根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黑孢塊菌遺傳轉(zhuǎn)化方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黑孢塊菌遺傳轉(zhuǎn)化方法，屬于黑孢塊菌的遺傳轉(zhuǎn)化領(lǐng)域。本發(fā)明根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黑孢塊菌遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括以下步驟：(1)制備黑孢塊菌孢子懸浮液；(2)將攜帶有目的基因的雙元載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，獲得根癌農(nóng)桿菌陽性轉(zhuǎn)化子，制備菌液；(3)將步驟(2)制備的菌液與步驟(1)制備的黑孢塊菌孢子懸浮液混合，共培養(yǎng)；(4)選擇性培養(yǎng)，篩選黑孢塊菌轉(zhuǎn)化子，鑒定，即得。本發(fā)明方法以黑孢塊菌的孢子為受體，以根癌農(nóng)桿菌為介體，具有簡(jiǎn)單方便，轉(zhuǎn)化效率高且穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化子為單拷貝的頻率高等優(yōu)點(diǎn)，適用于黑孢塊菌功能基因組學(xué)及生物學(xué)研究等。
【專利說明】根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黑孢塊菌遺傳轉(zhuǎn)化方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及黑孢塊菌的轉(zhuǎn)化方法，尤其涉及根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黑孢塊菌遺傳轉(zhuǎn)化 方法，屬于黑孢塊菌的遺傳轉(zhuǎn)化領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 黑孢塊菌（Tuber melanosporum)是一種原產(chǎn)自法國(guó)，與橡樹、櫟樹等樹種根系共 生的外生菌根型食用真菌，以其與生俱來的獨(dú)特香味和"鉆石"身價(jià)而備受關(guān)注。黑孢塊菌 基因組測(cè)序的完成推動(dòng)了研宄人員從分子水平對(duì)黑孢塊菌生物學(xué)的認(rèn)識(shí)，但是由于黑孢塊 菌尚未建立成熟的遺傳操作系統(tǒng)，極大限制了黑孢塊菌功能基因組學(xué)研宄。
[0003] 近年來發(fā)展起來的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的絲狀真菌轉(zhuǎn)化方法具有以下三個(gè)優(yōu)點(diǎn)： 第一，農(nóng)桿菌可以轉(zhuǎn)化完整的細(xì)胞如孢子、菌絲體，甚至是大型真菌的子實(shí)體，這就免 去了制備原生質(zhì)體的麻煩，從而不需要考慮影響原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化率的諸多因素（Vianey Olmedo-Monfil，Carlos Cortes-Penagos，Alfredo Herrera-Estrella. Three decades of fungal transformation:key concepts and applications. Methods in Molecular Bi〇 1 ogy，2004, 267:297-313.);第二，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化效率很高；研宄表明，農(nóng)桿菌介 導(dǎo)絲狀真菌的轉(zhuǎn)化效率一般在300-720個(gè)轉(zhuǎn)化子每10 7個(gè)細(xì)胞，比其他真菌轉(zhuǎn)化方法 高 100-1000 倍（Marcel-J.A.de Groot，Paul Bundock，Paul_J.J Hooykaas，Alice_G. M. Beijersbergen. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi. Nature Biotechnology, 1998, 16:839-842.);第三，T-DNA 插入產(chǎn) 生的突變體大部分為單拷貝插入，當(dāng)采用具有單核的分生孢子為轉(zhuǎn)化受體時(shí)可以得到后 代不分離的轉(zhuǎn)化子，避免了真菌菌絲多核所造成的轉(zhuǎn)化子不穩(wěn)定的難題（ED Mullins，X Chen, P Romaine, R Raina, DM Geiser, S Kang. Agrobacterium-Mediated Transformation of Fusarium oxysporum:An Efficient Tool for Insertional Mutagenesis and Gene Transfer. Phytopathology, 2001，91:173-180.)