SV的全長基因置 于35s啟動(dòng)子和35s-t終止子中間，該載體具有在植物中表達(dá)的能力，能夠侵染MNSV的寄主 植物甜瓜），補(bǔ)充ddH 20至20μΙ^ΡΟ?反應(yīng)循環(huán)參數(shù):94°C預(yù)變性5min;94°C變性40 s，60°C退 火40s，72°C延伸50s，循環(huán)30次；最后72°C 10 min;以上用到的各種試劑均購自大連 TaKaRa公司。
[0018] ②獲得GFP全長基因：設(shè)計(jì)引物為GFP-Fd'-CTC CGG AAA CAG CCT ACC TCGCC ATG AGT AAA GGA GAA GAA CTT TT~3;；GFP-R：5;-GAT TTG GAG TGC AAT AAA TT AAA TTT GTA TAG TTC ATC CATGC CAT G-3';劃線部分為融合的MNSV序列；該引物用來擴(kuò)增717bp的 全長GFP序列；20yLRT-PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系：4.0yL 5XPCR buffer，2 yL正向和反向引 物混合物(各10μΜ)，0·2 yLTaq DNA聚合酶(5 Μ/μυ，1 yL PBI221-GFP模板(如圖2所示， 購自上海生工生物公司），補(bǔ)充ddH20至20yL 1CR反應(yīng)循環(huán)參數(shù):94°C預(yù)變性5min; 94°C變 性40 s，60°C退火40s，72°C延伸50s，循環(huán)30 次；最后72°C 10 min。
[0019] (2)將步驟(1)獲得的GFP和甜瓜壞死斑點(diǎn)病毒侵染性克隆全長基因用1%的瓊脂糖 膠檢測(cè)，按照回收試劑盒(大連TaKaRa公司）說明書進(jìn)行回收。用Infusion-HD重組酶(購自 Clontech公司）把回收的GFP和甜瓜壞死斑點(diǎn)病毒侵染性克隆全長基因連接到。重組酶連接 體系為:GFP基因片段:2yL;甜瓜壞死斑點(diǎn)病毒侵染性克隆全長基因：3yL，Infusion-HD酶:5 yL，共計(jì)10yL，置于50 °C，30min，隨后把產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，涂布在含有kan抗生素的平 板上，37°C培養(yǎng)，篩選含有甜瓜壞死斑點(diǎn)病毒的全基因組及GFP的全長基因的克隆載體，即 為攜帶GFP的甜瓜壞死斑點(diǎn)病毒克隆載體pMNSV-GFP，用堿裂解法抽提質(zhì)粒載體。
[0020] 將上述攜帶GFP的甜瓜壞死斑點(diǎn)病毒克隆載體pMNSV-GFP轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，并通過摩擦 接種證實(shí)該載體的侵染性，具體包括以下步驟： (1)轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌：采用凍融法，將上述pMNSV-GFP轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，具體 為:加入lyg的重組載體，置于冰上30min，液氮中速凍5min，37°C 5min，加入500μ1的不含有 任何抗生素的LB培養(yǎng)基中，28 °C慢速培養(yǎng)4-6h，涂布于含有50μg/ml的Km、10μg/ml四環(huán)素和 50μg/ml的Rif的3種抗生素的LB固體培養(yǎng)基平板上28°C培養(yǎng)約48h;利用菌落PCR的方法篩 選陽性轉(zhuǎn)化子。
[0021] (2 )農(nóng)桿菌注射接種及致病性鑒定:把篩選到的陽性轉(zhuǎn)化子接種到含有50μg/ml的 Km、10μg/ml四環(huán)素和50μg/ml的Rif的3種抗生素的LB的液體培養(yǎng)基中，28°C 200rpm培養(yǎng) 至0D600為1.0左右，6000rpm lOmin離心收集沉淀，重懸與含有10mM Mgcl2，10mM MES，150y m的乙酰丁香酮的浸潤緩沖液中，調(diào)整0D600至1.0，靜置4h后注射接種兩葉一心的甜瓜子葉 的背部，接種后把甜瓜苗保持在黑暗中l(wèi)〇h后，22°C培養(yǎng)。觀察甜瓜幼苗的發(fā)病情況，檢測(cè)甜 瓜壞死斑點(diǎn)病毒克隆載體的侵染性。接種后每天觀察發(fā)病情況。接種4天后，接種的子葉開 始出現(xiàn)局部的壞死斑點(diǎn)癥狀，至第8天時(shí)，子葉的枯斑開始連片出現(xiàn)，真葉也陸續(xù)出現(xiàn)壞死 斑點(diǎn)癥狀，經(jīng)RT-PCR檢測(cè)顯示，接種后大部分植株表現(xiàn)陽性，發(fā)病率達(dá)90%(發(fā)病27/30)。通 過激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)病的植株的根部和葉片，可以明顯發(fā)現(xiàn)GFP在根部和葉片中表 達(dá)，如圖4所示，a-c為接種葉片，a為在激光下暗場(chǎng)，b為明場(chǎng)，c為兩個(gè)疊加;d-f為根部，d為 在激光下暗場(chǎng)，e為明場(chǎng)，f為兩個(gè)疊加，綠色熒光部分（圖中灰色所示)為GFP的表達(dá)。同時(shí)， 隨后將發(fā)病的植株經(jīng)摩擦接種回接到健康的甜瓜植株上，接種7天后植株均表現(xiàn)明顯的枯 斑癥狀，說明構(gòu)建的侵染性克隆能夠摩擦接種傳播。由此證實(shí)攜帶GFP的甜瓜壞死斑點(diǎn)病毒 侵染性克隆載體pMNSV-GFP構(gòu)建成功。
