專利名稱：一種植物病毒接種方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物保護(hù)和基因工程領(lǐng)域，提供了一種新的植物病毒接種方法，具體地說是一種利用農(nóng)桿菌在田間大規(guī)模接種病毒的方法。
背景技術(shù)：
通過基因工程手段，可以構(gòu)建植物病毒的侵染性cDNA克隆。利用侵染性cDNA克隆，可以研究明確病毒的致病機(jī)理，進(jìn)而可以把該克隆改造成弱毒疫苗，通過交叉保護(hù)來保護(hù)植株免受強(qiáng)毒株系的侵染；也可以把病毒的侵染性克隆改造為表達(dá)載體，用來生產(chǎn)動(dòng)物疫苗、抗病毒蛋白等高附加值的外源蛋白。目前，研制開發(fā)的弱毒株系和表達(dá)載體已經(jīng)越來越多。限制弱毒株系和表達(dá)載體應(yīng)用的瓶頸是大規(guī)模接種技術(shù)。根據(jù)侵染性克隆的不同特點(diǎn)，室內(nèi)試驗(yàn)可以通過摩擦接種，基因槍接種或者是農(nóng)桿菌浸潤(rùn)等方法接種試驗(yàn)植物?；驑尳臃N需要有專門的儀器，操作比較復(fù)雜，有的還需要抽真空，每批次能接種的植株數(shù)量很少。摩擦接種和農(nóng)桿菌浸潤(rùn)不需要復(fù)雜的儀器，但每人每天接種的植株數(shù)量也有限。因此，這些方法只適合在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)應(yīng)用，不適合在田間大規(guī)模地接種試驗(yàn)植物。

在實(shí)際應(yīng)用中急需開發(fā)適合植物病毒弱毒株系和表達(dá)載體大規(guī)模接種的方法。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有接種方法無法滿足田間大規(guī)模接種應(yīng)用的需要這一問題，本發(fā)明提供了一種利用農(nóng)桿菌在田間大規(guī)模接種病毒的方法，其包括如下步驟:將病毒的侵染性克隆轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，經(jīng)過培養(yǎng)后離心收集菌體，適當(dāng)稀釋后，將菌體噴布到葉片表面；農(nóng)桿菌可以通過氣孔和傷口侵染植物，從而將病毒帶入植物細(xì)胞。本方法操作簡(jiǎn)單、成本低、效率高，適合在田間大規(guī)模接種病毒。本方法操作簡(jiǎn)單、成本低、效率高，適合在田間大規(guī)模接種病毒，可用來接種病毒的弱毒株系，以保護(hù)植株免受強(qiáng)毒株系的侵染，也可以利用病毒在植物體內(nèi)表達(dá)抗病毒蛋白或生產(chǎn)疫苗。之所以采用這種方式，發(fā)明人主要是利用了農(nóng)桿菌在自然界可以通過自然孔口(如氣孔)和傷口侵入植物這一現(xiàn)象。本發(fā)明利用農(nóng)桿菌的這一特點(diǎn)，將病毒基因組連接到合適的穿梭載體中，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，農(nóng)桿菌通過氣孔和傷口侵染植物，從而把病毒基因組帶到植物細(xì)胞中中，使病毒在植物細(xì)胞內(nèi)增殖。農(nóng)桿菌可以用葉片噴霧的方式，解決了大規(guī)模接種病毒的技術(shù)問題，克服了限制弱毒疫苗使用的瓶頸問題。本發(fā)明實(shí)施的具體技術(shù)方案是:一種接種植物病毒的方法，其特征在于:將待接種病毒的侵染性克隆轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，農(nóng)桿菌培養(yǎng)后離心收集菌體，將其稀釋到0D600為0.5-1.0，通過葉面噴施農(nóng)桿菌接種植物病毒。噴霧時(shí)要兼顧到葉片的正反兩面，噴霧器的噴嘴距葉片10 - 30厘米。其中所述的病毒可以是能夠在農(nóng)桿菌內(nèi)繁殖的侵染性克隆。綜上所述，本發(fā)明提供了一種全新的植物病毒接種方法。本方法操作簡(jiǎn)單、成本低、效率高，不需要特殊的儀器設(shè)備，利用普通的噴霧器就可以完成，適合在田間大規(guī)模接種病毒，可用來接種病毒的弱毒株系，以保護(hù)植株免受強(qiáng)毒株系的侵染，也可以利用病毒在植物體內(nèi)表達(dá)抗病毒蛋白或生產(chǎn)疫苗，使用簡(jiǎn)單方便，成本低效率高，適合在科研溫室、育苗公司的育苗棚或大田應(yīng)用。