。根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化系 統(tǒng)存在的缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)化需要大量的孢子或者子實(shí)體作為轉(zhuǎn)化受體，并不適用于人工培養(yǎng)條件 下產(chǎn)抱少或者不產(chǎn)抱真菌（Olmedo-Monfil et al, 2004)。
[0004] 黑孢塊菌在發(fā)酵條件和真菌常規(guī)培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基上產(chǎn)孢很少或者不產(chǎn)孢，同時(shí) 黑孢塊菌目前尚未有成功制備原生質(zhì)體的報(bào)道，缺少一套適合黑孢塊菌的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是 限制黑孢塊菌分子生物學(xué)研宄的瓶頸。
[0005] 因此，亟待構(gòu)建一種簡(jiǎn)單、高效的黑孢塊菌遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，對(duì)于推動(dòng)黑孢塊菌功能 基因組學(xué)研宄，促進(jìn)黑孢塊菌資源的開發(fā)和利用具有重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黑孢塊菌（Tuber melanosporum)遺傳轉(zhuǎn)化方法，該方法簡(jiǎn)單方便、轉(zhuǎn)化效率高且穩(wěn)定。
[0007] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：
[0008] 本發(fā)明公開了一種根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黑孢塊菌（Tuber melanosporum)遺傳轉(zhuǎn)化 方法，包括以下步驟：
[0009] (1)制備黑孢塊菌孢子懸浮液；（2)將攜帶有目的基因的雙元載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌 農(nóng)桿菌，獲得根癌農(nóng)桿菌陽性轉(zhuǎn)化子，制備菌液；（3)將步驟（2)制備的菌液與步驟（1)制 備的黑孢塊菌孢子懸浮液混合，共培養(yǎng)；(4)選擇性培養(yǎng)，篩選黑孢塊菌轉(zhuǎn)化子，鑒定，即 得。
[0010] 其中，步驟（1)所述黑孢塊菌孢子懸浮液中孢子濃度為104-108個(gè)/mL，優(yōu)選為10 6 個(gè)/mL ;所述制備黑孢塊菌孢子懸浮液，包括：(a)將黑孢塊菌菌絲體接種于PDA培養(yǎng)基，于 28°C培養(yǎng)活化；優(yōu)選的，活化3d ; (b)將活化后的黑孢塊菌菌絲體接種于VBC培養(yǎng)基，28°C 培養(yǎng)4-9d，優(yōu)選為7d ;用無菌水洗滌菌絲體，收集黑孢塊菌的孢子，稀釋，即得。
[0011] 步驟（2)將攜帶有目的基因的雙元載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌的方法為本領(lǐng)域技 術(shù)人員所熟知，例如化學(xué)轉(zhuǎn)化法。
[0012] 步驟（2)所述制備菌液包括：(a)挑取根癌農(nóng)桿菌陽性轉(zhuǎn)化子，接種到含抗生素的 LB培養(yǎng)基中，28°C 200rpm震蕩培養(yǎng)12-20h，優(yōu)選為18h，離心，收集菌體；(b)用頂培養(yǎng)基 重懸菌體，離心，收集菌體；（c)用頂培養(yǎng)基重懸菌體，將菌體濃度0D_調(diào)至0. 1?0. 6,優(yōu) 選為0. 15?0. 3,28°C 200rpm振蕩培養(yǎng)3-8h，優(yōu)選為6h，即得。
[0013] 其中，所述IM培養(yǎng)基中含有乙酰丁香酮，優(yōu)選的，所述乙酰丁香酮的濃度為 200mmol/L〇