[0022] <11〇>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所 〈120> -種攜帶GFP的甜瓜壞死斑點(diǎn)病毒侵染性克隆載體 <130> 1 <160> 5 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 47 <212> DNA <213>引物 <400> 1 catggcatgg atgaactata caaatttaat ttattgcact ccaaatc 47 〈210〉 2 〈211〉 46 〈212〉 DNA 〈213〉引物 〈400〉 2 aaaagttctt ctcctttact catggcgagg taggctgttt ccggag 46 〈210〉 3 〈211〉 46 〈212〉 DNA 〈213〉引物 〈400〉 3 ctccggaaac agcctacctc gccatgagta aaggagaaga actttt 46 〈210〉 4 〈211〉 47 〈212〉 DNA 〈213〉引物 〈400〉 4 gatttggagt gcaataaatt aaatttgtat agttcatcca tgccatg 47 〈210〉 5 〈211〉 4978 〈212〉 DNA 〈213〉MNSV+GFP 融合基因 〈400> 5




上述MNSV+GFP序列中劃線部分為GFP全長基因。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種攜帶GFP的甜瓜壞死斑點(diǎn)病毒侵染性克隆載體，其特征在于：它是由GFP全長基 因融合到麗SV侵染性克隆載體pCB301-MNSV的cp基因后面獲得的。2. 如權(quán)利要求1所述的攜帶GFP的甜瓜壞死斑點(diǎn)病毒侵染性克隆載體的構(gòu)建方法，其特 征在于包括以下步驟： (1) 分別利用RT-PCR的方法獲得GFP和甜瓜壞死斑點(diǎn)病毒侵染性克隆全長基因； (2) 將步驟（1)獲得的GFP片段和甜瓜壞死斑點(diǎn)病毒侵染性克隆全長基因通過 Infusion-HD酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，篩選并提取獲得含有GFP的甜瓜壞死斑點(diǎn)病毒侵 染性克隆載體pMNSV-GFP。3. 如權(quán)利要求2所述的攜帶GFP的甜瓜壞死斑點(diǎn)病毒侵染性克隆載體的構(gòu)建方法，其特 征在于步驟(1)中用來擴(kuò)增甜瓜壞死斑點(diǎn)病毒侵染性克隆全長基因的引物為:MNSV-GFP-F: 5 ;~CAT GGC ATG GAT GAA CTA TAC AAA TTTAATTTATTGCACTCCAAATC_3\MNSV-GFP-RJ'-AAA AGT TCT TCT CCT TTA CT CAT GGC GAG GTAG GCT GTT TCC GGA G_3';該 引物用來擴(kuò)增MNSV的全基因組序列，并去掉cp基因終止密碼子，劃線部分為融合的GFP序 列。4. 如權(quán)利要求2所述的攜帶GFP的甜瓜壞死斑點(diǎn)病毒侵染性克隆載體的構(gòu)建方法，其特 征在于步驟（1)用來擴(kuò)增GFP全長基因序列的引物為:GFP-F: 5' ~CTC CGG AAA CAG CCT ACC TCGCC ATG AGT AAA GGA GAA GAA CTT TT~3;；GFP~R：5;~GAT TTG GAG TGC AAT AAA TT AAA TTT GTA TAG TTC ATC CATGC CAT G-3\劃線部分為融合的MNSV的部分序列。5. 如權(quán)利要求3所述的攜帶GFP的甜瓜壞死斑點(diǎn)病毒侵染性克隆載體的構(gòu)建方法，其特 征在于步驟(1 )PCR擴(kuò)增所用的模板為pCB301-MNSV質(zhì)粒模板。6. 如權(quán)利要求4所述的攜帶GFP的甜瓜壞死斑點(diǎn)病毒侵染性克隆載體的構(gòu)建方法，其特 征在于步驟(l)PCR擴(kuò)增所用的模板為含有GFP基因的質(zhì)粒pBI221-GFP。7. -種如權(quán)1-6任一項(xiàng)所述攜帶GFP的甜瓜壞死斑點(diǎn)病毒侵染性克隆載體的驗(yàn)證方法， 其特征在于：通過農(nóng)桿菌凍融法把攜帶GFP的甜瓜壞死斑點(diǎn)病毒克隆載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌 GV3101中，通過農(nóng)桿菌注射接種寄主植物甜瓜子葉，觀察甜瓜幼苗的發(fā)病情況，證實(shí)攜帶 GFP的甜瓜壞死斑點(diǎn)病毒載體為具有侵染性的載體pMNSV-GFP。
【專利摘要】本發(fā)明涉及到香石竹斑駁病毒屬(<i>Carmovirμs</i>)的甜瓜壞死斑點(diǎn)病毒（<i>Melon？necrotic？spot？virus</i>,？MNSV），在該病毒侵染性克隆獲得的基礎(chǔ)上構(gòu)建了攜帶GFP的甜瓜壞死斑點(diǎn)病毒克隆載體，并進(jìn)行了致病性分析，證實(shí)該攜帶GFP的甜瓜壞死斑點(diǎn)病毒的克隆載體為侵染性克隆載體。攜帶GFP的甜瓜壞死斑點(diǎn)病毒侵染性克隆載體是把GFP的全長基因通過融合PCR的方法與甜瓜壞死斑點(diǎn)病毒侵染性克隆載體pCB301-MNSV連接，獲得的具有侵染性克隆的重組表達(dá)載體。該載體通過凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株GV3101中，獲得對(duì)甜瓜植物具有高效侵染能力且攜帶有GFP的病毒載體pMNSV-GFP。
【IPC分類】C12N15/66, C12N15/82
【公開號(hào)】CN105567728
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610030358
【發(fā)明人】吳會(huì)杰, 古勤生
【申請(qǐng)人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所
【公開日】2016年5月11日
【申請(qǐng)日】2016年1月18日