圖1為采用本發(fā)明噴霧接種煙草脈帶花葉病毒8天后煙草的感染情況，圖中普通煙葉片出現(xiàn)病毒的侵染點(diǎn)，且病毒已經(jīng)移動(dòng)到葉脈；圖2利用本方法接種病毒載體表達(dá)外源蛋白后的結(jié)果示意圖，圖中嗔霧接種10天后，外源蛋白GFP在本氏煙中得到大量表達(dá)，植株上部葉片在紫外燈下表現(xiàn)出強(qiáng)烈的綠色熒光(右)。左圖顯示噴霧接種的病毒通過葉脈近、葉柄移動(dòng)到其它部位；圖3用本方法接種的弱毒株系對(duì)強(qiáng)毒株系的交叉保護(hù)效果示意圖，圖中A為先用噴霧法接種弱毒株系然后再接接種強(qiáng)毒株系的植株，B為直接接種強(qiáng)毒株系的植株，圖中可見先用噴霧法接種弱毒株系的植株幾乎看不到癥狀，而直接接種強(qiáng)毒株系的植株產(chǎn)生嚴(yán)重的花葉癥狀；
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式
，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1:通過農(nóng)桿菌噴霧表達(dá)外源蛋白(以GFP為例)1.病毒侵染性克隆轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，采取液氮凍融法。從_80°C冰箱中取出I管農(nóng)桿菌GV3101的感受態(tài)細(xì)胞(100-200 μ I )，冰上解凍。解凍后加入100-300ng病毒侵染性克隆pCamTVBMV-GFP。放入液氮中冷凍l_5min。取出后立即放入37°C水浴中5min。加入800 μ I無抗生素的LB培養(yǎng)液，28°C搖床培養(yǎng)3h。5000r/min離心收集菌體，
離心管中保留約200 μ I培養(yǎng)液并重新懸浮菌體。在超凈臺(tái)上將菌體均勻涂布于含相應(yīng)抗生素的固體培養(yǎng)基平板，28°C培養(yǎng)2天左右，直至出現(xiàn)菌落。挑取菌落進(jìn)行PCR鑒定，證明菌落中含有質(zhì)粒pCamTVBMV-GFP。2.農(nóng)桿菌的培養(yǎng)經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證后,挑單斑接種于含有50 μ g/ml卡那霉素、50 μ g/ml利福霉素和5 μ g/ml四環(huán)素的5ml液體LB中。28°C振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。取Iml菌液加至IOOml含10mmol/L2- (N-嗎啉)-乙基磺酸和20 μ mo I/L乙酰丁香酮(AS)及與上步相同抗生素的LB培養(yǎng)基中，于28°C振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。10000r/m離心I分鐘，收集菌體，重新懸浮于農(nóng)桿菌菌體重懸溶液(10mmol/L MgCl2,10mmol/L MES,0.15mmol/L AS)中，調(diào)整濃度使其0D600為0.5-1.0左右，室溫靜置3h。
3.接種寄主植物及外源蛋白表達(dá)將攜帶侵染性克隆pCamTVBMV-GFP的農(nóng)桿菌菌體懸浮液裝入小噴壺，選取2_3片真葉的普通煙和本氏煙植株，于葉正反兩面均勻噴施，噴霧器的噴嘴距葉片10 - 30厘米。處理完的植株放在23°C光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(16h光照/8h黑暗交替)。4天后開始每天在紫外燈下觀察綠色熒光的有無和強(qiáng)弱。結(jié)果表明，(I)本氏煙葉片在噴霧接種5天后，在紫外燈下可以看到明顯的綠色熒光，而普通煙葉片上在噴霧接種8天后可看到綠色熒光(圖1); (2)噴霧接種10天后，本氏煙上部葉片上會(huì)出現(xiàn)很強(qiáng)的綠色熒光(圖2)，說明GFP在本氏煙葉片中得到了大量表達(dá)。實(shí)施例2:通過農(nóng)桿菌噴霧接種病毒的弱毒株系1.病毒侵染性克隆轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，采取液氮凍融法。從_80°C冰箱中取出I管農(nóng)桿菌GV3101的感受態(tài)細(xì)胞(100-200 μ I )，冰上解凍。