[0014] 本發(fā)明根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黑孢塊菌遺傳轉(zhuǎn)化方法中，步驟（3)將步驟（2)制備的 菌液與步驟（1)制備的黑孢塊菌孢子懸浮液等體積混合；所述共培養(yǎng)的培養(yǎng)基為鋪有硝酸 纖維素薄膜的CM培養(yǎng)基；共培養(yǎng)條件為28°C避光培養(yǎng)24-60h，優(yōu)選為48h。
[0015] 其中，所述CM培養(yǎng)基為添加2 % (w/v)瓊脂糖的頂培養(yǎng)基，含有終濃度為 200mmol/L的乙酰丁香酮。
[0016] 步驟（4)所述選擇性培養(yǎng)是將步驟（3)共培養(yǎng)后的硝酸纖維素薄膜揭下，正向鋪 到含抗生素的PDA培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)至出現(xiàn)可見的單菌落。進(jìn)一步將單菌落挑取至新的選 擇性培養(yǎng)基上，分離有抗生素抗性的黑孢塊菌菌株。
[0017] 本發(fā)明所述抗生素選自頭孢霉素、潮霉素或卡那霉素。
[0018] 本發(fā)明根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黑孢塊菌遺傳轉(zhuǎn)化方法，利用VBC培養(yǎng)基促進(jìn)黑孢塊菌 大量產(chǎn)孢，隨后將含有雙元載體的根癌農(nóng)桿菌與黑孢塊菌孢子混合后共培養(yǎng)，通過抗性篩 選，獲得轉(zhuǎn)化子。該方法的轉(zhuǎn)化效率可達(dá)1-6X10 5個(gè)孢子，轉(zhuǎn)化效率高且穩(wěn)定，克服了黑孢 塊菌多細(xì)胞菌絲體難以快速制備大量單細(xì)胞原生質(zhì)體等原因?qū)е碌暮阪邏K菌遺傳轉(zhuǎn)化困 難的問題。
[0019] 本發(fā)明成功的將PCAMBIA1302-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化了黑孢塊菌，篩選到一系列整合潮霉素 抗性基因的突變體。PCR鑒定結(jié)果表明，所有供試轉(zhuǎn)化子均能擴(kuò)增出預(yù)期大小的片段，說明 黑孢塊菌轉(zhuǎn)化子含有插入的T-DNA片段。進(jìn)一步將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，Blast分 析表明，擴(kuò)增片段與潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的一致性達(dá)到100%，進(jìn)一步說明T-DNA已經(jīng)成 功的轉(zhuǎn)入黑孢塊菌基因組，且可以穩(wěn)定的遺傳。本發(fā)明以1〇 6孢子為出發(fā)材料，通過根癌農(nóng) 桿菌介導(dǎo)分別篩選到28、45和62個(gè)陽性轉(zhuǎn)化子，陽性轉(zhuǎn)化效率達(dá)到4. 53± 1. 75個(gè)/105個(gè) 孢子。
[0020] 本發(fā)明還成功的將外源綠色熒光蛋白編碼基因引入黑孢塊菌，經(jīng)表達(dá)以后，受體 細(xì)胞在激發(fā)光下表現(xiàn)出特異的綠色，可以用于發(fā)酵過程中細(xì)胞活性檢測(cè)、形態(tài)分析，同時(shí)也 是研宄黑孢塊菌與寄主植物相互作用關(guān)系的重要工具。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果從細(xì)胞水平進(jìn)一步證實(shí) 本發(fā)明構(gòu)建的黑孢塊菌遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的有效性，同時(shí)也為黑孢塊菌生物學(xué)研宄提供了一種 重要工具。
[0021] 本發(fā)明技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果：
[0022] (1)本發(fā)明方法與基于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法相比更為簡(jiǎn)單，同時(shí)該方法適用于其它 產(chǎn)孢較少的絲狀真菌。
[0023] (2)本發(fā)明方法利用VBC培養(yǎng)基一次可以大量制備黑孢塊菌的孢子，滿足構(gòu)建突 變體文庫等遺傳操作的需要。
[0024] (3)本發(fā)明以黑孢塊菌的孢子為受體，以根癌農(nóng)桿菌為介體，具有轉(zhuǎn)化效率高、轉(zhuǎn) 化子為單拷貝的頻率高等優(yōu)點(diǎn)，適用于黑孢塊菌T-DNA隨機(jī)插入突變體文庫的構(gòu)建、功能 基因的沉默或敲除等。這是國(guó)內(nèi)外首次報(bào)道黑孢塊菌的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。
[0025] 本發(fā)明所涉及到的術(shù)語宙義
