一種提高馬齒莧多糖的方法及該方法制備的發(fā)酵液的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提高馬齒莧多糖含量的方法，它包括如下步驟：(1)取馬齒莧干粉，添加5～20倍重量的水，混勻，再加入硝酸銨和硫酸鋅至終濃度分別為2％和0.5％，滅菌；(2)按照2～10％的接種量接種枯草芽孢桿菌菌液，于100～250r/min、37℃下發(fā)酵培養(yǎng)2～6天，離心，過濾，得濾液，即可。本發(fā)明還提供了前述方法制備的發(fā)酵液。本發(fā)明方法制備的馬齒莧發(fā)酵液中馬齒莧多糖含量高，可制成各種制劑，臨床應(yīng)用前景優(yōu)良。
【專利說明】一種提高馬齒莧多糖的方法及該方法制備的發(fā)酵液

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種發(fā)酵馬齒莧提高多糖含量的方法及該方法制備的發(fā)酵液。

【背景技術(shù)】
[0002]馬齒莧屬馬齒莧科的一年生肉質(zhì)草本植物，又名長命菜、五行草、瓜子菜等，除高寒地區(qū)外世界各地均有分布。我國的馬齒莧資源十分豐富，對馬齒莧的利用有著悠久的歷史，在南北朝時(shí)期對其功能就有記載。在我國現(xiàn)行的國家法定標(biāo)準(zhǔn)中，馬齒莧收載于《中國獸藥典》二部，具有清熱解毒，涼血止痢的功效。現(xiàn)代藥理研究表明馬齒莧具有抗衰老、治療糖尿病、降血脂、預(yù)防冠心病、預(yù)防高血壓、預(yù)防肥胖癥、抑制腫瘤細(xì)胞生長及提高機(jī)體免疫能力的功能。馬齒莧含有豐富的多糖，在9月初含量最高，可達(dá)11.6%，主要由阿拉伯糖、木糖、果糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖等組成。研究表明，馬齒莧多糖是馬齒莧的主要功能成分之一。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明提供了一種提高馬齒莧多糖含量的發(fā)酵方法以及該方法制得的發(fā)酵液。
[0004]一種發(fā)酵馬齒莧的方法，它包括如下步驟:
[0005](1)取馬齒莧干粉，添加5?20倍重量的水，混勻，再加入硝酸銨和硫酸鋅至終濃度分別為2%和0.5%，滅菌；
[0006](2)按照2?10%的接種量接種枯草芽孢桿菌菌液，于100?250r/min、37°C下發(fā)酵培養(yǎng)2?6天，離心，過濾，得濾液，即可。
[0007]步驟(1)中，馬齒莧干粉的粒徑不大于60目。
[0008]步驟(1)中，所述水的添加量是馬齒莧干粉重量的10倍。
[0009]步驟⑴中，裝量為30%。裝量，是指將水添加到發(fā)酵容器中時(shí)，水體積與容器體積的比值。
[0010]步驟(2)中，所述接種量為8%。
[0011]步驟(2)中，所述轉(zhuǎn)速為200r/min。
[0012]步驟⑵中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的時(shí)間是4天。
[0013]步驟(2)中，發(fā)酵時(shí)，裝量為30%。
[0014]步驟⑵中，所述枯草芽孢桿菌菌液中，枯草芽孢桿菌的濃度為lX107-lX109cfu/mlo
[0015]所述枯草芽孢桿菌菌液按照如下方法制備:取枯草芽孢桿菌，接種到液體肉湯培養(yǎng)基中，于150r/min、37°C下培養(yǎng)24h，即得。
[0016]本發(fā)明還提供了前述發(fā)酵提取方法制得的提取液。其中的馬齒莧多糖含量以原生藥計(jì)為21.46%。將該發(fā)酵液離心，過濾，得濾液，濾液制成各種口服制劑，包括為散劑、片劑、丸劑、膠囊劑、微囊劑、顆粒劑、餅劑或液體藥劑。
[0017]綜上，本發(fā)明方法可以提高馬齒莧多糖的含量，制得的發(fā)酵液馬齒莧多糖含量高，臨床應(yīng)用前景優(yōu)良。
[0018]下面通過【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，但是并不是對本發(fā)明的限制，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1裝量優(yōu)選結(jié)果；
[0020]圖2料水比優(yōu)選結(jié)果；
[0021]圖3轉(zhuǎn)速優(yōu)選結(jié)果；
[0022]圖4發(fā)酵時(shí)間優(yōu)選結(jié)果；
[0023]圖5接種量優(yōu)選結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0024]枯草芽孢桿菌粉，購自購自中國普通微生物菌種保藏管理中心，編號1.1661。
