GAA GAA CTT TT-3;；GFP-R：5;-GAT TTG GAG TGC AAT AAA TT AAA TTT GTA TAG TTC ATC CATGC CAT G-3\劃線部分為融合的MNSV的部分序列。
[0010] 步驟(l)PCR擴增所用的模板為pCB301-MNSV質粒模板。
[0011 ]步驟(1 )PCR擴增所用的模板為含有GFP基因的質粒pBI 22卜GFP。
[0012] 一種如上所述攜帶GFP的甜瓜壞死斑點病毒侵染性克隆載體的驗證方法為，通過 農桿菌凍融法把攜帶GFP的甜瓜壞死斑點病毒克隆載體轉入農桿菌GV3101中，通過農桿菌 注射接種寄主植物甜瓜子葉，觀察甜瓜幼苗的發(fā)病情況，證實攜帶GFP的甜瓜壞死斑點病毒 載體為具有侵染性的載體PMNSV-GFP。
[0013] 本發(fā)明采用同源重組的方式將GFP全長基因融合到甜瓜壞死斑點病毒侵染性克隆 載體的cp基因后面，然后通過轉入農桿菌宿主細胞GV3101，摩擦接種到甜瓜上證實其具有 侵染性，并通過激光共聚焦觀察到GFP的成功表達，可及時跟蹤MNSV病毒的發(fā)展情況。MNSV 基因組很小，只有4.3kb，是非常好的基因工程材料，侵染性克隆的成功使對該病毒的研究 易于在DNA水平上進行操作，通過基因工程改造該基因，加快MNSV功能基因組學的研究，為 揭示其基因功能奠定基礎。GFP穩(wěn)定性好，表達載體容易構建，適合作為標記基因跟蹤病原 菌研究其發(fā)生發(fā)展規(guī)律，將GFP基因與MNSV融合，實現對該病毒的熒光標記，借助熒光顯微 鏡，真實反映該病毒在植株中的分布，明確病毒在植物體內的運動和定植，直觀地呈現了 MNSV侵染的動態(tài)過程，不僅為病原菌與寄主互作和致病機理的研究提供了依據，也為病 害的科學防治提供了參考。
【附圖說明】
[0014] 圖1是MNSV侵染性克隆載體pCB301-MNSV圖譜； 圖2是攜帶有GFP基因 pBI221-GFP載體圖譜； 圖3是攜帶了GFP基因的MNSV侵染性克隆載體pMNSV-GFP圖譜； 圖4是通過激光共聚焦觀察攜帶有GFP的MNSV接種后甜瓜葉部和根部圖（儀器型號： Leica TCS SP5;在激發(fā)光488nm的波長條件下觀察）。
【具體實施方式】
[0015] 一種攜帶GFP的甜瓜壞死斑點病毒侵染性克隆載體，它是由GFP全長基因融合到 MNSV侵染性克隆載體pCB301-MNSV(專利CN2015105541484)的cp基因后面獲得的，如圖3所 示;所述GFP和MNSV融合基因如序列SEQ ID N0:05所示。MNSV基因組只有4.3kb，是非常好的 基因工程材料，該病毒侵染性克隆的成功使對該病毒的研究轉到DNA水平上。在把GFP基因 融合到MNSV的試驗方案上，申請人層嘗試把GFP融合到病毒組分的其他部位，結果發(fā)現把 GFP融合到MNSV cp基因后，其對寄主植物的致病力強，且表達穩(wěn)定。因此，申請人采用把GFP 融合到MNSV cp基因后，實現了對該病毒的熒光標記，借助激光共聚焦顯微鏡，真實反映該 病毒在植株中的分布，明確病毒在植物體內的運動和定植，直觀地呈現了 MNSV侵染的動 態(tài)過程，為病原菌與寄主互作和致病機理的研究提供了依據。
[0016]此外，該發(fā)明利用了融合PCR和重組酶的特點構建了MNSV攜帶有GFP的方法與傳統(tǒng) 的酶切連接方式相比，最突出的優(yōu)點是不受限制性內切酶位點的影響，不引入外源的酶切 位點，對侵染性克隆的影響最小，利用該方法對該侵染性克隆載體進行隨意的缺失、突變及 替換等多種基因工程手段進行改造，該方法既節(jié)省了工序，又提高了重組的陽性率，避免了 實驗的繁瑣及內切酶的限制。
[0017] 上述攜帶GFP的甜瓜壞死斑點病毒侵染性克隆載體的構建方法，包括以下步驟： (1)分別利用RT-PCR的方法獲得GFP和甜瓜壞死斑點病毒侵染性克隆全長基因；在設 計擴增麗SV及GFP全長基因的引物時，利用了重組融合的方法，麗SV基因5'和3'端分別重組 了 24bp和20bp的GFP序列；在擴增GFP基因時5'和3'端兩端序列分別融合了MNSV的23bp和 20bp的序列； ①獲得甜瓜壞死斑點病毒侵染性克隆全長基因：設計引物為MNSV-GFP-F: 5' -CAT GGC ATG GAT GAA CTA TAC AAA TTT AAT TTA TTG CAC TCC AAA TC-3 \ MNSV-GFP-R:5 ^AAA AGT TCT TCT CCT TTA CT CAT GGC GAG GTAG GCT GTT TCC GGA G_3';該引物用來擴增 麗SV的全基因組序列，并去掉cp基因終止密碼子，劃線部分為融合的GFP序列；20yLRT-PCR 擴增標準反應體系：4.0yL 5XPCR buffer，2 yL正向和反向引物混合物(各10μΜ)，0.2 μ LTaq DNA聚合酶(5 Μ/μυ，1 yL pCB301_MNSV質粒模板(如圖1所示，MN