[0026] 除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員通常所了解相同的含義。
[0027] 術(shù)語"遺傳轉(zhuǎn)化"意指通過某種途徑或技術(shù)將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞的基因組中， 并使之在受體細(xì)胞中得以表達(dá)。
[0028] 術(shù)語"轉(zhuǎn)化子"意指導(dǎo)入外源DNA從而獲得新的遺傳性狀的受體菌單菌落。
[0029] 術(shù)語"抗生素"意指由微生物（包括細(xì)菌、真菌、放線菌屬）或高等動(dòng)植物在生活 過程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或其它活性的一類次級(jí)代謝產(chǎn)物，能干擾其他生活細(xì)胞發(fā)育 功能的化學(xué)物質(zhì)；包括0 _內(nèi)酰胺類（如頭孢菌素類）、氨基糖苷類（如卡那霉素）、酰胺醇 類（如氯霉素）等幾千種。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0030] 圖1為黑孢塊菌在產(chǎn)孢培養(yǎng)基VBC的生長(zhǎng)情況及孢子形態(tài)觀察；其中，A :黑孢塊 菌在產(chǎn)孢培養(yǎng)基VBC的生長(zhǎng)情況；B :孢子形態(tài)觀察；
[0031] 圖2為質(zhì)粒pCAMBIA1302-l的圖譜；
[0032] 圖3為部分黑孢塊菌轉(zhuǎn)化子菌落形態(tài)；其中，A :未轉(zhuǎn)化的黑孢塊菌菌株；B :部分 黑孢塊菌轉(zhuǎn)化子菌落；
[0033] 圖4為隨機(jī)挑選的黑孢塊菌轉(zhuǎn)化子潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（hph)的PCR擴(kuò)增的電 泳圖譜；其中，1-10 :黑孢塊菌轉(zhuǎn)化子；positive control :以PCAMBIA1302質(zhì)粒作為模板的 PCR擴(kuò)增結(jié)果；Negative control (wild type):以野生型黑孢塊菌基因組作為模板擴(kuò)增結(jié) 果；Negative control (without template) :PCR 反應(yīng)體系中不添加模板；
[0034] 圖5為質(zhì)粒pCAMBIA1302的圖譜；
[0035] 圖6為黑孢塊菌野生菌株及轉(zhuǎn)化子熒光檢測(cè)結(jié)果；其中，A :黑孢塊菌野生菌株；B : 黑孢塊菌轉(zhuǎn)化子。

【具體實(shí)施方式】
[0036] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是范例性的，不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng) 域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié) 和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0037] 1、實(shí)驗(yàn)材料
[0038] 黑孢塊菌（四川省綿陽市食用菌研宄所）；
[0039] 根癌農(nóng)桿菌EHA105 (硫酸卡那霉素敏感型）（由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)武俊副教授惠贈(zèng)）；
[0040] PCAMBIA1302-1質(zhì)粒（本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，利用Spel與Xbal雙酶切 PCAMBIA1302后，通過粘性末端自連構(gòu)建pCAMBIA1302-l質(zhì)粒，lacZa和啟動(dòng)子區(qū)被刪 除）；
[0041] pCAMBIA1302 質(zhì)粒(The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vector for plant transformation.Plant Molecular Biology. 25(6)，989-994(1994))。
[0042] 實(shí)施例1黑孢塊菌突變體文庫的構(gòu)建
[0043] 1、實(shí)驗(yàn)方法
[0044] 1. 1黑孢塊菌孢子的制備