[0025]液體肉湯培養(yǎng)基，每升包含如下成分:蛋白胨1g牛肉膏3g氯化鈉5g蒸餾水100mL, ρΗ7.4。
[0026]實(shí)施例1本發(fā)明發(fā)酵方法
[0027]一、實(shí)驗(yàn)方法
[0028]I 材料
[0029]枯早牙抱桿囷，購自購自中國普通微生物囷種保減中心，編號1.1661 ；
[0030]馬齒莧，60°C烘干，粉碎，過60目篩。
[0031]2實(shí)驗(yàn)方法
[0032]2.1菌種活化
[0033]在無菌條件下，將購回的菌粉按說明書比例，用事先滅菌的蒸餾水充分溶解，接種菌溶液到瓊脂培養(yǎng)基上，置于電熱恒溫培養(yǎng)箱中于37°C下活化12h。
[0034]2.2種子液的制備
[0035]挑取菌落轉(zhuǎn)接到裝有10mL液體肉湯培養(yǎng)基的250mL三角瓶中上，蓋上封口膜，置于電熱恒溫振蕩培養(yǎng)箱中于150r/min，37°C下培養(yǎng)24 h，得菌液濃度為107_9cfu/ml的枯草芽孢桿菌菌液，備用。
[0036]2.3發(fā)酵條件
[0037]稱取7.5g的馬齒莧干粉于250ml三角瓶，加75ml蒸餾水，混勻，按質(zhì)量體積比加入硝酸氨2%，硫酸鋅0.5%，121°C高壓滅菌20 min，按照8%的接種量添加枯草芽孢桿菌種子液，37°C,200rpm搖床發(fā)酵4天，離心，過濾，得濾液，即可。
[0038]3、檢測
[0039]用苯酚硫酸法測定多糖含量，含量以每g原生藥計(jì)。
[0040]4、檢測結(jié)果
[0041]經(jīng)檢測，制備得到的發(fā)酵液馬齒莧多糖含量為21.46%。
[0042]也就是說，以馬齒莧為原料，采用本發(fā)明發(fā)酵方法發(fā)酵，每Ig馬齒莧可以制備得到0.2146g馬齒莧多糖，是馬齒莧所含天然多糖的1.85倍。
[0043]實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，本發(fā)明發(fā)酵方法可以有效提高馬齒莧多糖的含量。
[0044]實(shí)施例2本發(fā)明發(fā)酵提取方法的參數(shù)篩選
[0045]一、實(shí)驗(yàn)方法
[0046]1 材料
[0047]枯草芽孢桿菌，購自購自中國普通微生物菌種保藏中心，編號1.1661 ；
[0048]馬齒莧，60°C烘干，粉碎，過60目篩。
[0049]2實(shí)驗(yàn)方法
[0050]2.1菌種活化
[0051]在無菌條件下，將購回的菌粉按說明書比例，用事先滅菌的蒸餾水充分溶解，接種菌溶液到瓊脂培養(yǎng)基上，置于電熱恒溫培養(yǎng)箱中于37°C下活化12h。
[0052]2.2種子液的制備
[0053]挑取菌落轉(zhuǎn)接到裝有100mL肉湯液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中上，蓋上封口膜，置于電熱恒溫振蕩培養(yǎng)箱中于150r/min, 37°C下培養(yǎng)24 h,得菌液濃度為107_9cfu/ml的枯草芽孢桿菌菌液，備用。
[0054]2.3發(fā)酵條件
[0055]稱取馬齒莧干粉，加適量蒸餾水浸泡，按質(zhì)量體積比加入硝酸氨2 %，硫酸鋅0.5%，121°C高壓滅菌20 min，添加枯草芽孢桿菌種子液，37°C、200rpm搖床發(fā)酵。
[0056]2.3.1不同裝量對多糖含量的影響
[0057]取等量馬齒莧干粉于250ml三角瓶中，分別添加50ml、75ml、100ml、125ml、150ml不等的蒸餾水，滅菌。接種種子液于37°C溫度下?lián)u床培養(yǎng)數(shù)日。
[0058]2.3.2不同料水比對多糖含量的影響
[0059]分別以1:5,1:10, 1:15，1:20等料水比濃度30%裝量進(jìn)行發(fā)酵。
[0060]2.3.3不同轉(zhuǎn)速對多糖含量的影響
[0061]采用100，150, 200, 250 r/min 不同轉(zhuǎn)速發(fā)酵。
[0062]2.3.4不同發(fā)酵時(shí)間對多糖含量的影響
[0063]分別發(fā)酵2、3、4、5、6 d后測定溶液多糖含量。
[0064]2.3.5不同接種量對多糖含量的影響
[0065]將制備好的枯草芽胞桿菌種子液種按照4^6^8^10% (V/V)的接種量在無菌條件下添加然后發(fā)酵。
[0066]二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0067]2.3.1不同裝量對多糖含量的影響