解凍后加入100-300ng TVBMV弱毒株系D198K的質(zhì)粒。放入液氮中冷凍l_5min。取出后立即放入37°C水浴中5min。加入800 μ I無抗生素的LB培養(yǎng)液，28°C搖床培養(yǎng)3h。5000r/min離心收集菌體，離心管中保留約200 μ I培養(yǎng)液并重新懸浮菌體。在超凈臺(tái)上將菌體均勻涂布于含相應(yīng)抗生素的固體培養(yǎng)基平板，28°C培養(yǎng)2天左右，直至出現(xiàn)菌落。挑取菌落進(jìn)行PCR鑒定。2.農(nóng)桿菌的培養(yǎng)經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證后,挑單斑接種于含有50 μ g/ml卡那霉素、50 μ g/ml利福霉素和
5μ g/ml四環(huán)素的5ml液體LB中。28°C振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。取Iml菌液加至IOOml含10mmol/L2- (N-嗎啉)-乙基磺酸和20 μ mo I/L乙酰丁香酮(AS)及與上步相同抗生素的LB培養(yǎng)基中，于28°C振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。10000r/m離心I分鐘，收集菌體，重新懸浮于農(nóng)桿菌菌體重懸溶液(10mmol/L MgCl2,10mmol/L MES,0.15mmol/L AS)中，調(diào)整濃度使其0D600為0.5-1.0左右，室溫靜置3h。3.接種寄主植物及交叉保護(hù)效果將攜帶TVBMV弱毒株系D198K的農(nóng)桿菌菌體懸浮液裝入小噴壺，選取2_3片真葉的普通煙植株，于葉表正反兩面均勻噴施。處理完的植株放置23°C光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(16h光照/8h黑暗交替)。15天后摩擦接種TVBMV強(qiáng)毒株系，再過20天后觀察癥狀。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接種強(qiáng)毒株系20天后，直接接種強(qiáng)毒株系的煙草葉片上表現(xiàn)出嚴(yán)重的脈帶花葉癥狀，而先接種弱毒株系D198K再接種強(qiáng)毒株系的煙草葉片上沒有明顯癥狀(圖3)，弱毒株系對(duì)強(qiáng)毒株系表現(xiàn)出良好的交叉保護(hù)效果。說明通過農(nóng)桿菌噴霧接種植物病毒的弱毒株系是可行的。
權(quán)利要求
1.一種接種植物病毒的方法，其特征在于:將待接種病毒的侵染性克隆轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，農(nóng)桿菌培養(yǎng)后離心收集菌體，將其稀釋到0D600為0.5-1.0，通過葉面噴施農(nóng)桿菌接種植物病毒。
2.如權(quán)利要求1所述方法在表達(dá)外源蛋白以及利用弱毒株系保護(hù)植株免受強(qiáng)毒株系侵染方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的植物病毒接種方法，具體是利用細(xì)菌在田間大規(guī)模接種病毒的方法，主要針對(duì)能在農(nóng)桿菌中復(fù)制的植物病毒侵染性克隆，其原理是將植物病毒的侵染性克隆轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，利用農(nóng)桿菌可以通過自然孔口和傷口侵染植物這一特性，將病毒帶入植物細(xì)胞。本方法操作簡(jiǎn)單、成本低、效率高，適合在田間大規(guī)模應(yīng)用，可用來接種病毒的弱毒株系，以保護(hù)植株免受強(qiáng)毒株系的侵染，也可以利用病毒載體在植物體內(nèi)表達(dá)高附加值的外源蛋白。
文檔編號(hào)C12N15/82GK103146744SQ201310060570
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月26日
發(fā)明者李向東, 高瑞, 叢倩倩, 許斐斐, 郭兆奎, 李現(xiàn)道, 竺曉平 申請(qǐng)人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)