[0045] (1)將黑孢塊菌菌絲體接種于PDA培養(yǎng)基上，于28°C培養(yǎng)活化3d。PDA培養(yǎng)基： 200g去皮馬鈴薯，加適量蒸餾水煮制30min后加葡萄糖20g，MgS0 4 *7H20 1. 5g，KH2P043. 0g， VB150mg，瓊脂18g，補(bǔ)充蒸餾水定容至1000mL，pH自然，115°C，30min高溫滅菌。
[0046] (2)將活化后的黑孢塊菌菌落邊緣的菌絲體接種于VBC培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)7d后， 用5mL無菌水洗滌菌絲體，收集黑孢塊菌的孢子。
[0047] VBC 培養(yǎng)基：磷酸二氫鉀 1. 0g，硝酸鉀 1. 0g，蔗糖 0? 5g，VB1100mg，VC 100mg，瓊脂 20g，蒸餾水定容至1000mL，pH自然，115°C，30min高溫滅菌。
[0048] (3)將一滴孢子懸浮液置于血球計(jì)數(shù)板上，利用顯微鏡對(duì)孢子進(jìn)行計(jì)數(shù)，將孢子懸 浮液稀釋至1〇 6個(gè)/mL。
[0049] 1. 2根癌農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化及培養(yǎng)
[0050] 采用化學(xué)轉(zhuǎn)化法將PCAMBIA1302-1質(zhì)粒（圖1)轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌。
[0051] 1. 2. 1根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)制備
[0052] 將保存的根癌農(nóng)桿菌EHA105 (硫酸卡那霉素敏感型）在LB固體培養(yǎng)基上活化，轉(zhuǎn) 接三次后，接種到LB液體培養(yǎng)基中，28°C，200rpm，搖床振蕩培養(yǎng)至0D_= 0. 5,收集細(xì)胞， 利用預(yù)冷的〇. 1M CaCl2溶液制備根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞。
[0053] LB培養(yǎng)基成份：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，定容至1L。
[0054] 1. 2. 2pCAMBIA1302-l質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌
[0055] 將10yL pCAMBIA1302-l質(zhì)粒加入50yL根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴靜置 30min，然后置于液氮中速凍3min，立即37°C水浴熱擊5min ;再置于冰上2min，加入650 y L 28°C預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基，28°C，200rpm，搖床振蕩培養(yǎng)5h，4000r/min離心菌液5min，重懸 于100 y L液體LB培養(yǎng)基中，涂布在含有50 y g/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，篩選根癌 農(nóng)桿菌陽性轉(zhuǎn)化子。
[0056] 利用菌落PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化子，鑒定引物為：HPT-5 :GACGACACCGTCAGCGCGTC， HPT-3 :CITTGCCCTCGGACGAGTGCTGG。PCR 反應(yīng)體系為 50yL，包括 lOXBuffer 5yL， dNTP (20mmol .LiMuL，引物（25pmol ? y L 〇 各 2 y L，Mg2+ (25mmol *L 菌體 DNA (約 50ng ? y I71) 1 y L，Taq DNA 聚合酶（5U ? y I71) 0? 5 y L，加 H20 至 50 y L。反應(yīng)條件：94°C變 性 5min ;94°C 30sec，5(TC 30sec，72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 10min〇
[0057] 1. 2. 3根癌農(nóng)桿菌陽性轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)
[0058] 挑取活化的根癌農(nóng)桿菌EHA105 (攜帶pCAMBIA1302-l質(zhì)粒）單菌落接種到LB培 養(yǎng)基（含50yg/mL硫酸卡那霉素）中，28°C、200rpm震蕩培養(yǎng)18h后，5000rpm離心5min， 棄去上清，收集菌體。用IM培養(yǎng)基重懸菌體，5000rpm離心5min，棄去上清，收集菌體，再次 用IM培養(yǎng)基重懸菌體，通過頂培養(yǎng)基將菌體濃度0D 6(i(i調(diào)至0. 15?0. 3,28°C 200rpm搖床 振蕩培養(yǎng)6h。