[0068]如圖1所示，裝量為75ml時(shí)，明顯優(yōu)于其他比例，即本發(fā)明發(fā)酵方法，裝量優(yōu)選為75/250 = 30%。
[0069]2.3.2不同料水比對多糖含量的影響
[0070]如圖2所示，料水比1:10時(shí)，多糖含量最高，即本發(fā)明發(fā)酵方法的料水比優(yōu)選為1:10。
[0071]2.3.3不同轉(zhuǎn)速對多糖含量的影響
[0072]如圖3所示，轉(zhuǎn)速200r/min時(shí)多糖含量最高，即本發(fā)明發(fā)酵方法的轉(zhuǎn)速優(yōu)選為200r/mino
[0073]2.3.4不同發(fā)酵時(shí)間對多糖含量的影響
[0074]如圖4所示，結(jié)果隨發(fā)酵時(shí)間的增加，發(fā)酵后馬齒莧多糖的含量先增加后降低，之后趨于平穩(wěn)，且發(fā)酵時(shí)間在4 d時(shí)，馬齒莧發(fā)酵后多糖的含量較高，因此本發(fā)明發(fā)酵方法的發(fā)酵時(shí)間優(yōu)選為4 d。
[0075]2.3.5不同接種量對多糖含量的影響
[0076]如圖5所示，測定發(fā)酵后多糖的含量，結(jié)果在接菌量小于8%時(shí)隨著接種量的增力口，發(fā)酵后多糖的含量逐漸升高，當(dāng)接菌量高于8%后，發(fā)酵后多糖含量逐漸降低，說明接菌量為8%最佳，因此本發(fā)明發(fā)酵方法的接種量優(yōu)選為8%。
[0077]實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，本發(fā)明發(fā)酵方法中，裝量優(yōu)選為30% ;料水比優(yōu)選為1:10 ;轉(zhuǎn)速優(yōu)選為200r/min ;發(fā)酵時(shí)間優(yōu)選為4 d ;接種量優(yōu)選為8%。
[0078]綜上，本發(fā)明方法可以使馬齒莧多糖含量提高，制得的發(fā)酵液可以制成多種制劑，臨床應(yīng)用前景優(yōu)良。
【權(quán)利要求】
1.一種發(fā)酵馬齒莧提高多糖含量的方法，其特征在于:它包括如下步驟: (1)取馬齒莧干粉，添加5?20倍重量的水，混勻，再加入硝酸銨和硫酸鋅至終濃度分別為 2% (w/v)和 0.5% (w/v)，滅菌； (2)按照2?10%的接種量接種枯草芽孢桿菌菌液，于100?250r/min、37°C下發(fā)酵培養(yǎng)2?6天，離心，過濾，得濾液，即可。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(I)中，馬齒莧干粉的粒徑不大于60目。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(I)中，所述水的添加量是馬齒莧干粉重量的10倍；步驟(I)中，裝量為30%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(2)中，所述接種量為8%(v/v)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(2)中，所述枯草芽孢桿菌菌液中，枯草芽孢桿菌的濃度為I X 17-1 X 109cfu/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:所述枯草芽孢桿菌菌液按照如下方法制備:取枯草芽孢桿菌，接種到液體肉湯培養(yǎng)基中，于150r/min、37°C下培養(yǎng)24h，即得。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(2)中，所述轉(zhuǎn)速為200r/min。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(2)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的時(shí)間是4天。
9.權(quán)利要求1?8任意一項(xiàng)所述發(fā)酵方法制得的發(fā)酵液。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的發(fā)酵液，其特征在于:其馬齒莧多糖的含量以原生藥計(jì)為.21.46%。
【文檔編號】C12P19/04GK104404103SQ201410788002
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年12月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月17日
【發(fā)明者】李超, 楊海涵, 房春林 申請人:成都乾坤動(dòng)物藥業(yè)有限公司