[0059] 頂培養(yǎng)基成份：KH2P041. 45g，K2HP042. 05g，（NH4) 2S040. 5g，MgS04 ? 7H20 0? 5g，NaCl 0? 15g，CaCl20. 067g，F(xiàn)eS04 ? 7H20 0? 0025g，1M MES(pH 5. 5)40mL，20%葡萄糖（W/V) 10mL， 50%甘油（￥/￥)51^，微量元素51^，200111111〇1乙酰丁香酮仏5)11^，定容至11，1151：高壓滅菌 30min〇
[0060] 微量元素配制：稱取 ZnS04 ? 7H20、CuS04 ? 5H20、MnS04 ? 7H20、Na2Mo04 ? 7H20、H3B03 各0. Olg溶于lOOmL水中。
[0061] 200mmol乙酰丁香酮配制：稱取0. 039g溶于lmL無水乙醇中。
[0062] 20 %葡萄糖：稱取20g葡萄糖，無菌水定容至100mL。
[0063] 50%甘油：50mL甘油溶于50mL的無菌水中。
[0064] 1. 3根癌農(nóng)桿菌與黑孢塊菌孢子共培養(yǎng)及選擇性培養(yǎng)
[0065] 將上述制備好的EHA105 (攜帶pCAMBIA1302-l質(zhì)粒）菌液和黑孢塊菌孢子懸浮液 等體積渦旋混勻，吸取200 y r混合液均勻涂布在鋪有硝酸纖維素薄膜的CM培養(yǎng)基上，CM培 養(yǎng)基在使用前加入AS至終濃度為200mM/L。將培養(yǎng)皿在超凈工作臺(tái)中吹至半干，28 °C避光 培養(yǎng)48h。將硝酸纖維素薄膜從共培養(yǎng)基上揭下，正向鋪到PDA培養(yǎng)基（含200 y g/mL頭孢 霉素、250 y g/mL潮霉素B)上，28 °C培養(yǎng)，直至在PDA培養(yǎng)基上出現(xiàn)可見的單菌落。
[0066] CM培養(yǎng)基為添加2 % (w/v)瓊脂糖的頂培養(yǎng)基。
[0067] 1. 4黑孢塊菌轉(zhuǎn)化子的篩選及鑒定
[0068] 1. 4. 1黑孢塊菌轉(zhuǎn)化子的篩選
[0069] 將PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的單菌落挑取至新的選擇性培養(yǎng)基上，分離有潮霉素抗性的 黑孢塊菌菌株，將抗性菌株繼續(xù)在含50 y g/mL潮霉素B培養(yǎng)基上培養(yǎng)三代至生長(zhǎng)穩(wěn)定。
[0070] 1. 4. 2黑孢塊菌轉(zhuǎn)化子的鑒定
[0071] 將潮霉素抗性菌株接種到含有50 y g/mL潮霉素B、200 y g/mL頭孢霉素的PDA液 體培養(yǎng)基中，28°C，200rpm培養(yǎng)72h，13000rpm離心5min，棄上清，收集菌體，提取轉(zhuǎn)化子基 因組。基因組提取采用真菌基因組提取試劑盒（商品編號(hào)D3390-01，0MEGA生物技術(shù)公司）。
[0072] PCR鑒定采用靶向潮霉素抗性基因的特異引物（HPT-F2 :GACGACACCGTCAGTGCGTC， HPT-3 :CITTGCCCTCGGACGAGTGCTGG)。PCR 反應(yīng)體系為 50 y L，包括 lOXBuffer 5 y L， dNTP (20mmol .LiMuL，引物（25pmol ? y L 丨）各 2 y L，Mg2+ (25mmol *L 菌體 DNA (約 50ng ? y I71) 1 y L，Taq DNA 聚合酶（5U ? y I71) 0? 5 y L，加 H20 至 50 y L。反應(yīng)條件：94°C變 性 5min ;94°C 30sec，50°C 30sec，72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 10min。PCR 產(chǎn)物按照常 規(guī)方法用1 %瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)成像觀察并記錄電泳結(jié)果。
[0073] 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，Blast分析擴(kuò)增片段與潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的 一致性。
[0074] 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0075] 2. 1黑孢塊菌在產(chǎn)孢培養(yǎng)基VBC的生長(zhǎng)情況及孢子形態(tài)觀察
[0076] 黑孢塊菌在產(chǎn)孢培養(yǎng)基VBC的生長(zhǎng)情況及孢子形態(tài)觀察見圖2。
[0077] 2. 2黑孢塊菌轉(zhuǎn)化子的篩選
[0078] 部分黑孢塊菌轉(zhuǎn)化子菌落形態(tài)見圖3。
[0079] 2. 3黑孢塊菌轉(zhuǎn)化子的鑒定
[0080] PCR鑒定結(jié)果（圖4)表明，供試轉(zhuǎn)化子及質(zhì)粒pCAMBIA1302-l均能擴(kuò)增出預(yù)期大 小的片段，而未經(jīng)轉(zhuǎn)化的野生型菌株及無菌水對(duì)照則擴(kuò)增不到相應(yīng)大小的片段，說明黑孢 塊菌轉(zhuǎn)化子含有插入的T-DNA片段。
[0081] 為了進(jìn)一步證實(shí)PCR擴(kuò)增結(jié)果的可靠性，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，其核苷酸 序列為SEQ ID NO. 1所示。Blast分析表明，該片段與潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的一致性達(dá)到 100%，進(jìn)一步說明T-DNA已經(jīng)成功的轉(zhuǎn)入黑孢塊菌基因組，且可以穩(wěn)定的遺傳。
[0082] 本發(fā)明以106孢子為出發(fā)材料，通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)分別篩選到28、45和62個(gè)陽 性轉(zhuǎn)化子，陽性轉(zhuǎn)化效率達(dá)到4. 53 ± 1. 75個(gè)/105個(gè)孢子。
[0083] 實(shí)施例2黑孢塊菌的基因標(biāo)記
[0084] 1、實(shí)驗(yàn)方法
[0085] 1. 1黑孢塊菌孢子的制備
[0086] 具體方法同實(shí)施例1。
[0087] 1. 2根癌農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化及培養(yǎng)
[0088] 具體方法同實(shí)施例1，所用質(zhì)粒為pCAMBIA1302(圖5)。
[0089] 1. 3根癌農(nóng)桿菌與黑孢塊菌孢子共培養(yǎng)及選擇性培養(yǎng)
[0090] 具體方法同實(shí)施例1。
[0091] 1. 4黑孢塊菌轉(zhuǎn)化子的篩選及鑒定
[0092] 1. 4. 1黑孢塊菌轉(zhuǎn)化子的篩選
[0093] 將PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的單菌落挑取至新的選擇性培養(yǎng)基上，分離有潮霉素抗性的 黑孢塊菌菌株，將抗性菌株繼續(xù)在含50 y g/mL潮霉素B培養(yǎng)基上培養(yǎng)三代至生長(zhǎng)穩(wěn)定。
[0094] 1. 4. 2黑孢塊菌轉(zhuǎn)化子熒光強(qiáng)度檢測(cè)
[0095] 挑取陽性轉(zhuǎn)化子的菌絲體置于載玻片上，置于倒置熒光顯微鏡（IX-51，日本奧林 巴斯公司生產(chǎn)）下進(jìn)行熒光檢測(cè)。
[0096] 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0097] 挑取陽性轉(zhuǎn)化子的菌絲體置于載玻片上，置于倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行熒光檢測(cè)， 采用藍(lán)光激發(fā)光，能夠觀察到陽性轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生明顯熒光，而野生菌株不產(chǎn)生熒光（圖6)。
[0098] 本實(shí)驗(yàn)主要將外源綠色熒光蛋白編碼基因引入黑孢塊菌，經(jīng)表達(dá)以后，受體細(xì)胞 在激發(fā)光下表現(xiàn)出特異的綠色，可以用于發(fā)酵過程中細(xì)胞活性檢測(cè)、形態(tài)分析，同時(shí)也是研 宄黑孢塊菌與寄主植物相互作用關(guān)系的重要工具。
[0099] 該實(shí)驗(yàn)結(jié)果從細(xì)胞水平進(jìn)一步證實(shí)本發(fā)明構(gòu)建的黑孢塊菌遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的有效 性，同時(shí)也為黑孢塊菌生物學(xué)研宄提供了一種重要工具。
【權(quán)利要求】
1. 一種根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黑孢塊菌（Tuber melanosporum)遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在 于，包括以下步驟： (1)制備黑孢塊菌孢子懸浮液；(2)將攜帶有目的基因的雙元載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿 菌，獲得根癌農(nóng)桿菌陽性轉(zhuǎn)化子，制備菌液；（3)將步驟（2)制備的菌液與步驟（1)制備的 黑孢塊菌孢子懸浮液混合，共培養(yǎng)；(4)選擇性培養(yǎng)，篩選黑孢塊菌轉(zhuǎn)化子，鑒定，即得。
2. 按照權(quán)利要求1所述的遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于：步驟（1)所述黑孢塊菌孢子懸 浮液中孢子濃度為104-108個(gè)/mL，優(yōu)選為10 6個(gè)/mL。
3. 按照權(quán)利要求1或2所述的遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，步驟（1)所述制備黑孢塊菌 孢子懸浮液，包括：（a)將黑孢塊菌菌絲體接種于PDA培養(yǎng)基，于28°C培養(yǎng)活化；優(yōu)選的，活 化3d ; (b)將活化后的黑孢塊菌菌絲體接種于VBC培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)4-9d，優(yōu)選為7d ;用無 菌水洗滌菌絲體，收集黑孢塊菌的孢子，稀釋，即得。
4. 按照權(quán)利要求1所述的遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，步驟（2)所述制備菌液包括： (a)挑取根癌農(nóng)桿菌陽性轉(zhuǎn)化子，接種到含抗生素的LB培養(yǎng)基中，28°C 200rpm震蕩培養(yǎng) 12-20h，離心，收集菌體；(b)用頂培養(yǎng)基重懸菌體，離心，收集菌體；（c)用頂培養(yǎng)基重懸 菌體，將菌體濃度〇D6(i(i調(diào)至0. 1?0. 6,28°C 200rpm振蕩培養(yǎng)3-8h，即得。
5. 按照權(quán)利要求4所述的遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，步驟（2)所述制備菌液包括： (a)挑取根癌農(nóng)桿菌陽性轉(zhuǎn)化子，接種到含抗生素的LB培養(yǎng)基中，28°C 200rpm震蕩培養(yǎng) 18h，離心，收集菌體；(b)用頂培養(yǎng)基重懸菌體，離心，收集菌體；（c)用頂培養(yǎng)基重懸菌 體，將菌體濃度〇D6(l(l調(diào)至0. 15?0. 3,28°C 200rpm振蕩培養(yǎng)6h，即得。
6. 按照權(quán)利要求1所述的遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于：步驟（3)將步驟（2)制備的菌 液與步驟（1)制備的黑孢塊菌孢子懸浮液等體積混合；所述共培養(yǎng)的培養(yǎng)基為鋪有硝酸纖 維素薄膜的CM培養(yǎng)基；共培養(yǎng)條件為28°C避光培養(yǎng)24-60h，優(yōu)選為48h。
7. 按照權(quán)利要求4、5或6所述的遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于：所述IM培養(yǎng)基或共培養(yǎng) 的培養(yǎng)基中含有乙酰丁香酮；優(yōu)選的，所述乙酰丁香酮的濃度為200mmol/L。
8. 按照權(quán)利要求1所述的遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于：步驟（4)所述選擇性培養(yǎng)是將 步驟（3)共培養(yǎng)后的硝酸纖維素薄膜揭下，正向鋪到含抗生素的PDA培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)至出 現(xiàn)可見的單菌落。
9. 按照權(quán)利要求4、5或8所述的遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于：所述抗生素選自頭孢霉 素、潮霉素或卡那霉素。
【文檔編號(hào)】C12N15/80GK104450767SQ201410788066
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年12月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月17日
【發(fā)明者】湯亞杰, 賈開志, 徐陽華, 張權(quán) 申請(qǐng)人:湖北工業(yè)大學(xué)